Kecil Tetapi Perkasa—Exosomes, Novel Intercellular Messengers dalam Neurodegeneration Bahagian 1

Ringkasan ringkas:

Exosom ialah nanopartikel biologi yang baru-baru ini diiktiraf sebagai utusan antara sel. Mereka mengandungi kargo lipid, protein, dan RNA. Mereka boleh memindahkan kandungan mereka kepada bukan sahaja sel di sekitar tetapi juga ke sel pada jarak jauh.

Exosom ialah alat komunikasi antara sel yang baru ditemui yang boleh melepaskan vesikel kecil dan halus ke sel sekeliling, menghantar beberapa protein, bahan isyarat dan bahan lain ke sel sekeliling. Bahan ini boleh membantu sel mengubah keadaan mereka dan juga menjejaskan pertumbuhan, perkembangan, metabolisme dan aspek lain sel lain. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, kajian telah menunjukkan bahawa eksosom memainkan peranan penting dalam fungsi otak manusia, terutamanya dalam penyelenggaraan dan peningkatan ingatan.

Pertama, eksosom boleh menggalakkan penghantaran isyarat antara neuron. Penghantaran maklumat antara neuron adalah salah satu syarat yang diperlukan untuk operasi normal sistem saraf, dan eksosom memainkan peranan sebagai utusan, yang boleh menjadikan penghantaran maklumat antara neuron lebih lancar, dengan itu meningkatkan kognisi dan ingatan otak.

Kedua, eksosom juga boleh mengawal metabolisme neuron. Dalam proses neuron menghasilkan dan melepaskan eksosom, sejumlah besar proses metabolik terlibat, yang menggalakkan keseimbangan dan peraturan metabolisme sel. Proses-proses ini bukan sahaja dapat meningkatkan keupayaan neuron tetapi juga membantu untuk membuang sisa metabolik dan molekul berbahaya dan memastikan sel-sel otak sihat.

Akhirnya, eksosom juga boleh membantu neuron membaiki kerosakan. Banyak protein dan asid nukleik yang dibawa oleh eksosom bermanfaat untuk pertumbuhan sel, pembaikan dan penjanaan semula, dan boleh menggalakkan pembaikan dan penjanaan semula neuron, dengan itu meningkatkan keupayaan kelangsungan hidup sel-sel otak dan menguatkan pusat ingatan dan kebolehan kognitif.

Secara ringkasnya, terdapat hubungan rapat antara eksosom dan ingatan. Kita boleh mengubah ingatan anak-anak dengan bermula dengan diet. Secara aktif membimbing struktur pemakanan kanak-kanak dan makan lebih banyak makanan yang kaya dengan bahan berfaedah seperti asid lemak, protein dan vitamin boleh menggalakkan penghasilan dan pembebasan eksosom, dengan itu membantu kanak-kanak meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan mereka. Kanak-kanak juga boleh diberikan beberapa permainan dan latihan latihan otak untuk mencabar dan melatih pemikiran mereka, merangsang potensi eksosom, dan memainkan peranan yang lebih baik. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche boleh meningkatkan ingatan dengan ketara kerana Cistanche adalah bahan perubatan tradisional Cina dengan banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan Cistanche berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid tannic, polisakarida, glikosida flavonoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik Tahu untuk meningkatkan ingatan jangka pendek

Keupayaan unik ini memperkasakan mereka untuk memodulasi fisiologi sel penerima. Di dalam otak, eksosom memainkan peranan dalam penyakit neurodegeneratif seperti penyakit Alzheimer Penyakit Parkinson, dan amyotrophic lateral sclerosis.

Abstrak:

Eksosom asal endosom ialah satu kelas vesikel ekstraselular yang penting dalam komunikasi antara sel. Eksosom dikeluarkan oleh semua sel dalam badan kita dan kargonya yang terdiri daripada lipid, protein, dan asid nukleik mempunyai jejak yang mencerminkan asal usul ibu bapanya.

Kargo eksosomal mempunyai kuasa untuk memodulasi fisiologi sel penerima di sekitar sel atau sel yang melepaskan pada jarak jauh. Memanfaatkan potensi eksosom bergantung pada kemurnian penyediaan eksosom.

