Sodium Thiosulfate-supplemented UW Solution Melindungi Cangkok Buah Pinggang Terhadap Kecederaan Reperfusi Iskemia Sejuk Berpanjangan dalam Model Murine Pemindahan Buah Pinggang Syngeneic

Kenalan: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Cistanche tubulosa menghalangbuah pinggangpenyakit, klik di sini untuk mendapatkanproduk dan Cistanche Nz

ABSTRAK

pengenalan:Kecederaan iskemia-reperfusi sejuk (IRI) adalah kejadian yang tidak dapat dielakkan yang meningkatkan komplikasi selepas pemindahan. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa suplemen penyelesaian Universiti Wisconsin (UW) dengan molekul penderma hidrogen sulfida (H2S) yang tidak diluluskan FDA meminimumkan IRI sejuk dan meningkatkan fungsi cantuman buah pinggang selepas pemindahan. Kajian ini menyiasat sama ada molekul penderma H2S yang diluluskan oleh FDA, natrium tiosulfat (STS), akan mempunyai kesan yang sama atau lebih baik dalam model tikus syngeneic orthotopic yang berkaitan secara klinikal.buah pinggangpemindahan.

Kaedah:Tiga puluh ekor tikus Lewis menjalani nefrektomi dua hala diikuti dengan pemindahan ortotopik syngeneik sebelah kiribuah pinggangselepas 24-jam pengawetan sama ada dalam larutan UW atau UW ditambah STS pada 4 ◦C. Tikus dipantau hingga hari ke-14 selepas pemindahan dan dikorbankan untuk menilai fungsi buah pinggang (pengeluaran air kencing, kreatinin serum, dan nitrogen urea darah).buah pinggangbahagian telah diwarnai dengan H&E, TUNEL, CD68, dan myeloperoxidase (MPO) untuk mengesan nekrosis tubular akut (ATN), apoptosis, penyusupan makrofaj, dan penyusupan neutrofil.

Keputusan:Cantuman UW plus STS menunjukkan fungsi cantuman yang bertambah baik dengan ketara sejurus selepas pemindahan, dengan kemandirian penerima yang lebih baik berbanding cantuman UW (p < {{0}}.05).="" pemeriksaan="" histopatologi="" mendedahkan="" pengurangan="" ketara="" atn,="" apoptosis,="" makrofaj,="" dan="" penyusupan="" neutrofil="" dan="" pengurangan="" pengawalseliaan="" gen="" pro-radang="" dan="" pro-apoptosis="" dalam="" cantuman="" uw="" ditambah="" sts="" berbanding="" dengan="" cantuman="" uw="" (p=""><>

Kesimpulan:Kami menunjukkan buat kali pertama bahawa pemeliharaan cantuman buah pinggang dalam larutan UW yang ditambah STS melindungi daripada IRI sejuk yang berpanjangan dengan menyekat laluan apoptosis dan keradangan, dan dengan itu meningkatkan fungsi cantuman dan memanjangkan kemandirian penerima. Ini boleh mewakili strategi terapeutik baru yang boleh digunakan secara klinikal untuk meminimumkan hasil klinikal yang memudaratkan IRI sejuk yang berpanjangan dalambuah pinggangpemindahan.

Kata kunci:Sodium thiosulfate (STS) Iskemia-reperfusion injury (IRI) Static cold storage (SCS)buah pinggangpemindahan Cantuman dan kemandirian penerima

1. Pengenalan

buah pinggangpemindahan adalah rawatan optimum untuk peringkat akhirbuah pinggangbuah pinggangpenyakit (ESRD). Berbanding dengan dialisis,buah pinggangpemindahan adalah unggul, kerana ia memberikan kualiti hidup yang lebih baik dan memberikan kelebihan kelangsungan hidup yang ketara bersama-sama dengan keberkesanan kosnya [1–3]. Walau bagaimanapun, perolehan buah pinggang penderma secara semula jadi dikaitkan dengan kecederaan reperfusi iskemia (IRI), akibat yang tidak dapat dielakkan daripada pemberhentian dan pemulihan aliran darah seterusnya semasa penanaman trans [4]. Strategi semasa untuk mengurangkan IRI yang disebabkan oleh pemindahan ialah penyimpanan sejuk statik (SCS) cantuman buah pinggang dalam larutan pemeliharaan standard seperti larutan Universiti Wisconsin (UW) pada ais pada suhu 4 ◦C semasa tempoh pra-pemindahan [5]. Walau bagaimanapun, SCS yang berpanjangan telah terbukti dikaitkan dengan peningkatan kematian sel, keradangan, dan peristiwa selular dan molekul lain yang merosakkan, yang akhirnya mengakibatkan peningkatan kejadian fungsi cantuman tertunda (DGF), nekrosis tubular akut (ATN) dan penurunan graf. kelangsungan hidup [6–10]. Di samping itu, untuk mengikuti peningkatan insiden ESRD di peringkat global dan bilangan pesakit yang sentiasa meningkat dalam senarai menunggu pemindahan, banyak pusat pemindahan menerima cantuman buah pinggang dengan tempoh iskemia sejuk yang berpanjangan, yang seterusnya menyumbang kepada kerosakan tisu keseluruhan. Mengikuti SCS adalah reperfusi, apabila darah beroksigen hangat dipulihkan ke dalam cantuman iskemik sejuk. Reperfusi, yang merupakan fasa efektor kecederaan iskemia, dicirikan oleh peningkatan kecederaan tisu [11-13].

