Kajian mengenai kesan acteoside (bahan aktif di cistanche deserticola) di NAFLD dengan mendorong autophagy

2 Keputusan

2.1 Perbandingan LC 3- ⅱ Tahap ekspresi protein dalam sel HepG2 yang dirawat denganBertindak dan ech ungkapan relatif lc 3- ⅱ proteinDalam sel HepG2 yang dirawat dengan BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4} adalah jauh lebih tinggi daripada itu dalam kumpulan kawalan kosong (0. Ekspresi relatif LC {{1 {{2 0}}} ⅱ protein dalam sel HepG2 dalam kumpulan rapamycin+Bafa1 (1.24 ± 0} (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Ekspresi protein LC 3- ⅱ dalam sel HepG2 dalam kumpulan ECH+BAFA1 dan kumpulan ACT+BAFA1 [0.43 ± 0.02 dan 1.36 ± 0.11 adalah lebih tinggi daripada kumpulan ECH dan Kumpulan ACT [0.18 ± 0.01<0.05).

TCM Herb Cistanche untuk Perlindungan Hati

2.2 Perbandingan LC 3- ⅱ Tahap ekspresi protein dalam sel HepG2 yang dirawat dengan kepekatan ACT yang berbeza

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Tahap ekspresi protein sel HepG2 dalam BAFA1 digabungkan dengan 25, 5 0, dan 1 0 0 μmol/l kumpulan ACT (1.17 ±}. 1.83 ± 0.<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Nota: A. protein immunoblotting; B. Hasil analisis semi-kuantitatif; Berbanding dengan kumpulan ACT tanpa BAFA1, AP<0.05.
Rajah 1 Perbandingan LC 3- ⅱ Tahap ekspresi protein dalam sel HepG2 yang dirawat dengan kepekatan ACT yang berbeza

2.3 Perbandingan daya maju sel HepG2 yang dirawat dengan kepekatan ACT yang berbeza selama 24 dan 48 jam

Nilai OD sel HepG2 selepas campur tangan dengan 0, 2 0, 4 {{1 0}}, 6 0, 8 0 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 {36}}}}. 0. 94 ± 0. 15, dan 0. 94 ± 0 20, masing -masing; dan nilai OD sel HepG2 selepas campur tangan selama 48 jam adalah 3.06 ± 0.27, .96 ± 0.27, 2.88 ± 0.27, 3.08 ± 0.15, 3.01 ± 0.13, dan .09 ± 0.22. Tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam nilai OD sel HepG2 selepas 24 dan 48 jam campur tangan dengan kepekatan ACT yang berlainan (F =0. 213, 0.213, p =0 96, 0.36). Lihat Rajah 2.

Nota: A. HepG2 sel telah dirawat dengan kepekatan ACT yang berlainan selama 24 jam; Sel B. HepG2 dirawat dengan kepekatan ACT yang berbeza selama 48 jam.

Rajah 2 nilai OD pada 570 nm selepas 24 dan 48 jam rawatan dengan kepekatan ACT yang berbeza

2.4 Perbandingan Tahap Tg dan Minyak Merah O Pewarnaan dalam Model Sel In vitro NAFLD Selepas campur tangan ACT

Tahap Tg sel HepG2 dalam kumpulan model (34.15 ± 1.90) jauh lebih tinggi daripada kumpulan kawalan kosong (14.17 ± 2.74) dan kumpulan intervensi ACT (19.11 ± 1.68), dan perbezaannya secara statistik (p<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

NOTA: A. TG TG; B. minyak merah o pewarnaan (20 ×); Berbanding dengan kumpulan model, AP<0.05.
Rajah 3 Perbandingan tahap Tg dan minyak merah O Pewarnaan dalam model sel NAFLD dalam vitro selepas rawatan ACT

2.5 Perbandingan autophagosomes dan titisan lipid selepas rawatan ACT berbanding dengan kumpulan kawalan kosong, titisan lipid sel HepG2 dalam kumpulan rawatan rapamycin dan kumpulan intervensi ACT meningkat dengan ketara, dan autophagosom LC3 sel-sel HepG2 dalam kumpulan intervensi ACT meningkat dengan ketara. Lihat Rajah 4.

