Kajian Mengenai Kesan Terapeutik Dan Mekanisme Ekstrak Cistanche Deserticola Pada Sarcopenia Akibat Dexamethasone dalam Tikus

Abstrak:Kajian ini menerokakesan terapeutik ekstrak Cistanche deserticola (CdE)pada sarcopenia yang disebabkan oleh dexamethasone (Dex) pada tikus dan mekanisme tindakan yang mungkin. Pertama, komponen farmakodinamik dan sasaran penting Cistanche telah dikaji oleh farmakologi rangkaian, dan laluan telah diperkaya untuk meramalkan mekanisme tindakan CdE. Dalam eksperimen haiwan, 50 KM tikus dibahagikan secara rawak kepada 5 kumpulan (kumpulan kawalan, kumpulan model Dex, kumpulan dos CdEtinggi, kumpulan dos sederhana CdE, dan kumpulan dos rendah CdE). Kecuali untuk kumpulan kawalan, kumpulan lain disuntik secara subkutan untuk mendorong sarcopenia selepas 42 hari, dan tiga kumpulan rawatan diberi dos CdE yang berbeza secara lisan pada masa yang sama. Semasa eksperimen, berat haiwan, kapasiti senaman dan komposisi badan diuji secara berkala. Selepas haiwan dikorbankan, pekali otot anggota belakang dikira, dan histologi dan ujian ekspresi gen yang berkaitan dilakukan. Keputusan farmakologi rangkaian menunjukkan bahawa CdE boleh merawat sarcopenia dengan mengawal selia laluan isyarat IGF-1-dilat semula. Keputusan eksperimen haiwan menunjukkan bahawa CdE membalikkan dengan ketara penurunan kandungan daging tanpa lemak dan pekali otot yang disebabkan oleh Dex, meningkatkan kapasiti senaman, mengurangkan kandungan lemak, meningkatkan status histologi otot, terkawal IGF-1, MyoD dan MyoG, dan menurunkan ekspresi Atrogin-1 dan MuRF-1. CdE mempunyai kesan terapeutik pada atrofi otot akibat Dex dan boleh memperbaiki morfologi histologi otot, dan mekanisme tindakannya mungkin pengaktifan laluan isyarat IGF-1.

Kata kunci: Ekstrak cistanche deserticola; deksametason; sarcopenia; farmakologi rangkaian; IGF-1 laluan

 

 

faedah echinacoside

 

1. Bahan dan Kaedah

1.1 Reagen

Reagen berikut digunakan dalam kajian ini:

Suntikan natrium fosfat dexamethasone(No Batch. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

garam biasa(No. Kumpulan L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Etanol kontang, xilena, paraformaldehid, danglutaraldehid– Kumpulan Farmaseutikal Kebangsaan China

Asid hidroklorik(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Larutan pewarnaan hematoksilin– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Larutan pewarna Eosin– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

Kit benam resin epoksi 812, uranil asetat– Syarikat SPI

Kit Pengekstrakan RNA Molpure®, Kit RT PrimeScript, TB Green™ Premix Ex Taq™ II– YEASEN Bioteknologi dan Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 bahan aktif cistanche

 

1.2 Instrumen

Peralatan utama yang digunakan:

NK-10 tolok tolak tarik analog– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

Penganalisis komposisi badan QMR06-060H– Perbadanan Niumag

Mikroskop trinokular digital BA 210– Kumpulan Motik

JEM-1400 Mikroskop elektron penghantaran FLASH– JEOL, Jepun

Sistem PCR masa nyata QuantStudio™ 3– ThermoFisher Saintifik

 

1.3 Analisis Farmakologi Rangkaian

Untuk menyiasat sebatian aktif dan mekanisme potensi bagiCistanche tubulosadalam rawatansarcopenia, a farmakologi rangkaianpendekatan telah digunakan:

Sebatian aktifdaripadaCistanche tubulosatelah disaring menggunakanPangkalan Data Farmakologi Sistem Perubatan Tradisional Cina (TCMSP), dengan ambang:

Ketersediaan Bio Oral (OB) Lebih daripada atau sama dengan 30%

Keserupaan Dadah (DL) Lebih besar daripada atau sama dengan 0.18

Kompaun tambahan danmaklumat sasarantelah diambil daripada:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Gen berkaitan penyakit untuk sarcopeniadiperolehi daripada:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Analisis interaksi protein-protein (PPI).telah dilakukan melaluiSTRING pangkalan data(https://string-db.org).