Strategi terapeutik yang berpotensi untuk mengehadkan IRI sejuk semasabuah pinggangpemindahan melibatkan penambahan larutan pengawetan standard dengan hidrogen sulfida (H2S), penghantar gas yang dihasilkan secara endogen yang telah ditunjukkan memainkan peranan fisiologi yang penting dalam vasodilasi dan isyarat selular [14-16]. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa SCS yang berpanjangan dalam larutan UW yang ditambah H2S mengurangkan IRI sejuk yang disebabkan oleh pemindahan dan meningkatkan kelangsungan hidup rasuah dalam model murine pemindahan buah pinggang syngeneik dan alogenik [17-19,41, 42]. Walau bagaimanapun, molekul penderma H2S yang digunakan dalam kajian ini tidak berdaya maju secara klinikal. Ini telah membawa kepada pertimbangan untuk menggunakan natrium tiosulfat (STS), ubat penderma H2S yang diluluskan oleh Pentadbiran Makanan dan Dadah (FDA) untuk merawat calciphylaxis dalam pesakit ESRD, ketoksikan yang disebabkan oleh cisplatin dalam terapi kanser, dan sebagai penawar kepada keracunan sianida [20–23]. Kajian terkini menunjukkan bahawa STS mempamerkan kesan perlindungan dalam model haiwan IRI [24-26]. Walau bagaimanapun, kesannya terhadap IRI buah pinggang sejuk yang disebabkan oleh pemindahan tidak diketahui. Oleh itu, kajian ini menyiasat kesan renoprotektif STS dalam model in vitro IRI buah pinggang dan model tikus pemindahan buah pinggang orthotopik syngeneic.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Protokol in vitro eksperimen

Model in vitro hipoksia sejuk dan kecederaan reoksigenasi hangat yang meniru keadaan selular semasa IRI sejuk in vivo digunakan untuk menilai kesan perlindungan STS semasa IRI buah pinggang. Sel epitelium buah pinggang tikus (NRK{{0}} Talian sel E; ATCC, USA) digunakan dalam eksperimen in vitro kerana sel-sel ini terdedah kepada kecederaan iskemia [27], dan penggunaannya konsisten dengan tikus. model pemindahan yang digunakan untuk tujuan kedua kajian ini. Sel-sel telah dibiakkan dalam Modified Eagle Medium (DMEM) Dulbecco yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin (FBS) dinyahaktifkan oleh haba pada 60 ◦C selama 20 minit dan 1 peratus penisilin/streptomycin (P/S). Sel telah diinkubasi pada keadaan pertumbuhan normal 37◦C, 21 peratus O2, dan 5 peratus CO2. Sel kawalan berada dalam keadaan yang sama dengan sel pra-eksperimen. Sel-sel eksperimen telah dirawat dengan sama ada media bebas serum (SF), SF ditambah 200 nM AP39, atau SF dengan kepekatan yang berbeza-beza (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) natrium tiosulfat pentahidrat (STS), yang diperoleh daripada larutan suntikan 250 mg/mL STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Kepekatan 200 nM AP39 digunakan kerana kami sebelum ini menunjukkan bahawa AP39 pada kepekatan ini adalah sitoprotektif terhadap garis sel yang sama dalam model IRI sejuk yang serupa [20]. Sel kemudiannya diinkubasi pada 10 ◦C selama 24 jam di bawah keadaan hipoksik (5 peratus CO2, 0.5 peratus O2, 95 peratus N2) dalam kebuk hipoksia HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, Amerika Syarikat) untuk menyebabkan kecederaan iskemik sejuk. Suhu hipotermik 10 ◦C telah digunakan kerana ini adalah suhu terendah yang boleh dicapai secara teknologi sambil mengekalkan 0.5 peratus tahap O2 hipoksia. Berikutan hipoksia, media yang mengandungi sel eksperimen digantikan dengan media kawalan, dan sel-sel itu dioksigenasi semula melalui pengeraman di bawah keadaan pertumbuhan normal (37 ◦C, 21 peratus O2, dan 5 peratus CO2) selama 24 jam untuk mensimulasikan reperfusi dan kecederaan yang berkaitan. Selepas reoksigenasi 24 jam, daya maju selular dinilai melalui pewarnaan sel dengan Annexin-V terkonjugasi FITC (FITC-Annexin-V; BioLegend, Amerika Syarikat) dan 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, Amerika Syarikat ), yang mengukur apoptosis selular dan nekrosis masing-masing. Sel telah dianalisis melalui cytometry aliran menggunakan CytoFLEX S (Beckman Coulter, Amerika Syarikat). FlowJo versi 11 (FlowJo LLC, Amerika Syarikat) telah digunakan untuk mendapatkan data yang sesuai untuk analisis statistik.

