Stx2 Mendorong Ekspresi Gen Berbeza Dan Mengganggu Gen Irama Sirkadian dalam Tubul Proksimal

Abstrak: Escherichia coli yang menghasilkan toksin Shiga(STEC) menyebabkan kecacatan tiub proksimal pada buah pinggang. Walau bagaimanapun, faktor yang diubah oleh toksin Shiga (Stx) dalam tubul proksimal masih belum ditunjukkan. Kami menentukan reseptor Stx Gb3 dalam murine dan buah pinggang manusia dan mengesahkan ekspresi reseptor dalam tubul proksimal. Stx2-menyuntik tisu buah pinggang tikus danStx2-merawat sel epitelium tiub proksimal renal primer manusia(RPTEC) telah dikumpulkan dan analisis microarray telah dilakukan. Kami membandingkan tatasusunan buah pinggang murine dan RPTEC dan memilih 58 gen biasa yang dinyatakan secara berbeza berbanding kawalan (0 h, tiada rawatan toksin). Kami mendapati bahawa gen yang paling dinyatakan ialah GDF15, yang mungkin terlibat dalam penurunan berat badan yang disebabkan oleh Stx2-. Gen yang dikaitkan dengan aktiviti Stx2 yang dilaporkan sebelum ini seperti src kinase Ya pengaktifan laluan fosforilasi terungkap tindak balas protein (UPR) dan tindak balas tegasan ribotoksik (RSR) menunjukkan ekspresi berbeza. Selain itu, gen jam sirkadian dinyatakan secara berbeza, mencadangkan Stx2-gangguan irama sirkadian buah pinggang. Pengangkut glukosa SGLT1 (SLC5A1) tiub proksimal terkawal irama sirkadian, menunjukkan kemerosotan fungsi tiub proksimal dan tikus mengembangkan glukosuria yang mengesahkan disfungsi tiub proksimal. Stx2 mengubah ekspresi gen dalam murine dan tubul proksimal manusia melalui aktiviti yang diketahui dan gangguan irama sirkadian yang baru disiasat, yang boleh mengakibatkan disfungsi tiub proksimal.

Kata kunci:Toksin Shiga jenis 2 (Stx2);tubul proksimal buah pinggang; tetikus; sel epitelium tiub proksimal buah pinggang manusia (RPTEC); susunan mikro; irama sirkadian

Sumbangan Utama:Gen yang dinyatakan secara berbeza daripada buah pinggang tetikus2-yang dirawat Stx dan sel tiub proksimal utama manusia telah dianalisis. Selain daripada gen yang terjejas oleh Stx2-sebelum ini, gen yang berkaitan dengan irama sirkadian ditunjukkan untuk mengubah ekspresinya dan mempunyai pengaruh dalam fungsi tiub proksimal.

1. Pengenalan

Escherichia coli yang menghasilkan toksin ShigaJangkitan STEC menyebabkan gejala teruk sindrom uremik hemolitik (HUS), yang ditakrifkan oleh triad kegagalan buah pinggang akut, trombositopenia, dan anemia hemolitik [1]. Toksin Shiga (Stxs) dianggap memainkan peranan utama dalam merosakkan sel dalam penyakit berjangkit ini. Ciri histopatologi buah pinggang HUS termasuk kerosakan glomerular dan tiub seperti pemendapan fibrin kapilari dalam glomeruli dan nekrosis tiub, masing-masing [1,2]. Kejadian disfungsi awal dalam tubulus proksimal pesakit yang dijangkiti STEC telah dilaporkan dengan menganalisis air kencing. Penanda kencing berfungsi tiub proksimalN-asetil glukosaminidase(NAG) dan 2 mikroglobulin (2MG) daripada air kencing peringkat akut STEC O157- atau O{3}}pesakit HUS yang berkaitan diukur dengan peningkatan yang tinggi, mencadangkan disfungsi tiub proksimal awal [3].

