Spermidine Mengurangkan Kerosakan Mitokondria Miokardium Dalam Tikus Intrauterine Hypoxia-Induced Kerosakan Mitokondria Miokardium Pada Tikus Dengan Menghalang Tekanan Oksidatif Dan Mengawal Kawalan Kualiti Mitokondria Bahagian 1

Abstrak

Latar belakang: Intrauterine hypoxia (IUH) meningkatkan risiko penyakit kardiovaskular dalam kalangan anak. Sebagai pemulung spesies oksigen reaktif (ROS), polyamine spermidine (SPD) adalah penting untuk kemandirian dan pertumbuhan embrio dan janin. Walau bagaimanapun, kajian lanjut mengenai perlindungan SPD dan mekanisme untuk kerosakan jantung yang disebabkan oleh IUH dalam keturunan diperlukan.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang teguh, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada Cistanches Herba Untuk Anti-penuaan

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Objektif: Kajian ini bertujuan untuk menyiasat kesan pencegahan rawatan SPD pranatal terhadap kerosakan jantung yang disebabkan oleh IUH dalam tikus anak yang baru lahir dan mekanisme berkaitan mitokondria yang mendasarinya.

Kaedah: Model tikus IUH telah ditubuhkan melalui pendedahan kepada 10 peratus O2 tujuh hari sebelum tempoh. Sementara itu, selama tujuh hari, tikus bunting diberi SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Tikus anak satu hari telah dikorbankan untuk menilai beberapa parameter, termasuk perkembangan pertumbuhan, kerosakan jantung, percambahan kardiomiosit, tekanan oksidatif miokardium, apoptosis sel, dan fungsi mitokondria, dan mempunyai kawalan kualiti mitokondria (MQC), termasuk mitophagy, biogenesis mitokondria, dan gabungan/pembelahan mitokondria. Eksperimen in vitro, kardiomiosit primer tertakluk kepada hipoksia dengan atau tanpa SPD selama 24 jam.

Keputusan: IUH menurunkan berat badan, berat jantung, ekspresi Ki67 jantung, aktiviti SOD, dan tahap CAT dan adenosin 5'- trifosfat (ATP) dan meningkatkan ekspresi BAX/BCL2 dan nombor nukleus TUNEL-positif. Tambahan pula, IUH juga menyebabkan keabnormalan struktur mitokondria, disfungsi, dan penurunan mitophagy (penurunan bilangan mitofagosom), penurunan biogenesis mitokondria (penurunan ekspresi SIRT-1, PGC-1 , NRF-2, dan TFAM), dan membawa kepada ketidakseimbangan pembelahan / gabungan (peningkatan peratusan serpihan mitokondria, peningkatan ekspresi DRP1, dan penurunan ekspresi MFN2) dalam miokardium. Yang menghairankan, rawatan SPD menormalkan variasi dalam parameter yang disebabkan oleh IUH. Tambahan pula, SPD juga menghalang pengumpulan ROS yang disebabkan oleh hipoksia, pereputan potensi membran mitokondria, dan penurunan mitophagy dalam kardiomiosit.

Kesimpulan: Rawatan SPD ibu menyebabkan kerosakan jantung yang disebabkan oleh IUH pada tikus yang baru lahir dengan meningkatkan fungsi miokardium miokardium melalui anti-pengoksidaan dan anti-apoptosis, dan mengawal selia MQC.