3 Perbincangan

NAFLD adalah penyakit hati kronik yang paling biasa di dunia, menyumbang kira -kira 1/4 daripada jumlah penduduk di dunia, dan telah menjadi masalah kesihatan awam global. Overnutrition adalah faktor utama yang memandu NAFLD. Pengambilan nutrien yang berlebihan oleh sel -sel hati menyebabkan pemendapan lemak yang berlebihan dalam sel -sel, yang membawa kepada tindak balas lipotoksik seperti tekanan sel (tekanan oksidatif dan tekanan retikulum endoplasma), pengaktifan inflammasome, dan seterusnya. Dalam tahun -tahun kebelakangan ini, kajian telah menunjukkan bahawa autophagy memainkan peranan penting dalam mencegah perkembangan NAFLD manusia. Hasil pengesanan indeks yang berkaitan dengan autophagy di kalangan pesakit dengan penyakit hati berlemak NAFLD dan bukan alkohol dan tikus diet obes dan tinggi lemak menunjukkan bahawa proses autophagy dalam hepatosit telah disekat, yang membawa kepada pengumpulan besar-besaran TG intraselular dan dropet lipid lain [16]. Kajian-kajian lain telah menunjukkan bahawa selepas gen utama 7 autophagy hepatosit secara khusus tersingkir pada tikus yang diberi makan diet tinggi lemak, tahap TG dalam hepatosit tetikus meningkat dengan ketara [17]. Walau bagaimanapun, selepas overexpression gen ATG7 atau campur tangan dengan induk autophagy seperti rapamycin dan carbamazepine, degenerasi lemak di hati tetikus dikurangkan dengan ketara [18-20].
Ini menunjukkan bahawa degenerasi lemak hati dapat dikurangkan dengan ketara dengan meningkatkan aktiviti autophagy hati, memberikan strategi yang berkesan untuk rawatan NAFLD. Produk semulajadi, sebagai sumber utama pembangunan dadah baru, digunakan secara meluas dalam pencegahan dan rawatan pelbagai penyakit hati. Sebagai produk yang sangat baik yang biasa digunakan dalam perubatan tradisional Cina, Cistanche Deserticola telah menarik perhatian yang meluas untuk kesan farmakologinya seperti neuroprotection, imunomodulasi, antioksidan, antikanser, dan perlindungan hati. Setakat ini, lebih daripada 120 sebatian telah diasingkan dari cistanche deserticola, termasuk glycosides phenylethanoid, terpenoid dan glycosides, lignans dan glikosida mereka, oligosakarida, polyols, dan polysaccharides [21]. Antaranya, glycosides phenylethanoid adalah kelas sebatian yang paling dikaji dalam bahan -bahan aktif Cistanche Deserticola. ECH dan ACT adalah sebatian perwakilan glikosida phenylethanoid Cistanche desertacola, yang mempunyai kesan positif dalam antioksidan, melindungi hati, miokardium, sel saraf dan memori meningkatkan [22-23]. Walau bagaimanapun, tidak ada laporan kesusasteraan yang relevan mengenai sama ada glikosida phenylethanoid Cistanche desertacola terlibat dalam proses autophagy dalam melindungi hati.

Autophagy adalah proses degradasi diri yang ada di mana-mana di dalam badan. Ia adalah proses katabolik di mana autophagosomes merendahkan sisa metabolik selular. Proses autophagy umumnya termasuk tiga proses: permulaan autophagy, lanjutan membran autophagic dan pembentukan lysosome autofagik, yang terutama dikawal oleh protein sasaran rapamycin dan phosphatidylinositol -3 kinase. Autophagosomes adalah penanda autophagy selular. Dalam proses pembentukan autofagosom, satu siri protein yang berkaitan dengan autophagy termasuk ATG5 ~ 12 dan LC3 memainkan peranan penting. Oleh itu, kajian ini membina sistem penilaian autophagy, mengesan tahap ekspresi protein penanda autophagy LC3 pada tahap molekul, dan menilai keupayaan induksi autophagy dua glikosida phenylethanoid dari cistanche desidenes dalam sel HEPG2. Keputusan menunjukkan bahawa selepas penambahan rawatan Bafa1 berdasarkan campur tangan rapamycin induk autophagy, LC intraselular 3- ⅱ sel HepG2 meningkat dengan ketara, menunjukkan bahawa sistem penilaian autophagy dapat menilai secara tepat aktiviti induksi autophagy; Selepas Ech dan ACT dirawat dengan Bafa1, ungkapan protein Lc 3- ⅱ dalam sel Hepg2 dalam kumpulan ech+Bafa1 dan kumpulan ACT+Bafa1 jauh lebih tinggi daripada kumpulan ech dan kumpulan ACT, dan perbezaannya secara statistik (<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and Melaksanakan perlindungan hatidan fungsi biologi lain. Kedua, keselamatan adalah pertimbangan utama dalam pembangunan dadah. Untuk menilai keselamatan ACT, kajian ini selanjutnya menguji kesan ACT pada daya maju sel HepG2. Hasilnya menunjukkan bahawa daya maju sel HepG2 hampir tidak terjejas oleh campur tangan dengan kepekatan ACT yang berlainan, menunjukkan bahawa ACT boleh digunakan sebagai ubat calon untuk mengkaji selanjutnya kesan farmakologi dan mekanisme molekul.