2.2. Haiwan eksperimen

Tiga puluh tikus Lewis jantan seberat 275–300 g dan dibeli dari Sungai Charles (St. Constant, QC, Kanada) ditempatkan di kemudahan Perkhidmatan Penjagaan Haiwan dan Veterinar di Western University (London, ON) di bawah keadaan standard. Kajian haiwan telah diluluskan oleh Western University Council on Animal Care and Animal Use dengan protokol ID 2018–155.

2.3. Model pemindahan buah pinggang

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 peratus penurunan berat badan) atau kematian. Titik akhir yang berperikemanusiaan telah diperiksa dua kali sehari dan semua tikus telah dimatikan oleh pendedahan CO2 di dalam ruang pada kadar aliran 40 peratus. Pada masa euthanasia, tiada komplikasi pembedahan yang boleh mengakibatkan variasi dalam keputusan.

2.4. Analisis fungsi buah pinggang

Selepas pemindahan buah pinggang, tikus dipantau dalam sangkar metabolik selama 14 hari dan kemudian dikorbankan. Sampel darah dan air kencing dikumpul pada POD 3, 5, 7, 10, dan 14 untuk menentukan parameter fungsi buah pinggang (kreatinin serum, nitrogen urea darah [BUN], osmolaliti air kencing, dan pengeluaran air kencing). BUN dan kreatinin serum adalah daripada penerima pemindahan buah pinggang dan tikus yang dikendalikan Sham diukur menggunakan mesin IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON). Tahap osmolaliti air kencing ditentukan oleh osmometri titik beku menggunakan mesin 3320 Osmometer (Instrumen Lanjutan, Norwood, MA) dan dibandingkan dengan piawaian yang disediakan oleh syarikat.

2.5. Analisis histopatologi dan morfometrik

Tisu buah pinggang yang dibenamkan parafin dipotong kepada bahagian setebal 4 µm dan dipasang pada slaid mikroskopik untuk histologi. Bahagian tersebut telah diwarnai dengan Hematoxylin dan Eosin (H&E), Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) untuk menentukan tahap ATN dan apoptosis masing-masing. Bahagian H&E telah diberikan skor untuk ATN oleh pakar patologi buah pinggang yang buta mengikut skema berikut: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 peratus rasuah ATN. Bahagian buah pinggang juga diwarnai dengan antibodi utama berikut: penanda kecederaan buah pinggang (KIM-1), penanda permukaan makrofaj CD68 dan enzim myeloperoxidase khusus neutrofil (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) dan divisualisasikan dengan antibodi sekunder dan Kromogen substrat DAB menggunakan Sistem Dako Envision (Dako, Glostrup, Denmark) mengikut protokol pengilang diikuti dengan dianalisis di bawah mikroskop cahaya digital Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) pada pembesaran 10x dan dikira oleh perisian ImageJ v. 1.8 (Nasional Institut Kesihatan, Bethesda, MD).

2.6. Analisis PCR kuantitatif

Jumlah RNA telah diasingkan daripada tisu cantuman buah pinggang yang diperolehi di POD 3 menggunakan RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) dan ditranskripsi terbalik ke dalam cDNA menggunakan Kit sintesis cDNA OneScript® Plus (ABM, Kanada) bersama-sama dengan oligo(dT)12– 18 primer mengikut protokol pengeluar. RNA dan cDNA terpencil telah dianalisis melalui nanodrop (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Kanada) sebelum digunakan, dengan penilaian A260/280 secara konsisten masing-masing > 1.95 dan > 1.8. Campuran tindak balas setiap sampel qPCR mempunyai isipadu 20 µL dan dibuat mengikut protokol Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) dan dianalisis menggunakan mesin Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata CFX Connect (Bio-Rad, Kanada) . Urutan primer direka bentuk menggunakan perisian Primer-BLAST (NCBI) terhadap beta-actin, poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), interferon-gamma (IFN-), tumor necrosis factor-alpha (TNF-), interleukin 6 (IL). -6), limfoma sel B 2 (Bcl-2), Bcl-2- protein X berkaitan (BAX), caspase 3, agonis kematian domain berinteraksi BH3 (BID), c-Jun N-terminal kinase 1/2 (JNK1/2), Pparg coactivator 1 alpha (PGC-1 ), mitokondria kompleks I (NDUFB8), mitokondria kompleks II (SDHB), mitogen-activated protein kinase 1/2 (ERK1 /2), neutrophil gelatinase lipocalin (NGAL) dan gen molekul kecederaan buah pinggang-1 (KIM-1). Semua gen yang diminati telah dinormalisasi terhadap beta-aktin. Perubahan lipatan ekspresi gen dibandingkan dengan tikus yang dikendalikan Sham dan dikira menggunakan kaedah ΔΔCt.