1. Latar belakang

Kajian epidemiologi dan haiwan menunjukkan bahawa persekitaran intrauterin adv se dikaitkan dengan peningkatan risiko penyakit kardiovaskular pada masa dewasa (1). Hipoksia pranatal, persekitaran intrauterin buruk yang paling biasa, boleh menyebabkan janin tidak dapat merealisasikan potensi pertumbuhannya yang ditentukan secara genetik, dimanifestasikan sebagai terencat pertumbuhan dan kecederaan fungsi organ pada musim bunga (2). Hipoksia janin kronik selalunya berpunca daripada kehamilan dengan peningkatan rintangan vaskular plasenta seperti pra-klamsia, kehamilan antara pada ketinggian tinggi, atau penyakit pernafasan ibu. Lebih ketara, satu pertiga daripada mereka terjejas oleh sindrom hipoventilasi apnea tidur obstruktif (OSAHS) pada lewat kehamilan, dan ia juga dikaitkan dengan perkembangan sindrom hipertensi kehamilan. Perubahan patofisiologi SAHS yang paling kritikal ialah hipoksia terputus-putus kronik (3, 4). Dalam beberapa model haiwan, intrauterine hypoxic (IUH) membawa kepada pengurangan kecekapan jantung, disfungsi diastolik dan sistolik, pertumbuhan hipertropik, penurunan proliferasi kardiomiosit, dan kelewatan kematangan kardiomiosit dalam jantung janin dan neonatal, dengan itu meningkatkan risiko gangguan jantung pada anak dewasa ( 5). Kesan pengaturcaraan hipoksia kronik terutamanya boleh menerangkan mekanisme pada peringkat kritikal perkembangan jantung, yang membawa kepada peningkatan tekanan oksidatif jantung dan peningkatan apoptosis sel dalam keturunan (6-9). Konsep pengaturcaraan pembangunan masuk akal kerana fisiologi kita lebih mudah dibentuk dan plastik semasa awal kehidupan. Keadaan dalam rahim menentukan dan memprogramkan konsep fisiologi dan metabolisme yang hidup kita. Sehubungan itu, tindak balas penyesuaian janin terhadap IUH membawa kepada perkembangan penyakit kardiovaskular dewasa (10). Mitokondria ialah organel kompleks yang memainkan peranan penting dalam penjanaan tenaga selular dan pelbagai peristiwa isyarat bilik bawah tanah. Integriti struktur dan fungsi mitokondria adalah penting untuk kelangsungan hidup kardiomiosit, dan apabila terjejas, gangguan homeostasis mit-hondrial mengakibatkan perkembangan penyakit carac. Baru-baru ini, beberapa kajian telah memberi tumpuan kepada peranan disfungsi mitokondria yang menyebabkan hipoksia pranatal kronik dalam mengantarkan kerosakan jantung anak. Telah dilaporkan bahawa fungsi mitokondria telah terjejas, dan ungkapan beberapa peraturan mol mitokondria mengubah jantung perinatal yang terdedah kepada IUH (11). Lebih-lebih lagi, IUH membawa kepada penurunan aktiviti enz e kompleks mitokondria dan disfungsi hirisan jantung dalam keturunan ult berikut iskemia miokardium (12). Sehubungan itu, kajian ini bertujuan untuk menemui pautan molekul antara hipoksia pranatal, tekanan oksidatif, tindakan dis mitokondria, dan kecederaan jantung pada anak baru (13).

Perkembangan dan kematangan sistem mitokondria volum tinggi dalam miokardium ini berlaku terutamanya pada peringkat perkembangan perinatal dan selepas bersalin, terutamanya disebabkan oleh anjakan metabolik jantung daripada menggunakan glukosa o asid lemak untuk penjanaan adenosin 5'-trifosfat (ATP) selepas kelahiran. (14). Bukti yang muncul menunjukkan mekanisme kawalan kualiti mitokondria (MQC) adalah penentu kritikal untuk pematangan kardiomiosit (15). Kawalan kualiti mitokondria, terutamanya termasuk biogenesis mitokondria, mitophagy bersama-sama dengan dinamik, rangkaian pengawalseliaan yang ditala halus, mengatur kuantiti dan kualiti mitokondria dan meningkatkan fungsi mitokondria dan kelangsungan hidup kardiomiosit dalam keadaan tekanan (16). Peroxisome proliferators-activate receptors (PPAR ) coactivator 1 (PGC-1) ​​memainkan peranan penting dalam memacu biogenesis dan fungsi mitokondria dalam jantung (17). Proliferator peroxisome-activate receptors coactivator 1 / (-/-) jantung tikus mempamerkan tandatangan f kecacatan matang dan keabnormalan teruk dalam fungsi dan ketumpatan mitokondria (18). Tambahan pula, memadam Parkin pengantara mitophagy menghalang kematangan mitokondria morfologi dan berfungsi dalam peringkat neonatal (19). Mitokondria adalah organel yang sangat dinamik, mengalami peristiwa pembelahan dan pelakuran berterusan yang berkaitan dengan fungsinya. Pada tempoh embrio lewat, ablasi genetik khusus kereta bagi gabungan mitokondria pro dalam MFN1 dan MFN2 pada tikus memaparkan disfungsi mitokondria yang teruk selepas kelahiran dan membangunkan kardiomiopati (20). Secara mengejutkan, kajian baru-baru ini mendedahkan bahawa hyp ia yang kronik mengganggu dinamik mitokondria dalam gui a babi otak depan janin (21). Sehubungan itu, MQC boleh bertindak sebagai titik fokus dalam perkembangan kecederaan miokardium dalam anak-anak neonatal IUH. Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang kesan hipoksia pranatal pada sistem MQC jantung neonatal dan kesan disfungsi MQC terhadap kesihatan jantung neonatal. Kajian ini mengambil alih misi ini untuk meneroka mekanisme berkaitan mitokondria kerosakan miokardium yang disebabkan oleh IUH pada anak baru dan meneroka strategi pencegahan untuk mengurangkan kecederaan jantung IUH.