Stxs, termasuk Stx2, terdiri daripada subunit A tunggal dan lima subunit B (toksin A1B5), di mana subunit A mempunyai aktiviti enzimatik menyahpurnasi adenine 4324 daripada 28S rRNA subunit ribosom 60S, manakala subunit B diperlukan untuk mengikat sel perumah melalui globotriaosylceramide (Gb3). Terdapat beberapa pengaruh yang diketahui bahawa Stxs dikenakan pada sel. (I) Dengan mengikat reseptornya Gb3, toksin menimbulkan transduksi isyarat melalui kinase keluarga Src Ya [4,5]. Selepas mengikat kepada reseptor, Stxs masuk ke dalam sel melalui endositosis dan diangkut secara retrograde ke ER. Stxs melalui endosom dan radas Golgi di mana subunit A dibelah antara serpihan A1 dan C-terminal A2 oleh furin [6], walaupun serpihan A1 dan A2 masih disambungkan dengan ikatan disulfida. Toksin sampai ke ER dan ikatan disulfida mungkin berkurang; kemudian, serpihan A1 daripada holotoksin dikeluarkan [7,8]. Ini adalah apabila pengaruh oleh (II) tekanan ER berlaku dengan serpihan toksin yang meniru protein terungkap, yang mendorong tindak balas protein terungkap (UPR). Kedua-dua subunit A dan B mampu mengikat Bip, yang menunjukkan tekanan ER [9,10]. Serpihan A1 yang dibelah dipindahkan ke sitoplasma dan menyahkan adenin daripada 28S rRNA kepada (III) menghalang sintesis protein. Pengubahsuaian Stxs menyebabkan rRNA 28S mendorong (IV) tindak balas tegasan ribotoksik (RSR), yang mengaktifkan lata isyarat hiliran [11]. Pengaruh (II) dan/atau (IV) diketahui mendorong (V) transkripsi gen tertentu yang membawa kepada rembesan sitokin [12]. Juga, (II) dan (IV) terlibat dalam (VI) apoptosis yang disebabkan oleh Stxs [13-15].

Eksperimen in vitro menggunakan tubul proksimal manusia dan model tetikus in vivo sangat menghubungkan kerosakan tubular proksimal kepada Stxs. Kedua-dua kultur primer dan garisan sel tubulus proksimal manusia sangat terdedah kepada Stxs dan mempamerkan pembebasan sitokin dan kematian sel, termasuk apoptosis [16-20]. Sel epitelium tiub proksimal renal primer manusia (RPTECs) mengekspresikan reseptor Gb3, sangat mudah terdedah kepada toksin Shiga, dan telah digunakan dalam banyak artikel untuk menganalisis tindak balas biologi seperti perencatan sintesis protein, pengeluaran sitokin dan induksi apoptosis [17,20] . Tikus yang disuntik dengan toksin Shiga jenis 1 (Stx1) menunjukkan glukosuria, yang menunjukkan penurunan penyerapan semula glukosa oleh tubul proksimal [21]. Ini mencadangkan ketoksikan Stxs kepada tubul proksimal kedua-dua in vitro dan in vivo. Dalam model tetikus yang dijangkiti STEC, penemuan yang kerap dalam histopatologi adalah nekrosis sel epitelium tiub dan sel-sel terkelupas dalam lumen tubul proksimal [22-24]. Tikus yang disuntik Stx yang telah dimurnikan (sama ada Stx1 atau Stx2) juga menunjukkan pengelupasan tubul proksimal dengan nukleus yang agak utuh [25-27].

Walaupun kerosakan tubul proksimal yang dikaitkan dengan suntikan Stx atau jangkitan STEC telah diterangkan secara fungsional dan histologi, sasaran gen yang terlibat dalam lesi tubul proksimal masih belum ditunjukkan.

Di sini kami menganalisis ekspresi gen dalam Stx2-buah pinggang tikus yang disuntik dan Stx2-yang merawat kultur sel epitelium tiub proksimal renal primer manusia (RPTEC) untuk menunjukkan perubahan gen berkaitan tubul proksimal yang disebabkan oleh Stx2.