A rangkaian interaksi kompaun-sasaran-gentelah dibina menggunakanCytoscape 3.2.1.

Pengayaan fungsionaltelah dijalankan menggunakan:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) untukOntologi Gen (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) untuk analisis laluan

Keputusan telah divisualisasikan melaluiAlat dalam talian bioinformatik(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 PenyediaanCistanche tubulosaEkstrak (CdE)

TheCistanche tubulosaekstrak disediakan seperti berikut:

Hirisan herba mentah (No. Batch Y221217) telah dibeli daripadaSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., dan disahkan oleh Prof. Yang Wenyu dari Universiti Xihua.

1 kg keringCistanche tubulosatelah dilumatkan dan dilalui aAyak 40 mesh.

A Nisbah bahan-kepada-cecair 1:20telah digunakan dengan50% larutan etanol-air.

Campuran tadidirendam selama 30 min, diikuti olehpengekstrakan ultrasonikdi55 darjah, 250 W, untuk40 min.

Ekstrak adalahdisentrifugasi, ditapis, dan dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangkanpada 60 darjah hingga pes tebal (ketumpatan 1.2) menggunakan penyejat berputar.

Ekstrak pekat adalahkering beku di bawah vakum, menghasilkan perlawanan akhirkecekapan pengekstrakan 40%.

 

1.5 Reka Bentuk Eksperimen Haiwan

SejumlahTikus KM jantan gred SPF 50, berumur 6 minggu dan berat(22 ± 2) g, digunakan dalam kajian ini (Lesen Haiwan No.SCXK [Chuan] 2023-030). Semua prosedur haiwan mengikutPeraturan mengenai Pentadbiran Haiwan Makmaldikeluarkan oleh Kementerian Sains dan Teknologi Republik Rakyat China dan telahdiluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Xihua(No. Kelulusan: XH-2023-02-01).

Keadaan perumahan:Suhu (26 ± 1 darjah ), kelembapan (50 ± 10%), 12 jam kitaran terang/gelap, akses percuma kepada makanan dan air.

Selepas 7 hari penyesuaian, tikus telahdibahagikan secara rawak kepada 5 kumpulanberdasarkan berat badan.

Berat badan direkodkan setiap hari, dan keadaan kesihatan umum seperti tingkah laku, keadaan bulu dan pengambilan makanan dipantau.

Kumpulan rawatan dan dosdiperincikan dalamJadual 1.

hiduphari 40–42, ujian fungsi motor(kekuatan cengkaman dan renang) telah dijalankan.

hiduphari ke 43, selepas 12 jam berpuasa, berat badan dan komposisi badan direkodkan. Tikus kemudian dibius dengan eter dan dikorbankan. Otot rangka kaki belakang dua hala dibedah dengan cepat dan ditimbang.

Thegastrocnemius kiridipotong secara membujur dan dipasang3% glutaraldehiddan4% paraformaldehid, masing-masing.

Thegastrocnemius yang betuldibekukan pada −80 darjah untukanalisis qPCR.

Kata Kunci SEO:model haiwan sarcopenia, tikus KM, eksperimen atrofi otot, penilaian fungsi otot, penyelidikan haiwan beretika

faedah acteoside

1.6 Komposisi Badan dan Pengukuran Indeks Otot

Berat badandirekodkan setiap hari sepanjang eksperimen.

Sebelum berkorban,komposisi badan(jisim tanpa lemak dan jisim lemak) diukurdua kali, dannilai puratatelah direkodkan.

Selepas pengorbanan,otot rangka anggota belakangtelah ditimbang.