Poliamina (PA), termasuk putrescine (PU), spermidine (SPD) dan spermine (SP), terdapat dalam hampir semua organisma hidup dan penting untuk surval, pertumbuhan dan perkembangan embrio dan janin (22-24) . Kajian mendapati bahawa biri-biri yang terdedah kepada IUH boleh meningkatkan displasia embrio dengan menambah poliamina eksogen (25, 26). Tambahan pula, badan kesusasteraan yang semakin meningkat menunjukkan peranan poliamina dalam menghilangkan radikal bebas dan melindungi DNA, protein, dan lipid daripada kerosakan yang memudaratkan tekanan oksidatif. Ia juga mendedahkan bahawa suplemen poliamina meningkatkan jangka hayat dalam organisma model melalui pro-cuba antioksida, anti-radang dan mitophagy ({6}}). Kajian terbaru telah mendokumenkan bahawa supmentasi dengan SPD dalam diet adalah kardioprotektif dan memanjangkan jangka hayat pada kedua-dua tikus dan manusia dengan merangsang mitophagy dan pernafasan mitokondria dan meningkatkan fungsi jantung (30, 31). Lebih penting lagi, kami sebelum ini melaporkan bahawa pendedahan hipoksik ibu semasa peringkat akhir perkembangan janin menghasilkan senarai ana dased dan peningkatan katabolisme poliamina dalam tisu karak tikus yang baru lahir. SPD menghalang kecederaan jantung pada tikus keturunan ven-day yang terdedah kepada IUH dengan menghalang mentasi mitokondria (32).

2. Objektif

Dalam kajian ini, IUH dihipotesiskan untuk mendorong defisit struktur dan fungsi mitokondria dengan meningkatkan tekanan oksidatif dan memusnahkan mekanisme MQC dalam jantung anak yang baru lahir, dan rawatan SPD ibu dalam utero diandaikan dapat mengurangkan kecederaan miokardium dengan mengurangkan program pembangunan mitokondria. Kajian ini mungkin menyumbang kepada pembangunan strategi pencegahan atau terapeutik untuk anak IUH untuk mencegah penyakit kardiovaskular dewasa.

3. Kaedah

3.1. Haiwan

Tikus Wistar jantan dan betina (3 bulan) telah dibeli dari Jabatan Haiwan Makmal di Universiti Perubatan Harbin. Semua prosedur telah diluluskan oleh Jawatankuasa Semakan Etika Universiti Perubatan Harbin (China), dan semua eksperimen telah dijalankan oleh garis panduan Institut Kesihatan Nasional. Tikus dengan nisbah jantan kepada betina 2: 1 diletakkan secara rawak di dalam sangkar untuk mengawan. Calitan faraj dilakukan pada hari berikutnya untuk mengesan kehadiran sperma dalam palam faraj atau sapuan faraj, yang disahkan sebagai hari sifar kehamilan. Tikus-tikus bunting disimpan di dalam bilik dengan kelembapan terkawal (60 peratus) dan suhu terkawal (21 darjah), dan kitaran gelap-gelap ialah 12: 12 jam.