Oleh itu, banyak kaedah untuk pengasingan telah dibangunkan dan kami menyediakan ringkasan ringkas beberapa kaedah. Walaupun pengasingan yang dikenakan oleh penghalang darah-otak, sel-sel dalam CNS tidak kebal daripada pengaruh pencerobohan eksosomal. Kedua-dua neuron dan exosom gliarelease, selalunya dalam cara yang bergantung kepada aktiviti.

Penerangan ringkas tentang eksosom yang dikeluarkan oleh sel yang berbeza di dalam otak dan peranannya dalam mengekalkan homeostasis CNS disediakan. Tanda ciri beberapa penyakit neurodegeneratif ialah pengumpulan agregat protein. Kajian baru-baru ini melibatkan peranan komunikator antara sel exosom dalam penyebaran protein tersalah lipat yang berkata penyebaran patologi.

Dalam ulasan ini, kami membincangkan potensi sumbangan yang dibuat oleh eksosom dalam perkembangan penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson dan amyotrophic lateralsclerosis.

Memahami sumbangan yang dibuat oleh eksosom dalam patogenesis neurodegenerationmembuka bidang untuk menggunakan eksosom sebagai agen terapeutik untuk penghantaran dadah ke otak memandangkan eksosom melintasi halangan otak darah.

Kata kunci: eksosom; neuron; sel glial; sistem saraf pusat (CNS); penyakit neurodegenerative;Penyakit Alzheimer; penyakit Parkinson; sklerosis lateral amyotrophic.

1. Pengenalan dan Perspektif Sejarah

Komunikasi antara sel sangat diminati untuk perkembangan embrio, penjanaan semula/penggantian epithelia, gametogenesis, dan pengekalan homeostasis.

Beberapa mekanisme komunikasi sel-sel seperti endositosis/eksositosis dan engulfingprotruding blebs sitoplasma telah dikenal pasti menggunakan kajian ultrastruktur dan biokimia [1-3]. Pemain lain, vesikel ekstraselular, telah dikenal pasti tetapi peranan mereka dalam komunikasi antara selular tidak dihargai serta-merta [4].

Vesikel ekstraselular ditemui secara kebetulan semasa penyiasatan mengenai pembebasan plasma-membrane-associatedenzymes, ecto-ATPase dan ecto-50-nukleotidase ke dalam medium kultur sel. Pada tahun 1981, rakan sekerja Tramsand menkultur garisan sel normal dan neoplastik tetikus dan asal manusia dalam medium bebas serum kerana serum diketahui mempunyai aktiviti pemangkin ATPase dan50-nukleotidase.

Selepas penyingkiran sel terapung dan serpihan, medium terkondisi telah disentrifugasi pada kelajuan 310,000 × g selama 90 minit dalam pemutar Spinco Ti-70 dan pelet diperiksa di bawah mikroskop elektron. Dua populasi vesikel berselubung membran ekstraselular telah ditemui, satu dengan diameter purata antara 500 dan 1000 nm dan satu lagi, populasi yang lebih kecil dengan diameter ~ 40 nm.

Vesikel ini, pada mulanya digambarkan sebagai "vesikel terkelupas" oleh pengarang, mengandungi kedua-dua 50-50-aktiviti enzimatik nukleotidase dan ATPase. Di samping itu, vesikel yang terkelupas mengandungi RNA dan fosfolipid yang berbeza daripada sel induk dan membran plasma induk, masing-masing.

Pengeraman vesikel terkelupas daripada sel glioma C6 dengan sel neuroblastoma berlabel 32P telah merangsang penyahfosforilasi protein neuroblastoma dengan pembebasan serentak fosforus radiolabel bebas (32P).

Data ini membuktikan bahawa vesikel yang terkelupas bukan sekadar pembawa sisa selular (enzim) tetapi mempunyai fungsi fisiologi. Tram dan rakan sekerja mencipta istilah eksosom untuk menggambarkan "vesikel terkelupas" [5] (lihat artikel ulasan oleh [6] untuk sejarah vesikel ekstraselular sebelum 1981). Beberapa tahun kemudian, dua kumpulan penyelidikan secara bebas mengkaji nasib reseptor transferin dalam retikulosit melalui mikroskop elektron [7-9].