2. Keputusan

2.1. Stx2-Patologi Buah Pinggang Tikus

Untuk mengenal pasti Stx{{0}}patologi buah pinggang murine yang berkaitan, bahagian tisu buah pinggang daripada Stx2-tikus yang disuntik telah diwarnai dengan Periodic Acid-Schiff (PAS). Noda merah jambu kuat yang jelas pada bahagian luminal sel epitelium tiub menunjukkan glikokaliks sempadan berus, yang merupakan ciri sel tiub proksimal. Kami menentukan sel/nukleus di luar glycocalyx (dalam ruang luminal) sebagai terpisah daripada sel jiran dan membran bawah tanah (iaitu, sel terkelupas). Dalam Rajah 1B (8 jam selepas Stx2), C, dan D (48 jam selepas Stx2), sel-sel terkelupas dengan nukleus yang agak utuh ditunjukkan dengan anak panah. Kami juga melihat serpihan sel dalam lumen tiub proksimal (Rajah 1 anak panah). Selepas pentadbiran Stx2, lesi ini kelihatan agak jelas, manakala pada 0 jam (Rajah 1A, tanpa Stx2), mereka boleh diabaikan.

Rajah 1. Stx2 mendorong pengelupasan sel-sel tiub proksimal dalam buah pinggang murine. Noda asid berkala Schiff (PAS) daripada Stx2-bahagian buah pinggang murine yang disuntik ditunjukkan. (A) 0 h (naif), (B) 8 jam dan (C) 48 jam selepas suntikan Stx2. Anak panah menunjukkan sel tubular proksimal mengelupas. Anak panah menunjukkan serpihan sel. Medan yang diperbesarkan dalam (C) ditunjukkan dalam (D) dengan sel-sel yang mengendur dihalakan dengan anak panah. Bar dalam (A–C) menunjukkan 50 µm. Bar skala dalam (D) menunjukkan 10 µ

2.2. Ekspresi Gb3 dalam Tetikus dan Buah Pinggang Manusia

2.2.1. Ekspresi Gb3 Korteks Renal Tetikus

Memandangkan sel tiub proksimal menunjukkan kerosakan histologi daripada penghinaan Stx2, kami menguji ekspresi reseptor Stx2 globotriaosylceramide (Gb3) dalam korteks buah pinggang murine bersama-sama dengan aquaporin penanda tiub proksimal-1 (AQP1). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, sel AQP1-positif mempamerkan kepositifan Gb3 kebanyakannya pada bahagian luminal sel (sel ditanda dengan kepala anak panah tertutup, manakala lumina ditandakan dengan asterisk). Kami juga memerhatikan bahawa kotoran Gb3 tiub negatif AQP1 mungkin mengumpul sel saluran (Rajah 2 kepala anak panah terbuka) seperti yang dilaporkan [28]. Keamatan pewarnaan Gb3 adalah lebih kuat dalam sel AQP1 (-), bagaimanapun, bilangan tubul jenis ini adalah lebih kecil berbanding dengan tubul proksimal dua positif Gb3/AQP1 dalam korteks. CD{17}}sel endothelial positif ialah Gb3 negatif dalam buah pinggang tetikus. Kawalan antibodi yang dipadankan dengan isotype untuk Gb3 (tikus IgM) digunakan sebagai kawalan negatif. IgM tikus tidak bertindak balas dengan tisu buah pinggang tikus (Rajah S1)

2.2.2. Ekspresi Gb3 Korteks Ginjal Manusia

Dalam tisu buah pinggang manusia, Gb3 juga positif dalam AQP1-tubul proksimal positif (Rajah 3, anak panah tertutup). Penyetempatan Gb3 dalam sel tubular proksimal adalah lebih kuat pada bahagian luminal. Kami juga memerhatikan sel AQP1 (-) Gb3 (+) (Rajah 3, anak panah terbuka) seperti yang kami lakukan dalam tisu murine. Sel endothelial manusia mengekspresikan Gb3 (CD31/Gb3 positif berganda, Rajah 3, asterisk). Bahagian kawalan isotype dengan IgM tikus tidak menunjukkan tindak balas positif dalam tisu buah pinggang manusia (Rajah S2).