3.2. Model Hipoksia Dalam Rahim

Dari hari ke-15 hingga ke-21 kehamilan, tikus dalam kumpulan hipoksia (n=10) dimasukkan ke dalam ruang plexiglass tertutup, disuntik dengan udara dan nitrogen dan dipantau oleh penganalisis oksigen (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, New York, Amerika Syarikat), dan disedut dengan kandungan oksigen sebanyak 10 peratus selama empat jam sehari. Sampel darah arteri diambil dari arteri femoralis kanan, gas darah dan nilai pH diukur untuk mengekalkan tekanan separa oksigen arteri sebanyak 50 - 55 mmHg, ketepuan oksigen darah dikekalkan pada 80 - 85 peratus, dan prosedur khusus telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini (32). Tikus betina eksperimen dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan: kumpulan kawalan (kawalan), kumpulan hipoksia intrauterin (Hpx), hipoksia intrauterin ditambah kumpulan spermidine (Hpx-Spd), dan kumpulan perencat intrauterine hypoxia ditambah spermidine ditambah (Hpx-Spd-DFMO. ). Enam tikus bagi setiap kumpulan disuntik secara intraperitoneal pada hari ke-15 - 21kehamilan. Tikus diberi 0.9 peratus salin (1 mL/kg/d) dalam kumpulan kawalan dan Hpx, SPD (5 mg/kg/d) dalam kumpulan Hpx-Spd, dan SPD (5 mg/kg/d) dan difuoromethy -L-ornithine (DFMO, perencat enzim utama sintesis poliamina ODC) (5 mg/kg/d) dalam kumpulan Hpx-Spd-DFMO, masing-masing. Selepas bersalin, 1-bayi yang baru lahir sehari telah dikorbankan, dan hati mereka diekstrak untuk kajian eksperimen susulan.

3.3. Analisis Histologi

Tisu ventrikel kiri tikus dipotong menjadi ketebalan < 1 cm, difiksasi dengan 4 peratus paraformaldehid, dehidrasi dengan alkohol, dan dibenamkan dalam parafin. Parafin tertanam dipotong menjadi kepingan setebal 5 mm, kemudian dikeringkan pada suhu ketuhar malar 60 darjah , didewax dengan xilena, dan diikuti dengan pewarnaan hematoxylin-eosin (HE). Kepingan tisu diperhatikan untuk menilai perubahan dalam morfologi dan struktur jantung dengan mikroskop optik (Eclipse E200; Nikon, Tokyo, Jepun).

3.4. Analisis Imunofluoresensi

Pewarnaan imunofluoresensi Ki67 dilakukan seperti yang diterangkan sebelumnya (33). Secara ringkas, tisu ventrikel kiri tikus telah ditetapkan dalam 4 peratus formalin, tertanam dalam parafin; dewaxing, penghidratan, dan pembaikan antigen mula-mula selesai. Tisu tersebut telah disekat dengan 0.5 peratus albumin serum lembu selama 2 jam dan kemudian diinkubasi dengan Antibodi Monoklonal Arnab Ki67 (1: 100, AF1738, Beyotime, China) pada 4 darjah semalaman. Selepas mencuci dengan PBS, tisu itu diinkubasi dengan pendarfluor Alexa berlabel Goat anti-arnab IgG (1: 500, A 0468, Beyotime, China) dan diwarnakan dengan DAPI untuk nukleus. Imej telah dilihat dan diimbas di bawah mikroskop confocal laser (OLYMPUS, FV1000, Jepun). Perisian ini digunakan untuk menganalisis kolokalisasi imej yang digabungkan.

3.5. Kuantifikasi Fibrosis

Fibrosis jantung dinilai dengan pewarnaan trichrome Masson. Seperti yang diterangkan di atas, bahagian tisu jantung daripada tikus neonatal telah didewax dan dihidratkan dengan kaedah standard dan kemudian diwarnai dengan trichrome Masson mengikut protokol. Dua keratan rentas yang tidak bersebelahan digunakan untuk setiap jantung. Peratusan kawasan fibrotik dalam jumlah kawasan miokardium ventrikel kiri dianalisis menggunakan perisian ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. Pelabelan Nick End dUTP Pengantaraan TdT dan Pengukuran Sel Apoptotik

Ujian pelabelan hujung nick end (TUNEL) dUTP pengantaraan TdT telah digunakan untuk menentukan bilangan sel apoptosis dalam jantung tikus neonatal berusia satu hari. Tisu jantung telah dirawat mengikut prosedur kami yang telah diterangkan sebelum ini menggunakan Kit Pengesanan Kematian Sel (Roche, Jerman) mengikut arahan pengilang. Tiga slaid dari setiap blok dinilai untuk peratusan sel apoptosis. Empat medan slaid telah diperiksa secara rawak dengan pembesaran 200 ×. Secara keseluruhan, 100 sel telah dikira dalam setiap medan.