Retikulosit yang matang tidak memerlukan transferin sehingga mereka kehilangan reseptor transferrin. Kedua-dua kumpulan memerhatikan bahawa retikulosit berbudaya mengeluarkan vesikel kecil ~ 50 nm diameter ke dalam ruang ekstraselular.

Vesikel kecil ini mengandungi reseptor transferin yang tidak terdegradasi. Pada tahun 1987, Johnston dan rakan sekerja menggunakan istilah exosom untuk menggambarkan vesikel kecil yang mengandungi reseptor transferrin [10]. Berikutan tahun-tahun awal ini, potensi eksosom direalisasikan sebagai utusan antara sel baru yang boleh memodulasi fisiologi sel sasaran.

Menariknya, genesis eksosom dimulakan dengan endositosis (suatu proses yang dikenal pasti pada tahun 1883; disemak oleh [3]) dalam sel dan pelepasan eksosom ke ruang intraselular menggunakan proses eksositosis. Sejak penemuan awal mereka, kini kita tahu bahawa eksosom ialah subjenis vesikel ekstraselular. asal endositik dengan julat saiz 40-160 nm diameter [11].

Kajian pengesan menunjukkan bahawa makromolekul diendositosis dalam invaginasi bersalut bulu (iaitu, bersalut clathrin) atau lubang pada permukaan sel. Invaginasi ini akhirnya terpisah dari membran plasma dan dikesan dalam sitoplasma.

Selepas kehilangan bulu (iaitu, clathrin), vesikel bersalut endositosis menjadi licin dan bercantum dengan endosom awal sama ada untuk mengitar semula dengan pantas kembali ke permukaan sel (mengitar semula endosom dalam Rajah 1) [12] atau mengalami pematangan untuk membentuk endosom lewat.

Endosom awal dan lewat bertindak sebagai "hab pengisihan" untuk mengarahkan kandungannya dengan sewajarnya: (i) untuk pengangkutan retrograde ke rangkaian trans-Golgi (iaitu, pengambilan endosom-ke-TGN) [13,14]; (ii) kepada lisosom untuk degradasi makromolekul kepada produk mudah untuk digunakan semula dalam sel [15,16]; dan/atau (iii) untuk dikitar semula ke permukaan sel melalui badan multivesikular [17].

Semasa kematangan endosom awal ke dalam endosom, membran endosom dalaman mengalami invaginasi, mengakibatkan pembentukan vesikel intraluminal (kini ditetapkan sebagai eksosom). Makromolekul khusus seperti protein sitosol, asid nukleik, dan lipid disusun menjadi eksosom yang sedang berkembang.

Endosom lewat yang dibungkus dengan eksosom dikenal pasti sebagai badan multivesikular yang berhijrah ke arah membran plasma. Selepas gabungan dengan membran plasma, badan multivesikular melepaskan eksosom ke dalam ruang ekstraselular melalui proses eksositosis (Rajah 1) [18,19]. Sebilangan besar protein yang diambil secara berurutan memainkan penentu dalam proses endositosis kepada endosom awal, pematangan endosom kepada lateendosom, dan nasib intraselular seterusnya (disemak oleh [17,18,20]).

Kepentingan protein ini diserlahkan oleh kehilangan dan/atau mutasinya yang menyebabkan pelbagai penyakit. Sebagai contoh, protein Strumpellin dan SWIP adalah sebahagian daripada kompleks WASH yang mengambil bahagian dalam pempolimeran aktin, serta pembelahan dan pengasingan endosom. Mutasi dalam gen Strumpellin menyebabkan paraplegia spastik keturunan, dicirikan oleh degenerasi neuron motor [21].

Mutasi titik tunggal (Pro1019Arg) dalam protein SWIP menjejaskan kestabilan kompleks WASH. Kompleks WASH yang tidak stabil menghalang pemerdagangan endolisosomal, menyebabkan penggumpalan endosom. Trafik endosomal yang rosak memberi kesan kepada kognisi dan fungsi motorneuron, dengan gejala yang digambarkan sebagai terencat akal bukan sindrom [22,23].