2.7. Analisis statistik

Semua analisis statistik telah dijalankan menggunakan pakej perisian statistik Prism GraphPad (La Jolla, CA), versi 9.0. Data kelangsungan hidup dianalisis menggunakan analisis kelangsungan hidup Kaplan-Meier dan ujian peringkat log manakala data ekspresi gen qPCR dianalisis menggunakan ujian-t sehala yang tidak berpasangan. Semua data lain dianalisis menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan ujian post-hoc Tukey untuk menentukan perbezaan statistik antara kumpulan. Kepentingan statistik telah diterima pada p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Keputusan

3.1. Media bebas serum yang ditambah STS meningkatkan kemandirian sel epitelium tiub renal semasa hipoksia/reoksigenasi sejuk

Analisis sitometri aliran selepas pewarnaan untuk apoptosis dan nekrosis menunjukkan bahawa sel NRK{{0}}E yang dirawat dengan SF semasa IRI sejuk in vitro menunjukkan daya tahan sel menurun dengan ketara berbanding sel kawalan (normoxic) (Rajah 1A; p < 0.05).="" walaupun="" semua="" sampel="" eksperimen="" menunjukkan="" daya="" maju="" sel="" epitelium="" tiub="" renal="" yang="" jauh="" lebih="" rendah="" daripada="" sel="" yang="" ditanam="" dalam="" keadaan="" normoksik="" (p="">< 0.05),="" sel="" yang="" dirawat="" dengan="" sf="" ditambah="" dengan="" 150="" µm="" dan="" 500="" µm="" sts="" menunjukkan="" daya="" maju="" yang="" lebih="" tinggi="" daripada="" yang="" dirawat.="" dengan="" media="" sf="" sahaja="" (rajah="" 1a;="" p=""><0.05), yang="" sepadan="" dengan="" apoptosis="" yang="" berkurangan="" dengan="" ketara="" berbanding="" sel="" yang="" dirawat="" dengan="" media="" sf="" sahaja="" (rajah="" 1b;="" p=""><0.05). selain="" itu,="" peningkatan="" daya="" maju="" sel="" dan="" penurunan="" dalam="" apoptosis="" nampaknya="" mencapai="" tahap="" optimum="" dengan="" 150="" µm="" dan="" 500="" µm="" sts,="" kerana="" dos="" yang="" lebih="" tinggi="" membalikkan="" arah="" aliran="" ini="" (rajah="" 1a="" dan="">

3.2. Penambahan larutan UW dengan STS meningkatkan kemandirian dan fungsi cantuman buah pinggang awal

Pemeliharaan cantuman buah pinggang dalam larutan UW yang ditambah STS telah meningkatkan kemandirian penerima dengan ketara dengan 83 peratus kelangsungan hidup sehingga POD 14 (hari pengorbanan) berbanding kumpulan kawalan tanpa suplemen STS, yang menunjukkan 12.5 peratus kelangsungan hidup, terutamanya dalam 3 hari pertama (Rajah 1). 2A; p < 0.05).="" di="" samping="" itu,="" suplemen="" sts="" telah="" meningkatkan="" fungsi="" rasuah="" dengan="" ketara="" semasa="" tempoh="" awal="" selepas="" pemindahan="" berbanding="" dengan="" rawatan="" uw="" sahaja.="" tahap="" kreatinin="" dan="" bun="" serum="" meningkat="" dengan="" ketara="" dalam="" kedua-dua="" kumpulan="" uw="" dan="" uw="" serta="" sts="" pada="" pod="" 3,="" yang="" dikaitkan="" dengan="" penurunan="" osmolaliti="" air="" kencing="" berbanding="" sham="" (rajah="" 2b,="" c,="" dan="" 3a;="" p="">< 0.{{25="" }}5).="" walau="" bagaimanapun,="" tahap="" kreatinin="" serum="" dan="" bun="" dalam="" kumpulan="" uw="" ditambah="" sts="" menurun="" dengan="" ketara="" pada="" pod="" 3="" dengan="" peningkatan="" yang="" sepadan="" dalam="" osmolaliti="" air="" kencing="" berbanding="" kumpulan="" uw="" (rajah="" 2b,="" c="" dan="" 3a;="" p=""><0.05). menariknya,="" tahap="" kreatinin="" serum="" dan="" bun="" dalam="" kumpulan="" uw="" ditambah="" sts="" menurun="" secara="" berterusan="" daripada="" pod="" 3="" kepada="" pod="" 14="" dengan="" peningkatan="" osmolaliti="" air="" kencing="" dan="" setanding="" dengan="" sham="" (rajah="" 2b,="" c,="" dan="" 3a).="" juga,="" pengeluaran="" air="" kencing="" dalam="" kumpulan="" uw="" ditambah="" sts="" adalah="" lebih="" tinggi="" dengan="" ketara="" semasa="" empat="" hari="" pertama="" selepas="" operasi="" berbanding="" kumpulan="" uw="" dan="" sham="" (rajah="" 3b;="" p=""><0.05). walau="" bagaimanapun,="" ia="" menurun="" secara="" berterusan="" ke="" arah="" nilai="" garis="" dasar="" (sham)="" dan="" setanding="" dengan="" nilai="" sham="" pada="" pod="" 14="" manakala="" pengeluaran="" air="" kencing="" dalam="" tikus="" yang="" masih="" hidup="" dalam="" kumpulan="" uw="" kekal="" lebih="" tinggi="" daripada="" nilai="" garis="" dasar="" pada="" pod="" 14="" (rajah="">