3.7. Pengukuran Aktiviti Enzim Antioksidan

Aktiviti superoxide dismutase (SOD) dan katalase (CAT) diukur menggunakan kit komersial (SOD: A001-3- 1 dan CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, China) dengan spektrofotometer (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Amerika Syarikat). Mengikut arahan pengilang, operasi telah selesai, dan kepekatan protein diukur menggunakan kaedah asid bicinchoninic (Pierce, Rockford, Amerika Syarikat) dengan albumin serum lembu (BSA) sebagai standard (34).

3.8. Pengukuran Kandungan Adenosin 5'-Trifosfat

Kandungan ATP dalam tisu jantung diukur menggunakan kit ujian ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, China). Mengikut arahan pengilang, lysate ditambah mengikut perkadaran mengikut berat tisu, dihomogenkan dengan homogenizer kaca, dan kemudian disentrifugasi pada 4 darjah 12000 g. Supernatan telah diambil, dan kandungan ATP dalam setiap sampel telah dikesan dengan luminometer (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) kit BCA (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, China). Kaedah asid bicinchoninic digunakan untuk menentukan kepekatan protein dan kemudian menukar kepekatan ATP kepada nmol/g protein.

3.9. Mikroskopi Elektron Penghantaran

Tisu apikal jantung dibedah kepada kira-kira 1 mm × 1 mm × 1 mm kepingan kecil dan kemudian diikat dalam penimbal fosfat glutaraldehid pada 4 darjah. Selepas dehidrasi rutin, merendam, membenamkan dan mengotorkan, bahagian ultranipis 50 - 70 nm telah dibuat. Ultrastruktur tisu jantung diperhatikan di bawah mikroskop elektron penghantaran (TEM) dan difoto (H600 Hitachi, Tokyo, Jepun). Mitokondria dan myofilamen tunggal dipetakan di bawah keadaan pembesaran 10000 kali dengan perisian Image J versi 1.80 (Institut Kesihatan Kebangsaan), dan kawasan mereka diukur dari setiap jantung (35). Sementara itu, serpihan mitokondria < 1 µm3, yang tidak dibahagikan (biasanya bulat), telah dikenal pasti, dan peratusan purata serpihan mitokondria dalam medan pandangan dikira menggunakan Indeks Pecahan Mitokondria (MFI).

3.10. Pengasingan Mitokondria

Mitokondria diasingkan pada 4 darjah menggunakan sentrifugasi pembezaan dengan Kit Pengasingan Mitokondria (Bioteknologi Beyotime, Shanghai, China). Secara ringkas, tisu jantung segar dipotong menjadi kepingan tisu dan disentrifugasi dengan 10 jilid PBS pra-sejuk, supernatan dibuang, mendakan dicerna dengan trypsin selama 20 minit, penimbal pengasingan tambahan A diempar, supernatan dipindahkan ke yang lain. tiub, disentrifugasi semula, dan pecahan yang dimendakan ialah mitokondria terpencil. Pelet mitokondria jantung terakhir digantung semula dalam penimbal homogenisasi, disimpan di atas ais, dan digunakan untuk eksperimen ke atas fungsi respirasi mitokondria dalam masa 4 jam.

3.11. Pengukuran Penggunaan Oksigen Mitokondria

Penggunaan oksigen mitokondria diukur oleh elektrod oksigen jenis Clark (Instrumen Hansatech, Norfolk, UK) dalam penimbal pernafasan mitokondria. Piruvat (5 mM) dan malat (5 mM) digunakan sebagai substrat untuk mitokondria yang mengandungi I kompleks pada kepekatan akhir 500 µg protein/mL. Penggunaan oksigen yang dirangsang ADP (keadaan 3 pernafasan) diukur dengan kehadiran 200 μM ADP, dan penggunaan oksigen bebas ADP (keadaan 4 pernafasan) telah dipantau. Nisbah kawalan pernafasan (RCR, keadaan 3 dibahagikan dengan keadaan 4) mencerminkan penggunaan oksigen melalui fosforilasi (gandingan). Prosedur diteruskan, seperti yang diterangkan sebelum ini (36).