Dalam sitoplasma, eksosom berasal daripada endosom menggunakan kompleks pengisihan endosom yang diperlukan untuk pengangkutan (ESCRT), juga dikenali sebagai mekanisme biogenesis eksosom yang bergantung kepada ESCRT (disemak oleh [18,20]).

Dua kumpulan secara bebas melaporkan biogenesis eksosom yang dimediasi lipid, mekanisme bebas ESCRT. Dua lipid yang dikenal pasti dalam kajian ini ialah bis(monoacylglycero) fosfat/lysobisphos phatidic acid(BMP/LBPA) dan ceramide [29,30].

Rab31 adalah satu lagi mekanisme bebas ESCRT untuk biogenesis eksosom dalam sitoplasma. Pengaktifan Rab31 merangsang pembentukan vesikel intraluminal [31]. Terdapat satu lagi mekanisme yang pada masa ini kurang dibincangkan dan kurang diterokai.

Mekanisme ini berdasarkan pemerhatian ultrastruktur yang dibuat pada akhir 1950-an hingga 1970-an yang menunjukkan nukleus sel boleh menjadi tapak asal badan multivesikular yang dibungkus dengan vesikel kecil. Vesikel kecil yang diterangkan dalam kajian ini mungkin eksosom tetapi istilah eksosom tidak dicipta pada masa itu. Kilarski dan Jasinski memerhatikan satu proses yang dinamakan blebbing nuklear atau penyemperitan nuklear dalam sel pundi renang ikan hinggap, Perca fluviatilis L. (Rajah 2a) [24] dengan kandungan yang serupa dengan nukleolarkaryoplasma [32].

Penulis ini menyatakan bahawa gumpalan nuklear boleh dirangsang oleh penyingkiran gas dari pundi renang ikan hinggap [24]. Proses blebbing nuklear nampaknya mempunyai merit sebagai tapak asal exosom yang diperkaya dengan asid nukleik dan/orribonucleoprotein.

Gumpalan nuklear dipenuhi dengan vesikel kecil yang timbul daripada lipatan tunggal membran dalaman gumpalan nuklear (Rajah 2b), satu proses yang serupa dengan pembentukan vesikel intraluminal dalam endosom. Gumpalan nuklear yang dipenuhi dengan 'vesikel kecil' akhirnya dipisahkan daripada nukleus untuk menjadi sebahagian daripada sitoplasma (Rajah 2c).

Kilarski dan Jasinski merujuk kepada blebs nuklear sebagai badan multivesikular dalam manuskrip mereka kerana kekurangan terminologi yang lebih baik. Secara tidak sengaja, pengarang ini mungkin betul kerana kajian seterusnya melaporkan kehadiran badan multivesikular dalam nukleus sel [33]. The nuclearblebs yang dipenuhi dengan vesikel kecil mempunyai morfologi yang serupa dengan badan multivesikular yang berasal dari endosom dalam sitoplasma (Rajah 1 dan 2).

Kerana persamaan badan multivesikular nuklear dengan nukleokapsid virus, penyelidik menumpukan perhatian mereka pada virologi dan fenomena blebbing nuklear dan fungsi selularnya masih kurang diterokai [34].

Tanpa mengira mod biogenesis, eksosom terdiri daripada dwilapisan alipid dan mengandungi kandungan makromolekul yang terdiri daripada lipid, protein dan asid nukleat.

Beberapa makromolekul adalah biasa kepada eksosom yang berasal dari semua sel dan oleh itu diklasifikasikan sebagai penanda eksosom dan digunakan sebagai alat pengesahan untuk membezakan eksosom daripada vesikel ekstraselular yang lain. Makromolekul unik yang terdapat dalam exosomemelembutkan mencerminkan asal ibu bapanya dan oleh itu berkemungkinan ditetapkan sebagai biomarker.

Semua sel melepaskan eksosom ke dalam ruang ekstraselular. Dari ruang ekstraselular, eksosom mencari jalan ke dalam pelbagai cecair biologi dan mencapai sel secara tempatan dan jauh. Sel yang dikultur secara in vitro melepaskan eksosomnya ke dalam media kultur. Pengeluaran eksosom yang berterusan ke dalam ruang ekstraselular menjadikan medium kultur dan cecair biologi sebagai sumber yang kaya untuk pengasingan eksosom.