2.3. Analisis Mikroarray

Oleh kerana kedua-dua tetikus dan sel epitelium tiub proksimal manusia adalah Gb3 positif, ia menunjukkan bahawa jenis sel ini dipengaruhi secara langsung oleh Stx2. Untuk menentukan gen Stx2-yang terjejas dalam kedua-dua murine dan sel tubular proksimal manusia, kami mengekstrak jumlah RNA daripada buah pinggang Stx2-tikus yang disuntik dan Stx2-rawatan RPTEC utama manusia dan dianalisis ekspresi gen oleh microarray

2.3.1. Gen yang Diekspresikan Secara Berbeza dalam Kedua-dua Buah Pinggang Tikus dan RPTEC

Gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG), yang biasa kepada kedua-dua buah pinggang tikus dan RPTEC telah dipilih. Asas memilih DEG biasa ialah (1) gen dengan log2-perubahan kali ganda (terhadap 0 h) lebih daripada 1 atau kurang daripada -1 dalam kedua-dua buah pinggang tetikus dan mikroarray RPTEC sekurang-kurangnya dalam satu- titik masa dan (2) taburan log2-perubahan lipatan gen sesuai dengan lengkung padu dan bukannya lengkung kuadratik untuk menampung puncak ekspresi gen dengan lebih baik pada pertengahan laluan masa dalam susunan mikro buah pinggang. Dengan dua kriteria di atas, kami memilih 58 gen biasa antara buah pinggang tetikus2-yang dirawat Stx dan RPTEC manusia (Rajah 4A). Corak ekspresi 58 gen ini dalam buah pinggang tetikus ditunjukkan dalam peta haba (Rajah 4B). Kebanyakan gen telah dikawal selia pada waktu kemudian selepas suntikan Stx2; bagaimanapun, sesetengah gen mempunyai corak ekspresi yang lebih awal. Gen yang mempunyai lebih daripada 1 dalam log{15}}perubahan kali ganda telah disenaraikan untuk setiap titik masa (Jadual 1).

Rajah 4. Analisis Microarray. (A) Antara gen yang dianalisis oleh microarray, 147 gen (dibulatkan hijau) dan 4013 gen (dibulatkan merah) daripada Stx2-buah pinggang tikus yang dirawat dan RPTEC, masing-masing, dikesan mempunyai log{ {4}}perubahan kali ganda kurang daripada −1 atau lebih daripada 1. Gen yang diubah oleh rawatan Stx2 terhadap 0 h dalam kedua-dua susunan mikro (gen yang dinyatakan secara berbeza biasa/DEG) berjumlah 58 (kawasan bertindih merah dan hijau). (B) Peta haba bagi 58 gen biasa ditunjukkan dalam garis masa pensampelan buah pinggang tetikus. Z sama dengan 0 menandakan purata log2-nilai perubahan kali ganda bagi gen dan mencerminkan aliran ekspresi gen. Oleh itu, warna kehijauan mewakili nilai yang lebih rendah daripada purata gen tertentu dalam satu baris, manakala warna kemerahan mewakili perubahan di atas purata. Log2-data lipatan 58 gen daripada set data 72 jam yang disuntik PBS berbanding 0 jam dibentangkan sebagai Jadual S3 untuk rujukan. (C) Graf bar pengayaan Metascape GO ditunjukkan. Paksi-X menunjukkan −log10 nilai p istilah GO diperkaya merentas 58 DEG biasa bahawa bilangan yang lebih tinggi bagi istilah GO diperkaya lebih berkemungkinan berkaitan dengan sistem. 20 istilah GO diperkaya teratas ditunjukkan. (D) Analisis STRING bagi 58 DEG biasa ditunjukkan dalam enam kelompok yang paling berkaitan/berkaitan. Warna sfera menunjukkan gen yang tergolong dalam kelompok yang sama. Hubungan tindakan antara gen ditunjukkan dalam cara berkod warna dan bentuk akhir. ENSG00000279576 kini telah dikodkan sebagai ENSP00000485396, yang menandakan ID manusia gen MALAT1.