3.3. Penambahan STS kepada penyelesaian UW mengurangkan kematian sel yang disebabkan oleh pemindahan selepas pemindahan buah pinggang

Bahagian buah pinggang yang diperolehi pada POD 3 dan 14 telah diwarnai dengan TUNEL sebagai ukuran kematian sel apoptosis dan dijaringkan oleh ahli patologi buah pinggang yang buta (Rajah 4A). Cantuman buah pinggang daripada kumpulan UW menunjukkan kematian sel apoptosis yang jauh lebih tinggi pada POD 3 seperti yang ditunjukkan oleh skor TUNNEL yang lebih tinggi berbanding dengan buah pinggang daripada kumpulan UW ditambah STS dan Sham (Rajah 5A dan b; p < 0.{{11}="" }5).="" graf="" daripada="" kumpulan="" uw="" tambah="" sts="" tidak="" jauh="" berbeza="" berbanding="" dengan="" sham="" pada="" titik="" masa="" yang="" sama="" dan="" pada="" pod="" 14="" (rajah="" 4b).="" selain="" itu,="" sementara="" cantuman="" daripada="" kedua-dua="" kumpulan="" uw="" dan="" uw="" plus="" sts="" menunjukkan="" skor="" atn="" yang="" meningkat="" dengan="" ketara="" pada="" pod="" 3="" berbanding="" kumpulan="" sham="" (rajah="" 5;="" p="">< 0.05),="" cantuman="" uw="" plus="" sts="" menunjukkan="" penurunan="" skor="" atn="" pada="" pod="" 3="" berbanding="" uw="" (rajah="" 5;="" p=""><0.05). selain="" itu,="" manakala="" penerima="" cantuman="" uw="" tidak="" bertahan="" sehingga="" pod="" 14,="" dan="" oleh="" itu="" skor="" atn="" mereka="" tidak="" dapat="" ditentukan="" pada="" pod="" 14,="" graft="" uw="" plus="" sts="" terselamat="" kepada="" pod="" 14="" tetapi="" menunjukkan="" skor="" atn="" meningkat="" dengan="" ketara="" berbanding="" kumpulan="" sham="" (rajah).="" 5;="" p=""><>

3.4. Cantuman buah pinggang yang dipelihara dalam larutan UW yang ditambah STS menunjukkan penurunan penanda kecederaan dan infiltrat keradangan selepas pemindahan buah pinggang

Bahagian buah pinggang yang diperoleh pada POD 3 dan 14 telah diwarnai dengan KIM-1 untuk mengesan kecederaan tiub proksimal serta CD68 (penanda makrofaj) dan MPO (penanda neutrofil) dan dijaringkan oleh ahli patologi buah pinggang yang buta (Rajah 6A, 7A, dan C). Ekspresi tisu buah pinggang KIM-1, CD68 dan MPO jauh lebih tinggi dalam kumpulan UW pada POD 3 berbanding kumpulan UW ditambah STS dan Sham (Rajah 6B, 7B dan D; p < {{11}="" }.05)="" manakala="" ungkapan="" penanda="" ini="" dalam="" cantuman="" uw="" ditambah="" sts="" tidak="" jauh="" berbeza="" berbanding="" dengan="" sham="" pada="" pod="" 14="" (rajah="" 6b,="" 7b="" dan="" d;="" p=""> 0.05).

3.5. Suplemen STS kepada larutan UW menindas ekspresi buah pinggang gen pro-radang, pro-apoptosis, dan mitokondria

Ekspresi gen penanda pro-radang, pro-apoptosis, sasaran mitokondria dan kecederaan buah pinggang ditentukan melalui qRT-PCR dalam buah pinggang yang dipindahkan yang diperolehi pada POD 3. Ekspresi gen pro-radang IFN- , TNF- dan IL{{8 }} telah meningkat dengan ketara dalam cantuman UW berbanding cantuman UW plus STS pada POD 3 (Rajah 8A; p < 0.05)="" dan="" mengikuti="" corak="" yang="" sama="" dengan="" gen="" pro-apoptosis="" parp,="" bax="" ,="" caspases-3,="" bid,="" jnk1="" dan="" jnk2="" (rajah="" 8a;="" p="">< 0.05)="" manakala="" ungkapan="" bcl="" anti-apoptosis-2="" meningkat="" sedikit="" dalam="" uw="" ditambah="" kumpulan="" sts="" berbanding="" kumpulan="" uw,="" walaupun="" peningkatan="" ini="" tidak="" mencapai="" kepentingan="" statistik="" (rajah="" 8a).="" selain="" itu,="" ekspresi="" gen="" mitokondria="" pgc-1="" ,="" ndufb8="" (kompleks="" i)="" dan="" sdhb="" (kompleks="" ii)="" dalam="" cantuman="" uw="" telah="" berkurangan="" dengan="" ketara="" berbanding="" cantuman="" uw="" tambah="" sts="" (rajah="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" manakala="" sebaliknya="" diperhatikan="" dengan="" ungkapan="" erk1="" dan="" erk2="" (rajah="" 8b;="" p="">< 0.05).="" tambahan="" pula,="" ekspresi="" gen="" kim-1="" dalam="" cantuman="" uw="" telah="" meningkat="" dengan="" ketara="" berbanding="" dengan="" cantuman="" uw="" plus="" sts="" (rajah="" 8c;="" p=""><0.05) manakala="" ekspresi="" ngal="" yang="" menurun="" dalam="" cantuman="" uw="" ditambah="" sts="" tidak="" mencapai="" kepentingan="" statistik="" berbanding="" dengan="" yang="" dalam="" cantuman="" uw="" (rajah="" 8c;="" p=""> 0.05).