Autophagy adalah proses biologi yang sangat konservatif dalam sel, dan sedikit perubahan dalam kepekatan dadah akan mempengaruhi tahap autophagosomes selular. Untuk terus menentukan kepekatan ACT yang optimum untuk mendorong pembentukan autophagosomes dalam sel HepG2, kajian ini menggunakan kepekatan ACT yang berbeza yang digabungkan dengan BAFA1 untuk merawat sel HepG2 dan mengesan tahap ekspresi LC 3- ⅱ protein dalam sel. Keputusan menunjukkan bahawa tindakan 50 μmol/L dapat meningkatkan tahap autophagosomes dalam sel HepG2. Oleh itu, kajian ini menggunakan 50 μmol/L bertindak untuk campur tangan dalam model sel NAFLD yang dibina secara in vitro, dan awalnya meneroka hubungan antaraperlindungan hatifungsi dan autophagy.
Kajian yang berkaitan dengan model sel NAFLD telah menunjukkan bahawa selepas intervensi in vitro dengan asid lemak bebas, tahap TG sel HepG2 meningkat dengan ketara, dan pengagregatan titisan lipid berminyak dapat dilihat dengan jelas dalam sel [24-25]. Dalam kajian ini, 100 μmol/L PA digunakan untuk campur tangan dalam sel HepG2 secara in vitro selama 24 jam. Tahap TG sel HepG2 dalam kumpulan model jauh lebih tinggi daripada yang dalam kumpulan kawalan kosong. Pada masa yang sama, pengagregatan titisan lipid dapat dilihat dengan jelas dalam sel -sel, menunjukkan bahawa model sel NAFLD berjaya dibina. Untuk terus memerhatikan kesan ACT pada model sel NAFLD, ACT 50 μmol/L digunakan untuk campur tangan dalam model NAFLD in vitro, dan kesan ACT pada NAFLD dinilai oleh pengesanan tahap TG dan minyak merah O minyak. Keputusan menunjukkan bahawa selepas campur tangan ACT, tahap TG dan bilangan titisan lipid berminyak dalam sel HepG2 jauh lebih rendah daripada kumpulan model, yang menunjukkan bahawa ACT mempunyai aktiviti mengurangkan TG dalam model sel NAFLD yang disebabkan oleh PA. Untuk mengkaji lebih lanjut hubungan antara aktiviti penurunan lipid ACT dan autophagy selular, kajian ini menggunakan LC 3- ⅱ antibodi protein spesifik dan probe pendarfluor bodipy untuk autophagosom dan titisan lipid. Telah diperhatikan bahawa bilangan autophagosomes dalam sel HepG2 selepas campur tangan ACT meningkat dengan ketara berbanding dengan kumpulan kawalan, yang konsisten dengan hasil immunoblotting protein dalam kajian ini, selanjutnya mengesahkan bahawa ACT mempunyai aktiviti autophagy dalam sel HepG2. Di samping itu, selepas campur tangan dadah, autophagosomes intrasel dan titisan lipid bersama-sama, menunjukkan bahawa kesan ACT untuk meningkatkan degenerasi lemak NAFLD yang disebabkan oleh PA mungkin melibatkan penglibatan autophagy selular. Walau bagaimanapun, dalam model sel NAFLD, sama ada ACT menggunakan aktiviti farmakologinya untuk mengurangkan tahap TG intraselular melalui laluan lipophagic masih perlu dijelaskan lebih lanjut dengan menghalang proses autophagy intraselular.
Ringkasnya, di antara kedua -dua sebatian phenylethanol glikosida Cistanche Desertacola, ACT mempunyai keupayaan yang signifikan untuk mendorong autophagy dalam sel HepG2. Pada masa yang sama, dalam model sel steatosis hepatik yang disebabkan oleh PA, CT mengurangkan tahap TG dalam sel HepG2. Selepas campur tangan ACT, autophagosomes dan titisan lipid dalam sel HepG2 mempunyai hubungan penyetempatan bersama tertentu, menunjukkan bahawa autophagy mungkin laluan baru yang terlibat dalam proses farmakologi ACT dari segi perlindungan hati. Lihat Rajah 5. Dalam kajian berikutnya, mekanisme tindakan ACT dalam menurunkan lipid akan dikaji secara lebih terperinci dengan menggunakan penghalang autophagy untuk meletakkan asas untuk pembangunan dadah baru masa depan.