3.12. Analisis Western Blot

Sampel tisu jantung telah dituai dan disimpan pada -80 darjah . Tisu jantung ventrikel kiri beku telah dihomogenkan dalam penimbal lisis RIPA sejuk ais (Beyotime Inc., Shanghai, China P0013B). Kepekatan protein dikira menggunakan kit ujian protein BCA (Beyotime Inc., Shanghai, China P0006C). Sampel yang mengandungi jumlah protein dipisahkan sebanyak 10 peratus (w/v) SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Millipore, Bedford, MA, Amerika Syarikat). Antibodi berikut telah digunakan: Antibodi untuk GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) dan BAX (1.1000,509599-2-Ig) telah dibeli daripada Proteintech (WuHan, China), BCL2 (1: 2000, sc-7382) dan DRP1 (1:1000, sc-271583) telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) dan PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, UK). Antibodi sekunder (IgG anti-arnab kambing berlabel peroksidase lobak) adalah daripada Beyotime Corporation (Shanghai, China). Keamatan jalur protein dikira menggunakan sistem pengimejan gel Fluor Chem Chemiluminescence (Protein Simple, USA). Ketumpatan optik jalur protein dianalisis dengan perisian Image J versi l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Model Kardiomiosit Hipoksik

Kardiomiosit tikus neonatal (NRMCs) telah diasingkan dan dibiakkan dengan kaedah standard, seperti yang diterangkan sebelum ini (32). Secara ringkas, jantung tikus neonatal tiga hari telah diekstrak, dicincang, dikultur dan kemudian dicerna dalam 0.25 peratus trypsin dan 0.02 peratus EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Selepas sentrifugasi, mendakan dipindahkan ke DMEM ditambah dengan 10 peratus serum anak lembu janin (Biolot, Rusia) dan diinkubasi dalam udara lembap yang mengandungi 5 peratus 2. Tiga hari selepas disemai, sel-sel diletakkan di dalam kebuk hipoksik kaca (Biospherix OxyCycler C42). , Redfield, NY), dan diisi dengan nitrogen selama 8 minit untuk mengeluarkan sisa oksigen. Kardiomiosit ini dibahagikan secara rawak kepada kumpulan berikut: (1) Kumpulan kawalan (kawalan), sel yang dibiakkan di bawah keadaan pengeraman biasa; (2) kumpulan hipoksia (Hpx), sel diletakkan di dalam ruang hipoksik selama 24 jam dan kemudian dibiakkan secara normal selama 24 jam; (3) Kumpulan Hpx-Spd, sel diletakkan di dalam ruang hipoksik dan diinkubasi dengan 10 µmol/L SPD selama 24 jam; (4) Kumpulan Hpx-SpdDFMO, sel diletakkan di dalam ruang hipoksik dan diinkubasi dengan 10 µmol/L SPD ditambah 2 mmol/L DFMO selama 24 jam.

3.14. Pengukuran Spesies Oksigen Reaktif

Penjanaan ROS diukur dengan ujian pewarnaan dihydroethidium (DHE) (Cat No. S0063, Beyotime, China). Secara ringkas, kardiomiosit primer diinkubasi dengan 5 µmol/L DHE pada 37 darjah selama 30 minit, dibasuh dengan PBS, dan kemudian digerakkan di bawah mikroskop untuk melihat perubahan dalam keamatan pendarfluor. Imej diambil dengan mikroskop pendarfluor Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Jepun) pada panjang gelombang pengujaan 535 nm, dan panjang gelombang pancaran maksimum ialah 610 nm, n > 20 sel setiap kumpulan.