4. Perbincangan

Kajian ini mewujudkan tambahan penyelesaian pemeliharaan standard dengan STS, penderma H2S yang diluluskan oleh FDA yang berdaya maju secara klinikal, untuk mengurangkan IRI buah pinggang sejuk yang disebabkan oleh pemindahan, meningkatkan kualiti cantuman dan memanjangkan kemandirian penerima. Menggunakan model in vitro IRI buah pinggang dan model tikus pemindahan buah pinggang ortotopik syngeneik, kami menunjukkan buat kali pertama bahawa suplemen penyelesaian UW dengan STS semasa SCS yang berpanjangan adalah untuk dan pelindung organ.

Penemuan utama dalam model in vitro kami ialah suplemen STS kepada media bebas serum melindungi sel epitelium buah pinggang daripada hipoksia sejuk dan apoptosis yang disebabkan oleh reoksigenasi hangat dan meningkatkan daya maju, yang konsisten dengan kajian terdahulu kami di mana kami menunjukkan kesan perlindungan mitokondria. -mensasarkan ubat penderma H2S, AP39, dalam model in vitro IRI buah pinggang sejuk [20]. Menariknya, kepekatan STS yang lebih tinggi sebanyak 1 mM membalikkan kesan berfaedah, membayangkan bahawa STS mempamerkan fenomena tindak balas dos biphasic yang dirujuk sebagai hormesis, di mana kepekatan yang lebih rendah adalah sitoprotektif manakala kepekatan yang lebih tinggi adalah sitotoksik. Kerosakan mitokondria adalah akibat utama IRI buah pinggang, kerana kebolehtelapan mitokondria boleh menghalang pengeluaran adenosin trifosfat (ATP) dan meningkatkan pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS), mediator yang merosakkan kecederaan tisu [13]. Baru-baru ini telah dicadangkan bahawa mitokondria adalah tapak utama aktiviti STS. STS bukan sahaja diketahui menjana H2S dalam mitokondria melalui pengurangan bergantung kepada glutation dan sebaliknya melalui laluan pengoksidaan sulfida, tetapi juga mengekalkan sintesis ATP mitokondria, mengurangkan pengeluaran ROS, dan meningkatkan aktiviti enzim kompleks dalam rantai pengangkutan elektron (ETC) [24]. ,28–30]. Selain itu, kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa STS meningkatkan ekspresi PGC-1 dengan ketara, pengawal selia positif biogenesis mitokondria dan pengeluaran ATP [26], yang selaras dengan pemerhatian in vivo kami. Mekanisme molekul ini boleh menyumbang kepada peningkatan ketara kompleks ETC mitokondria I dan II (NDUFB8 dan SDHB masing-masing) dalam model pemindahan buah pinggang kami dengan peningkatan kelangsungan hidup dan fungsi seperti yang diperhatikan dalam cantuman buah pinggang yang dipelihara dalam larutan UW yang ditambah STS.

Berdasarkan keputusan in vitro kami, kami memutuskan untuk menyiasat sama ada kesan perlindungan STS boleh digunakan dalam vivo menggunakan model pemindahan di mana IRI sejuk merupakan penyumbang utama kepada disfungsi rasuah dan peningkatan komplikasi selepas pemindahan. Penemuan kami menunjukkan bahawa SCS cantuman buah pinggang yang berpanjangan (24 jam) dalam larutan UW yang ditambah STS dengan ketara meningkatkan kualiti dan fungsi cantuman yang dicirikan oleh penurunan kreatinin serum dan paras BUN, pengeluaran air kencing yang lebih tinggi, dan kelangsungan hidup penerima yang berpanjangan berbanding dengan cantuman yang dipelihara dalam larutan UW sahaja. . Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kesegeraan pengeluaran air kencing walaupun selepas pemindahan buah pinggang klinikal adalah hasil kritikal yang menentukan sama ada dialisis diperlukan untuk menangani fungsi rasuah tertangguh (DGF). Oleh itu, pemerhatian kami bahawa STS meningkatkan pengeluaran air kencing sejurus selepas pemindahan dan setanding dengan kumpulan Sham pada POD 14 adalah penemuan yang menjanjikan. Peningkatan yang diperhatikan dalam fungsi buah pinggang selepas pemindahan graf yang dipelihara dalam larutan UW yang ditambah STS juga memberikan kelebihan kelangsungan hidup yang ketara. Secara kuantitatif, suplemen STS memanjangkan hayat cantuman sehingga 83 peratus (5/6) tikus yang menerima cantuman UW ditambah STS bertahan sehingga POD 14 (hari pengorbanan) berbanding hanya 12.5 peratus (1/8) tikus penerima cantuman yang diawet dalam larutan UW tanpa suplemen STS. Dapatan daripada kajian ini juga sejajar dengan kajian terdahulu kami, di mana hanya 14 peratus (1 daripada 7) tikus penerima rasuah telah dipelihara dalam larutan UW selama 24 jam tanpa suplemen H2S (GYY4137), bertahan sehingga POD 14 [20] .