Eksosom mengandungi sejumlah besar pengekodan dan RNA bukan pengekodan, serpihan DNA genomik dua untai, dan DNA mitokondria. Trem dan rakan sekerja adalah orang pertama yang menerangkan kehadiran RNA dalam "vesikel terkelupas", campuran eksosom dan mikrovesikel.

Mereka menentukan bahawa "vesikel atau eksosom yang terkelupas" mengandungi 5% RNA [5]. Valadi dan rakan sekerja adalah yang pertama menganalisis secara sistematik inexosom yang dibungkus RNA. RNA eksosomal termasuk mRNA dan mikroRNA yang boleh diterjemahkan (miRs) [35].

MicroRNA ialah kelas RNA bukan pengekodan (ncRNAs). Panjangnya ialah ~22 nukleotida dan mengawal ekspresi gen pada peringkat pasca transkrip dengan mengikat kepada 30-kawasan yang tidak diterjemahkan bagi RNA penghantar sasaran mereka [36]. Menariknya, beberapa miRNA yang diperkaya dalam eksosom tidak dikesan dalam sel induk yang mencadangkan sistem penyisihan/pembungkusan RNA terpilih semasa biogenesis exosom [35,37].

Tidak seperti sel, eksosom mengandungi sedikit atau tiada RNA ribosom tetapi mengandungi serpihan tRNA [38]. Menyusun RNA kepada eksosom bergantung kepada (1) protein yang berkaitan dengan kompleks pembungkam (RISC) disebabkan oleh RNA, (2) motif jujukan RNA dan protein panduan, (3) penambahan nukleotida pada 30 hujung miRNA, (4) ketersediaan selular miRNA, dan (5) seramida [39,40].

Kami percaya bahawa blebbing nuklear ialah satu lagi proses selular yang membolehkan pengisihan pembezaan RNA, kompleks protein RNA, dan DNA genom ke dalam eksosom. Terdapat beberapa sebab untuk pandangan ini: (1) kandungan 'vesikel intraluminal' adalah serupa dengan karyoplasma nukleolar [32]. 'vesikel' dalam badan multisikular nuklear (MVB II) diperkaya dengan RNA, protein berasid dan asas, dan oleh itu penulis menganggap ' vesikel intraluminal sebagai tapak sintesis RNA di samping tonucleolus [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin exosomes [43–47].

Secara kebetulan, DNA genom dikesan hanya dalam eksosom yang diperolehi daripada garisan sel kanser dan bukan sel normal [47]. Sel-sel kanser mempunyai kromatin yang tidak normal akibat penyusunan semula/translokasi kromatin dan mungkin ploidi [48] yang boleh menyebabkan pemecahan genomikDNA dalam nukleus sel kanser. Serpihan DNA ini dengan mudah boleh dimasukkan ke dalam MVB jenis II (dan eksosom) yang berkembang dalam nukleus. (3) Mod biogenesis 'vesikel kecil' dalam blebs nuklear yang diterangkan oleh Kilarski dan Jasinski [24] adalah serupa dengan pembentukan vesikel intraluminal dalam endosom lewat dalam sitoplasma.

Kami amat percaya bahawa kehadiran DNA genom dalam eksosom adalah patologi dan oleh itu kehadirannya dalam eksosom boleh digunakan sebagai alat diagnostik untuk perkembangan sel abnormal (atau kanser) dalam badan. (4) Peningkatan yang bergantung kepada aktiviti dalam bilangan eksosom yang dikeluarkan oleh sel [49] adalah setanding dengan sel gas yang menunjukkan peningkatan blebbing nuklear apabila penyingkiran gas dari pundi renang ikan hinggap [24].

Baru-baru ini, protein mitokondria dan DNA dikesan dalam eksosom plasma sesetengah pesakit kanser, dan kehadirannya dikaitkan dengan keagresifan kanser [50,51].