3.15. Penentuan Potensi Membran Mitokondria

Pewarna tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) bercas positif dan boleh terletak secara selektif dalam mitokondria. Ia digunakan secara meluas untuk menentukan potensi membran mitokondria (∆Ψm). Ringkasnya, larutan kerja pewarnaan TMRE pada kepekatan 200 µmol/L telah ditambah kepada kardiomiosit yang telah dikumpul, dicampur dengan teliti, dan diletakkan di dalam inkubator sel pada 37 darjah selama 20 minit. Supernatan telah disedut, dan sel-sel telah dibasuh dengan PBS dan dipindahkan ke mikroskop terbalik untuk melihat perubahan dalam keamatan pendarfluor. Panjang gelombang pengujaan ialah 549 nm, dan cahaya pancaran ialah 579 nm. Keamatan pendarfluor merah menunjukkan perubahan ∆Ψm, n > 20 sel setiap kumpulan.

3.16. Eksperimen Penyetempatan Mitokondria dan Lisosomal

Mengikut arahan, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, China) dan Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, China) menggunakan analisis kolokalisasi mitokondria dan lisosom. NRCM dimuatkan dengan 200 nM MitoTracker Green FM dan 50 nM LysoTracker Red dalam HBSS selama 30 minit sebelum eksperimen, sel dibasuh dengan PBS, dan kemudian imej sel diperoleh menggunakan mikroskop pendarfluor Olympus FluoView FV1000. Garis laser 488 nm digunakan untuk merangsang pendarfluor Hijau MitoTracker, diukur antara 505 dan 515 nm. Untuk LysoTracker Red, garisan laser 577 nm digunakan dengan ukuran 590 nm. Tindanan intensiti piksel merah dan hijau ditentukan menggunakan perisian kuantifikasi pada Mikroskop Eclipse Nikon, n > 20 sel setiap kumpulan.

3.17. Analisis statistik

Semua data daripada kumpulan eksperimen dibandingkan menggunakan ANOVA sehala diikuti ujian pos hoc Bonferroni dengan perisian GraphPad Prism versi 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) dan perisian SPSS versi 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United). Negeri). Data dinyatakan sebagai min ± SEM dan tahap keertian ditetapkan kepada P < 0.05.

4. Keputusan

4.1. Keturunan dan Ciri Jantung

Berat badan (BW) dan berat jantung (HW) diukur, dan nisbah HW kepada BW (HW/BW) telah dikira (Rajah 1). Keputusan menunjukkan bahawa BW dan HW tikus yang baru lahir menurun, dan HW/BW mereka meningkat disebabkan oleh hipoksia intrauterin. Berbanding dengan kumpulan IUH, BW dan HW tikus neonatal dalam kumpulan SPD meningkat (P < 0.05), dan HW/BW menurun (P < 0. 05); Berbanding dengan kumpulan SPD, kedua-dua BW dan HW kumpulan rawatan DFMO menurun (P <0.05), dan HW/BW meningkat dengan ketara (P <0.05).

4.2. Kesan SPD terhadap Struktur Morfologi Miokardium, Percambahan Sel dan Fibrosisin Anak Bayi Baru Lahir Terdedah kepada