Theindeks jisim otottelah dikira menggunakanFormula Cuadros [11]:

Indeks Otot (%)=Jisim Otot / Berat Badan × 100
(Persamaan 1)

Kata Kunci SEO:jisim badan tanpa lemak pada tikus, pengiraan indeks otot, penganalisis komposisi badan, biomarker sarcopenia

 

1.7 Ujian Fungsi Motor

Untuk menilaifungsi otot, ujian berikut telah dilakukan antara hari 40 dan 42:

Ujian Renang:

Setiap tetikus adalahditimbang, dan abeban (5% berat badan dalam kerajang plumbum)telah ditetapkan pada sepertiga distal ekor.

Tikus diletakkan di dalam abekas dengan air 25 darjah, pada kedalaman Lebih besar daripada atau sama dengan 30 cm.

Masa berenangtelah dirakam dari kemasukan sehingga tetikus tidak lagi dapat terapung dan mula tenggelam.

Setiap tetikus diuji sekali sehari untuk3 hari berturut-turut, danpuratatelah diambil sebagai keputusan akhir.

Ujian Kekuatan Cengkaman:

Dilakukan menggunakan atolok tolak-tarik manual.

Setiap tetikus telah diujilima kali, dengan aRehat 150 saatantara ujian.

Thepekali kekuatan cengkamandikira untuk menormalkan berat badan:

Pekali Kekuatan Cengkaman=Daya Cengkaman / Berat Badan (N/kg)
(Persamaan 2)

Kata Kunci SEO:ujian ketahanan renang, kekuatan cengkaman dalam tikus, metrik prestasi otot, model tetikus sarcopenia

 

1.8 Analisis Histologi

Untuk menilaiperubahan morfologi dalam tisu ototselepas rawatan denganCistanche tubulosaekstrak (CdE):

Pewarnaan Hematoxylin & Eosin (H&E).telah dilakukan pada tisu yang dipasang4% paraformaldehid.

Bahagian diperhatikan di bawah amikroskop cahaya, dankawasan keratan rentas gentian otottelah dianalisis menggunakanImejJperisian.

Untukanalisis ultrastruktur, otot tetap masuk3% glutaraldehidtelah ditetapkan selepas1% osmium tetroksida, dehidrasi dalam aseton, dan tertanam dalamresin Ep812.

Bahagian Semitintelah diwarnai dengantoluidin biruuntuk kedudukan.

Bahagian ultranipistelah diwarnai denganuranil asetat dan plumbum sitrat, dan diperhatikan dengan aMikroskop elektron penghantaran JEM-1400FLASH.

Lebar gentian ototdiukur menggunakan ImageJ.

Kata Kunci SEO:histologi otot rangka, protokol pewarnaan HE, mikroskop elektron dalam penyelidikan otot, analisis morfologi gentian otot

senarai manfaat cistanche

1.9 Analisis Ekspresi Gen

Untuk menyiasatmekanisme molekulCdE dalam sarcopenia:

Tisu otot bekutelah terganggu secara mekanikal di bawah nitrogen cecair.

Jumlah RNA diekstrak menggunakanReagen TRIpuremengikut arahan pengeluar.

cDNA telah disintesis dengan akit transkripsi terbalik, danqPCRdilakukan dengan menggunakan aThermo Scientific PikoRealsistem.

GAPDHdigunakan sebagai gen rujukan dalaman.

Urutan primer untukgen berkaitan ototdisenaraikan dalamJadual 2.

Kata Kunci SEO:qPCR untuk gen atrofi otot, gen rujukan GAPDH, pengekstrakan RNA daripada otot, ekspresi gen dalam sarcopenia

 

1.10 Analisis Statistik

Data eksperimen dianalisis menggunakanANOVA sehala, diikuti olehUjian perbandingan berganda Dunnett.

A P-nilai < 0.05dianggap signifikan secara statistik.

Semua analisis statistik dilakukan menggunakanSPSS 23.0.

Data histomorfometriktelah dianalisis menggunakanImejJperisian.

Kata Kunci SEO:analisis statistik dalam kajian farmakologi, SPSS dalam penyelidikan bioperubatan, ANOVA dalam kajian haiwan, analisis otot ImageJ