Pecahan mitokondria sering diperhatikan dalam sel yang merosot [52,53]. Krista mitokondria yang dilepaskan daripada mitokondria yang merosot mungkin dihayati oleh badan multivesikular dan akhirnya dibungkus inexosom.

Tanggapan ini disokong oleh imej ultrastruktur sel limfoblastoid manusia dan lumen acini prostat babun yang mempunyai 'mikrovesikel' (atau eksosom) yang diperoleh daripada pecahan krista mitokondria [54].

Berdasarkan perbincangan di atas dan bukti eksperimen yang menyokong, kami mencadangkan bahawa sifat heterogen eksosom berasal daripada biogenesis jasad multivesikular dan eksosom yang berkaitan dengan lokasi subselular yang berbeza dan tidak sepenuhnya dalam sitoplasma mengikut kepercayaan semasa kami. Cadangan kami boleh menerangkan heterogeniti eksosom. serta ketidakpadanan antara pengiraan teori dan data eksperimen tentang bilangan RNA kecil atau molekul protein yang terkandung dalam satu eksosom yang disucikan daripada serum [55].

Berdasarkan pengiraan teori menggunakan purata saiz eksosom, Li dan rakan sekerja meramalkan setiap eksosom untuk menampung kira-kira 70–25,000 molekul RNA atau protein kecil.

Walau bagaimanapun, data eksperimen mereka menunjukkan kehadiran satu molekul RNA setiap exosome yang disucikan daripada serum [55]. Hipotesis kami memerlukan penerokaan lanjut mengenai blebbing nuklear, jasad multivesikular nuklear dan biogenesis eksosom yang mengandungi RNA/ribonukleoprotein yang mengandungi badan multivesikular innuklear. Lipid ialah bahagian penting membran eksosom dan diedarkan secara tidak simetri antara dua risalah membran eksosom. Komposisi lipid berbeza antara membran sel induk dan membran eksosom.

Secara amnya, lipid yang diperkaya dalam exosomemembranes ialah sphingomyelin, ceramide, kolesterol dan mikrodomain rakit lipid yang kaya dengan kolesterol, ganglioside GM3, lipid nyahtepu dan fosfatidilserin [56–58]. Protein eksosomal terdiri daripada yang biasa kepada kebanyakan eksosom serta khusus protein unik. kepada sel induk tertentu.

Kandungan protein semua eksosom secara amnya diperkaya untuk penyasaran dan protein gabungan seperti tetraspanin, integrin, chaperoneprotein, cth, protein kejutan haba (Hsp60, Hsp70, dan Hsp90), protein pemerdagangan membran HSP kecil, protein Rab, ARF GTPases, annexin, dan protein yang terlibat dalam pembentukan badan multivesikular seperti ALIX dan TSG101 [59].

Kajian yang lebih terkini mencadangkan kehadiran protein pengikat RNA yang membentuk kompleks RNA-protein dalam eksosom [38]. Beberapa proses selular yang memastikan muat naik protein ke dalam eksosom ialah (1) mekanisme ESCRT untuk protein dengan pengubahsuaian pasca terjemahan tertentu seperti ubiquitination, metilasi arginin yang dirangsang Wnt, pengoksidaan, fosforilasi, glikosilasi dan sitrulin; (2) autophagy-mediated chaperone (CMA) yang bergantung pada interaksi antara protein 71 kDa serumpun kejutan haba (HSC70) dan protein dengan motif KFERQ.

Selepas mengikat HSC70 kepada protein dengan motif KFERQ, protein disasarkan kepada badan multivesikular. Autophagy yang dimediasi oleh Chaperone biasanya beroperasi untuk degradasi protein dalam lisosom. Data yang lebih terkini menunjukkan bahawa CMA memainkan peranan dalam pelepasan eksosom dan penyebaran agregat protein yang dimediasi eksosom dalam beberapa penyakit neurodegeneratif [60-63].

Terdapat peningkatan eksponen dalam penyelidikan eksosom sejak 1990-an dan banyak data mengenai kargo eksosomal telah dihasilkan. Pangkalan data telah dicipta untuk menyediakan kompendium kargo eksosomal sebelum menjadi terlalu sukar untuk mengurus set data yang besar.