Untuk menganalisis kefungsian DEG biasa, kami menggunakan platform Metascape. Ia memberikan istilah Ontologi Gen (GO), yang terdiri daripada fungsi molekul, komponen selular, dan proses biologi, kepada gen terpilih. Kami mendepositkan 58 DEG biasa ke Metascape dan memperoleh 20 istilah GO teratas di mana DEG ini tergolong (Rajah 4C). Istilah GO disenaraikan dengan gen yang sepadan dalam Jadual S1. Untuk melihat senarai gen dalam setiap istilah GO yang ditunjukkan dalam Rajah 4C, sila rujuk Jadual S2 Pengayaan Metascape. Istilah GO yang dikaitkan dengan kematian sel, keradangan, dan lata isyarat telah disenaraikan dalam 20 teratas seperti yang dijangkakan; bagaimanapun, irama sirkadian menarik perhatian sebagai istilah GO novel. Sambungan gen biasa yang diketahui ditunjukkan dengan analisis STRING (Rajah 4D). Dalam analisis ini, gen dikelompokkan dalam enam kumpulan berbeza yang diambil kira dengan persatuan yang kuat mengikat, pengaruh (pemangkinan, pengaktifan atau perencatan), serta ekspresi bersama gen.

2.3.2. Trend Ekspresi Gen

Jejak beberapa ekspresi gen ditunjukkan dalam graf dengan paksi-x untuk masa (h) selepas suntikan Stx2 dan paksi-y untuk log2-lipatan berubah terhadap 0 h (Rajah 5). Oleh itu, nilai paksi-y bersamaan dengan 1 bermakna 2-perubahan kali ganda lwn. 0 h.

Rajah 5. Gen yang dinyatakan secara berbeza dengan garis masa pensampelan tetikus. ( A ) Corak ekspresi mRNA PDK4 dan CEBPB ditunjukkan. (B) gen segera-awal. (C) Protein matriselular CYR61 (CCN1) dan ungkapan CTGF (CCN2). (D) Gen berkaitan UPR DDIT3 (CHOP, GADD153), rakan pengikat DDIT3 CEBPB, dan faktor maklum balas negatif PPP1R15A (GADD34) ditunjukkan. (E) Faktor transkripsi DDIT3 (CHOP, GADD153) dan ATF3 dan GDF15, yang dikawal secara transkripsi oleh faktor-faktor ini, ditunjukkan. (F) Gen yang berkaitan dengan UPR dan RSR ditunjukkan. (G) EDN1 berhubung dengan gen UPR diplot. (H) Puncak awal EDN1 dan EGR1 dan puncak PER1 berikut ditunjukkan dengan peningkatan beransur-ansur kemudian dalam ketiga-tiga gen. (I) Gen daripada gugusan ungu Rajah 4D ialah gen berkaitan irama sirkadian. (J) Gen teras sirkadian PER1, Arntl (BMAL1), Cry1, dan Jam ditunjukkan. ( K ) PER1 dan gen buah pinggang terkawal jam sirkadian ditunjukkan. (L) Gen radang dengan gen berkaitan laluan NF-kB ditunjukkan. Untuk melihat titik data log2 individu, sila rujuk Rajah Tambahan S4. Rajah S5, menunjukkan purata log2 dengan bar sisihan piawai, dibentangkan sebagai rujukan.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

DAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK JANGKITAN BUAH PINGGANG