Keputusan pewarnaan HE jantung menunjukkan bahawa jantung anak sehari yang terdedah kepada IUH menunjukkan bengkak dan gentian miokardium yang tersusun longgar. Walau bagaimanapun, jantung IUH yang dirawat dengan SPD mengekalkan struktur tisu miokardium yang boleh diterima (Rajah 2A). Seterusnya, kami menilai bilangan kardiomiosit binuklear dengan kepingan tisu bernoda HE; bilangan kardiomiosit binuklear adalah lebih besar dalam kumpulan IUH berbanding kumpulan kawalan (P < 0.05). Berbanding dengan kumpulan IUH, bahagian kardiomiosit binuklear dalam kumpulan rawatan SPD menurun dengan ketara (P < 0.05); DFMO melemahkan kesan SPD (P < 0.05) (Rajah 2C). Kami selanjutnya mengesan ungkapan Ki67 (penanda pembiakan sel) dalam miokardium tikus menggunakan kaedah imunofluoresensi. Semakin tinggi ungkapan Ki67, semakin kuat pendarfluor merah jambu dengan menggabungkan merah dan biru (Rajah 2E). Keputusan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan kawalan, ungkapan Ki67 dalam kumpulan IUH menurun dengan ketara (P < 0.05), ungkapan Ki67 meningkat dengan ketara berikutan pentadbiran SPD (P < { {28}}.05), dan kesan SPD telah dimansuhkan oleh DFMO (P <0.05) (Rajah 2F). Keputusan ini menunjukkan bahawa SPD boleh menghalang pengeluaran pramatang kardiomiosit daripada kitaran sel yang disebabkan oleh IUH dan menggalakkan percambahan kardiomiosit dalam anak baru yang terdedah kepada IUH. Kemudian kami menggunakan pewarnaan Masson untuk mengesan perubahan dalam kandungan kolagen miokardium dan menilai fibrosis miokardium dengan pengukuran kawasan kolagen (Rajah 2BandD). Kami mendapati bahawa pemendapan kolagen miokardium di dalam hati tikus yang baru lahir terdedah kepada IUH meningkat (P <0.05), tahap yang lebih tinggi berbanding dengan kumpulan kawalan. Sebaliknya, kawasan fibrosis miokardium selepas rawatan SPD berkurangan dengan ketara (P <0.05). Walau bagaimanapun, berbanding kumpulan rawatan SPD, kawasan fibrosis meningkat dengan ketara dalam kumpulan HpxSpd-DFMO (P <0.05).

4.3. Kesan Spermidin pada Struktur Mitokondria Miokardium, Fungsi Pernafasan dan Kandungan Adenosin 5'-Trifosfat dalam Anak Baru Lahir Terdedah kepada Hipoksia Intrauterin

Perubahan struktur ultrastruktur tisu jantung dan ciri mitokondria telah dianalisis oleh TEM (Rajah 3A). Perisian Image J digunakan untuk mengukur peratusan kandungan mitokondria (kawasan mitokondria di seluruh kawasan sel) dan kawasan mitokondria (Rajah 3B dan C). Keputusan menunjukkan bahawa dalam kumpulan kawalan, miofilamen miokardium tersusun teratur, struktur sarkomer jelas, mitokondria padat, matriks lebih tumpat, dan krista mitokondria tersusun teratur. Walau bagaimanapun, mitokondria membengkak, dan matriks yang melonggarkan dan ketumpatan yang berkurangan diperhatikan dalam beberapa kardiomiosit kumpulan IUH. Berbanding dengan kumpulan kawalan, bahagian mitokondria dalam kardiomiosit dan kawasan mitokondria kedua-duanya berkurangan (P < 0.05). Walau bagaimanapun, dalam hati tikus rawatan SPD, miofilamen miokardium adalah kemas, struktur sarkomer adalah jelas, matriks mitokondria adalah padat, dan pembengkakan mitokondria berkurangan. Berbanding dengan kumpulan IUH, bahagian mitokondria dalam kardiomiosit meningkat (P < 0.05), dan kawasan mitokondria meningkat (P <0.05). DFMO menghalang kesan yang disebabkan oleh SPD ini (P <0.05).

Kami menggunakan piruvat/malat sebagai substrat untuk menilai fungsi pernafasan mitokondria, termasuk keadaan 3 dan 4 kadar pernafasan dan RCR (Rajah 3D - F). Kami mendapati bahawa berbanding dengan kumpulan kawalan, kadar pernafasan dalam keadaan 3 dan 4 dan RCR kumpulan IUH semuanya jauh lebih rendah (P < 0.{{10}}5). Menariknya, RCR negeri 3 dan 4 pulih selepas rawatan SPD (P < 0.05). Sebaliknya, kesan SPD ini dihalang dengan ketara dalam kumpulan rawatan DFMO (P < 0.05). Begitu juga, berbanding kumpulan kawalan, kandungan ATP miokardium dalam kumpulan IUH berkurangan dengan ketara (P <0.05). Berbanding dengan kumpulan IUH, kandungan ATP meningkat dengan ketara dalam kumpulan yang dirawat SPD (P <0.05), dan DFMO melemahkan kesan SPD (P <0.05) (Rajah 3G). Penemuan ini mencadangkan bahawa SPD boleh melindungi struktur miokardium mitokondria dan kerosakan fungsi dan menghalang penurunan tahap ATP dalam tikus neonatal yang terdedah kepada IUH.

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】