Kebolehulangan data yang diterbitkan tentang eksosom adalah satu lagi sebab kerana kebanyakan makmal menggunakan variasi kaedah berbeza yang dibangunkan untuk mengasingkan eksosom. Sebagai contoh, Vesiclepedia ialah kompendium kargo molekul yang disusun secara manual (lipid, RNA, dan protein) yang dikenal pasti dalam kelas vesikel ekstraselular yang berbeza [64]. Vesiclepedia menyediakan sumber yang berharga untuk penyelidik.

Pangkalan data Vesiclepedia tersedia secara umum dan membolehkan pengguna bertanya dan memuat turun data kargo eksosom berdasarkan kriteria carian yang dimasukkan pengguna. EV pedia, Exocarta, ExoRbase, dan EV miRNA ialah pangkalan data tambahan yang mengkatalogkan exosomalprotein dan RNA [64].

Pangkalan data didorong oleh anotasi komuniti. Datakurasi dalam pangkalan data ini diperoleh dengan mengasingkan eksosom menggunakan pelbagai teknik pengasingan berbeza yang tidak termasuk dalam pangkalan data.

Oleh itu, kandungan kargo eksosomal mungkin berbeza berdasarkan kaedah pengasingan yang digunakan, menimbulkan tahap kekaburan dalam keputusan yang dilaporkan. Untuk meningkatkan kebolehulangan dan ketelusan percubaan, set alat EV-TRACK pangkalan pengetahuan sumber terbuka telah dibangunkan. EV-TRACK merangkumi data tentang penyediaan eksosom dan pencirian eksosom [65].

Ciri utama EV-TRACK ialah EV-METRIC yang membentangkan pelaporan parameter eksperimen sebagai peratusan komponen yang dipenuhi daripada senarai sembilan [66]. Komponen ini telah diputuskan oleh konsortium EVTRACK dan dianggap perlu untuk tafsiran data yang jelas dan pengeluaran semula data eksperimen. Oleh itu, EV-METRIC direka untuk membantu penyelidik dan penyemak dalam menyediakan gambaran keseluruhan data yang menyeluruh.

2. Kaedah Semasa untuk Pengasingan Eksosom

Exosom membentangkan sumber yang kaya untuk penemuan biomarker dan untuk strategi terapeutik baru termasuk perubatan regeneratif. Yang terpenting kepada kejayaan matlamat ini ialah pengasingan eksosom tulen melalui kaedah yang boleh dihasilkan semula.

Pengasingan fungsi kompetenksosom amat kritikal untuk aplikasi terapeutik yang berpotensi. Eksosom telah disucikan daripada pelbagai cecair biologi seperti darah, plasma, cecair serebrospinal, air liur, air kencing, dan susu. Setiap cecair biologi mempunyai ciri fizikal dan kimia yang berbeza yang perlu dipertimbangkan sebelum pengasingan eksosom.

Dalam sesetengah kes, langkah berjaga-jaga khusus mungkin diperlukan untuk pengasingan eksosom. Penggunaan akhir eksosom yang telah dimurnikan adalah penentu lain yang mempengaruhi kaedah pengasingan eksosom.

Sehingga kini, beberapa kaedah pengasingan eksosom telah dibangunkan dan sebahagian daripadanya adalah berdasarkan ciri-ciri eksosom seperti saiz, ketumpatan, cas permukaan, dan protein yang berkaitan dengan permukaan eksosom (Rajah 3) [67].

Beberapa kaedah pengasingan eksosom yang digunakan pada masa ini disenaraikan dalam Jadual 1. Kebanyakannya bukan kaedah yang berdiri sendiri dan memerlukan langkah pemprosesan pasca sampel terlebih dahulu. Kaedah yang menonjol dibincangkan secara ringkas di bawah.

Rajah 3. Kaedah yang biasa digunakan untuk pengasingan eksosom dan aplikasi hilirannya. Beberapa kaedah yang dibangunkan setakat ini untuk pengasingan eksosom adalah berdasarkan ketumpatan apungannya, Skim 1, 13, dan 1.19 g/mL, kaedah ultrasentrifugasi (UC) telah diperhalusi lagi untuk mengasingkan sediaan tulen eksosom berdasarkan ketumpatan apungannya dengan ultrasentrifugasi isopycnic oversukrosa atau kecerunan ketumpatan iodixanol (DG).