Di samping menunjukkan peningkatan dalam parameter fungsi buah pinggang, suplemen STS juga menghalang apoptosis dan keradangan cantuman buah pinggang dengan merendahkan ekspresi tisu gen pro-apoptosis dan pro-radang sambil serentak mengawal selia gen anti-apoptosis dan mengurangkan CD68-makrofaj positif dan Neutrofil positif MPO, yang kesemuanya mengakibatkan pengurangan ekspresi KIM-1 dan ATN dan akhirnya mengekalkan morfologi buah pinggang. Sitokin inflamasi ini diketahui sebagai mediator kematian sel semasa IRI sejuk [31], dan pengurangannya dalam cantuman UW ditambah STS berkemungkinan disebabkan oleh ciri STS yang terkenal untuk mengurangkan kebolehtelapan endothelial dalam monolayer endothelial vaskular, melemahkan pengeluaran sitokin. , dan menimbulkan pengeluaran sitokin anti-radang [32]. Selain itu, dapatan kami bahawa suplemen STS kepada larutan UW mengecilkan ekspresi gen pro-radang sepadan dengan kajian terdahulu mengenai aktiviti anti-radang STS dengan mengurangkan tahap TNF- dan IL-6 dalam penyakit neurologi [33 ,34]. Secara mekanikal, STS menyahaktifkan caspase-3 dengan melekat pada tapak aktifnya melalui ikatan hidrogen yang kuat dan dengan itu menghalang akses substrat semula jadi ke tapak aktif, akhirnya menghentikan apoptosis [35]. STS juga menyekat pengaktifan JNK, protein yang memainkan peranan penting dalam isyarat apoptosis [35], yang menyokong penemuan kami mengenai kesan pengurangan STS pada caspase3 dan JNK. Walau bagaimanapun, kami tidak dapat menentukan sama ada mekanisme tersebut beroperasi dalam kajian ini kerana kami tidak melakukan eksperimen tambahan untuk meneroka mekanisme molekul ini.

Had utama percubaan in vitro kami ialah cabaran teknikal kami menggunakan suhu pemeliharaan standard semasa 4 ◦C [36], kerana 10 ◦C yang kami gunakan adalah suhu terendah yang boleh dicapai secara teknologi tanpa menjejaskan persekitaran hipoksik. Ini adalah perbezaan yang nyata dalam hal proses fisiologi selular dan juga dalam teknik pemeliharaan. Penyelesaian yang berpotensi adalah menggunakan hipoksia yang disebabkan oleh kimia dalam beg plastik dan meletakkannya di dalam peti sejuk 4 ◦C untuk mencerminkan tetapan klinikal SCS. Walau bagaimanapun, beg penjanaan suasana anaerobik ini direka untuk digunakan pada suhu hangat (21–37 ◦C) kerana sebatian kimia yang mendorong persekitaran hipoksik berfungsi di bawah keadaan tersebut. Kajian masa depan harus bertujuan untuk mengoptimumkan suhu dalam ruang hipoksia untuk meniru tetapan SCS klinikal. Mencapai suhu konsisten 4 ◦C tanpa menjejaskan persekitaran hipoksik akan membolehkan kita menentukan sama ada fenotip yang diperhatikan dalam model IRI sejuk in vitro eksperimen dinyatakan secara konsisten. Selain daripada eksperimen in vitro, model pemindahan tikus kami juga bukan tanpa kelemahan. Kami melakukan pemindahan buah pinggang syngeneik (penderma dan penerima yang serupa secara genetik dengan keserasian imunologi), yang hanya terpakai kepada kembar seiras dalam pemindahan buah pinggang klinikal, manakala kebanyakan pemindahan buah pinggang klinikal adalah alogenik (penderma dan penerima yang berbeza secara genetik). Transplantasi alogenik memaksa penerima pemindahan menjalani ujian imunologi sebelum pemindahan untuk mengenal pasti antigen leukosit manusia penderma (HLA; molekul yang mendorong dan mengawal tindak balas imun), menentukan keserasian imunologi antara penderma dan penerima, dan mengelakkan penolakan organ [37,38]. Kajian masa depan menggunakan STS harus mempertimbangkan pemindahan alogenik. Satu lagi model pemindahan buah pinggang had adalah fakta bahawa kami memberi tumpuan kepada penderma hidup, cantuman sub-optimum daripada pendermaan selepas kematian jantung (DCD) menjadi semakin biasa sebagai sumber buah pinggang penderma di banyak pusat pemindahan di seluruh dunia [39]. DCD mendedahkan organ penderma kepada pelbagai tempoh iskemia hangat sebagai tambahan kepada masa iskemia sejuk semasa SCS, dan dikaitkan dengan peningkatan kadar DGF dan penurunan kelangsungan hidup rasuah berbanding penderma hidup [40]. Oleh itu, kajian masa depan harus mempertimbangkan model pemindahan buah pinggang DCD untuk menilai kesan STS terhadap IRI dalam model ini.

Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa suplemen penyelesaian pemeliharaan standard dengan ubat penderma H2S yang berdaya maju secara klinikal semasa SCS cantuman buah pinggang yang berpanjangan melindungi daripada IRI buah pinggang sejuk yang disebabkan oleh pemindahan, meningkatkan kualiti keseluruhan cantuman dan fungsi cantuman, dan memanjangkan kemandirian penerima pemindahan. Memandangkan risiko DGF meningkat dengan masa iskemia sejuk yang berpanjangan dalam pemindahan buah pinggang klinikal, yang menimbulkan kebimbangan klinikal utama, pemerhatian bahawa STS melindungi cantuman buah pinggang semasa SCS yang berpanjangan dan menghalang DGF selepas pemindahan memberikan janji klinikal yang hebat yang boleh mengurangkan atau menghalang kejadian DGF dalam pemindahan buah pinggang klinikal dalam masa terdekat. Oleh itu, faedah masa depan dengan menambahkan STS kepada penyelesaian pemeliharaan mungkin memberikan penyelesaian yang berpotensi untuk isu yang berterusan ini. Secara keseluruhannya, kajian ini menambah kepada badan kesusasteraan yang semakin meningkat yang menyokong kesan sitoprotektif STS dan penderma H2S lain terhadap IRI organ, terutamanya meningkatkan hasil cantuman dalam IRI buah pinggang sejuk yang disebabkan oleh pemindahan. Strategi ini boleh memudahkan penggunaan lebih banyak cantuman yang terdedah kepada masa iskemia sejuk yang berpanjangan, yang boleh meningkatkan kumpulan organ boleh tanam trans.

penyata sumbangan pengarang CRedit

Semua penulis telah bersetuju dengan penyerahan manuskrip ini. Tiada konflik kepentingan.

Rujukan

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Perbandingan kematian dalam semua pesakit dialisis, pesakit dialisis menunggu pemindahan, dan penerima pemindahan kadaver pertama, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., Kajian sistematik: pemindahan buah pinggang berbanding dengan dialisis dalam hasil yang berkaitan secara klinikal, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Keberkesanan kos pemindahan buah pinggang dari DCD di Itali, Pemindahan. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Iskemia- kecederaan reperfusi, Eur. J. Trauma Muncul. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Pemeliharaan organ: konsep semasa dan strategi baharu untuk dekad seterusnya, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Iskemia sejuk dan pengurangan kemandirian jangka panjang allograf buah pinggang kadaver, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Kesan utama fungsi cantuman tertunda dan masa iskemia sejuk pada survival allograft buah pinggang, Nephrol. Dail. Pemindahan. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Kesan masa iskemia sejuk terhadap kelangsungan hidup rasuah di kalangan penerima pemindahan ECD: analisis buah pinggang berpasangan, Am. J. Pemindahan. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Faktor risiko penerima yang dikaitkan dengan fungsi cantuman tertunda: analisis buah pinggang berpasangan, Transplantasi 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Setiap jam tambahan masa iskemia sejuk dengan ketara meningkatkan risiko kegagalan rasuah dan kematian berikutan pemindahan buah pinggang, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Antioksidan sasaran mitokondria: perspektif masa depan dalam kecederaan reperfusi iskemia buah pinggang, Oxid. Med. Sel Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Tekanan oksidatif yang disebabkan oleh kelebihan kalsium mitokondria, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Peranan mitokondria dalam kecederaan iskemia/reperfusi, Transplantasi 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Kemunculan peranan penghantar gas dalam pemindahan buah pinggang, Am. J. Pemindahan. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hidrogen sulfida dan isyarat sel: pemain pasukan atau pengadil? Fisiol Tumbuhan. Biokim. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Kesan vasorelaxant H(2)S sebagai pembuka saluran K(ATP) gas endogen novel, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Rawatan hidrogen sulfida mengurangkan kecederaan iskemia-reperfusi allograft buah pinggang semasa penyimpanan sejuk dan meningkatkan fungsi buah pinggang pemindahan awal dan kelangsungan hidup berikutan pemindahan buah pinggang alogenik, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Hidrogen sulfida tambahan melindungi fungsi buah pinggang pemindahan dan memanjangkan kemandirian penerima selepas kecederaan reperfusi iskemia sejuk yang berpanjangan dengan mengurangkan apoptosis graf buah pinggang dan keradangan, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Hidrogen Sulfida melindungi cantuman buah pinggang terhadap kecederaan iskemia-reperfusi sejuk yang berpanjangan melalui tindakan mitokondria tertentu, Am. J. Pemindahan. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Natrium tiosulfat untuk keracunan sianida akut: kajian dalam model tikus, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Sodium thiosulfate melindungi daripada kerosakan buah pinggang berikutan kemoterapi intraperitoneal hipertermik (HIPEC) dengan Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.