Untuk mengeluarkan kandungan protein yang tinggi dalam proteinuria, kaedah ultrasentrifugasi digabungkan dengan kromatografi pengecualian saiz (SEC). Kekangan masa yang dikaitkan dengan kaedah ultrasentrifugasi membawa kepada pembangunan kaedah penapisan (UF).

Melewati sampel cair seperti medium kultur dan air kencing melalui penumpu nano atau membran mikro membenarkan penulenan eksosom. Penyumbatan membran dan pemulihan protein eksosom yang lemah menjadikan kaedah ini tidak popular untuk aplikasi hiliran seperti pengasingan RNA dan aplikasi putaran tinggi.

Kaedah lain dibangunkan untuk mengasingkan eksosom daripada dialisis penapisan hidrostatik bendalir biologi yang sangat cair (HFD *) dalam kombinasi dengan sentrifugasi. Dalam kaedah HFD, sampel didialisis melalui membran dialisis dengan potongan berat molekul 1000 kDa di bawah tekanan hidrostatik, membolehkan makromolekul yang tidak diingini dikeluarkan daripada sampel dan eksosom diperoleh semula melalui sentrifugasi.

Kaedah pemendakan eksosom berdasarkan keterlarutan atau keterserakan dan pengagregatan telah dibangunkan untuk memproses beberapa sampel secara serentak. Kit komersil untuk penulenan eksosom adalah berdasarkan strategi ini.

Dalam kaedah ini, oscites air kencing dicampur dengan polietilena glikol (PEG) 6000 atau digabungkan dengan protamin (tambah PEG35,000) dan diinkubasi sama ada semalaman atau 1 jam di atas ais.

Campuran keruh yang terhasil disentrifugasi untuk mendapatkan semula eksosom yang digunakan untuk analisis RNA dan protein hiliran. Reagen lain yang digunakan untuk pemendakan eksosom ialah (1) 0.1M natrium asetat pH 4.75 (kaedah pengasinan) (NaAc), (2)4-isipadu kali ganda aseton sejuk (−20 ◦C) ( Presipitasi Pelarut Organik PROtein dan disingkat sebagaiPROSPR), (3) dan campuran larutan PEG dan dekstran (sehingga 1.5%) (kaedah dua fasa yang membenarkan pemisahan protein daripada eksosom).

Pengenalpastian protein permukaan eksosom membawa kepada pembangunan kaedah berasaskan penangkapan immunoaffinity menggunakan antibodi kepada protein permukaan eksosom seperti Tim4, annexin, EpCAM, protein permukaan eksosom biasa, CD63, dan protein kejutan haba (interaksi pertalian). Perkaitan untuk lektin (yang mengikat glikoprotein pada permukaan eksosom) dan heparin (yang mengikat proteoglikan heparan sulfat pada permukaan eksosom) telah dieksploitasi untuk membangunkan kaedah pengasingan eksosom.

Beberapa platform seperti manik magnet, petua mikro silika monolitik yang sangat berliang, permukaan plat plastik, penapis selulosa, penapis afiniti membran, agarosesorben, dan peranti mikrobendalir telah digunakan untuk kaedah penulenan eksosom berasaskan pertalian dan ia mempunyai merit yang berbeza untuk kegunaannya dalam diagnostik, prognostik, sebagai sistem penghantaran ubat, dan pengesanan dan analisis kargo forexosomal.

Diadaptasi dengan kebenaran daripada Konoshenko MY, Lekchnov EA,Vlassov AV, Laktionov PP. Pengasingan vesikel ekstraselular: Metodologi umum dan trend terkini.Biomed Res Int. 30 Jan 2018; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Hak Cipta © 2022 Maria Yu. Konoshenko et al.

Ini ialah artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah Lesen Atribusi Creative Commons, yang membenarkan penggunaan, pengedaran, dan pengeluaran semula tanpa had dalam mana-mana medium, dengan syarat karya asal dipetik dengan betul [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com