SLC37A2, Molekul berkaitan Fosfor meningkat dalam Sel Otot Licin dalam Aorma Berkals

Kalsifikasi vaskularmerupakan sumber utamapenyakit kardiovaskularpada pesakit dengan penyakit buah pinggang kronik.Hiperfosfatemiamembawa kepada peningkatan kemasukan fosforus intraselular, yang membawa kepada peningkatan dalam sel seperti osteoblas dalam sel otot licin vaskular. PiT-1 mengangkut fosfat dalam sel otot licin vaskular. Walau bagaimanapun, mekanisme kalsifikasi vaskular tidak difahami sepenuhnya. Kajian ini menyiasat calon molekul berkaitan fosforus selain daripada PiT-1. Kami membuat hipotesis bahawa molekul berkaitan fosforus kepunyaanpembawa zat terlarut(SLC) superfamili akan terlibat dalam kalsifikasi vaskular. Hasil daripada analisis microarray DNA, kami memberi tumpuan kepada SLC37A2 dan menunjukkan bahawa ekspresi mRNA sel-sel ini meningkat pada sel otot licin aorta yang dikalsifikasi (AoSMC). SLC37A2 telah dilaporkan mengangkut kedua-dua pertukaran glukosa-6-fosfat/fosfat dan fosfat/fosfat. Analisis in vitro menunjukkan bahawa ekspresi SLC37A2 tidak terjejas oleh keradangan pada AoSMC. Ekspresi mRNA dan protein SLC37A2 meningkat dalam AoSMC yang dikalsifikasi. Dalam vivo, analisis menunjukkan bahawa ekspresi mRNA SLC37A2 dalam aortapenyakit buah pinggang yang kroniktikus telah dikaitkan dengan gen penanda osteogenik. Tambahan pula, SLC37A2 dinyatakan dalam kawasan kalsifikasi vaskular dalamtikus penyakit buah pinggang kronik. Akibatnya, kami menunjukkan bahawa SLC37A2 adalah salah satu molekul yang meningkat dengankalsifikasi vaskularin vitro dan in vivo.

Kata Kunci: SLC37A2,kalsifikasi vaskular, sel otot licin aorta,penyakit buah pinggang yang kronik, hiperfosfatemia

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK FUNGSI BUAH PINGGANG

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Sebagai bilangan pesakit denganpenyakit buah pinggang yang kronik(CKD) meningkat, bilangan pesakitmemerlukan dialisisakan meningkat juga. Kebanyakan kematian pada pesakit yang menjalanidialisisadalah disebabkan olehpenyakit jantungsepertikegagalan jantung, gangguan serebrovaskular, atau infarksi miokardium. (,2) Sumber utamapenyakit kardiovaskularadalah kalsifikasi ektopik,() kelainan yang disebabkan oleh pembentukan dan pemendapan hablur kalsium fosfat dalam tisu lembut. (4 6) Pelbagai faktor seperti keradangan. tekanan oksidatif, dan peningkatan dalam plasma kalsium (Ca) dan tahap fosforus (P) terlibat dalam perkembangan kalsifikasi vaskular. Di antara faktor-faktor ini, hiperfosfatemia paling kuat dikaitkan dengan kalsifikasi vaskular. (7.8) Hiperfosfatemia disebabkan oleh pengambilan P yang berlebihan dengan kehadiran penurunan fungsi buah pinggang. Oleh itu, pesakit yang menjalani dialisis perlu mengehadkan pengambilan P. (79-12) Walau bagaimanapun, telah dilaporkan bahawakalsifikasi vaskularsudah berkembang apabila dialisis dimulakan; ia juga telah dilihat pada pesakit dengan CKD peringkat awal apabila hiperfosfatemia tidak jelas. (3) Akibatnya, adalah penting untuk mencegah kalsifikasi vaskular pada pesakit dengan CKD peringkat awal untuk meningkatkan prognosis hayat.

yang membawa kepada peningkatan kemasukan P ke dalam sel otot licin vaskular (VSMC). Kemasukan P dilakukan melalui PiT-1, pengangkut pada permukaan membran sel VSMC. PiT- ialah ahli superfamili pembawa zat terlarut (SLC), yang termasuk pengangkut natrium fosfat yang dikodkan oleh SLC20A1.04 PiT- mengangkut fosfat merentasi membran sel yang bergantung kepada Na dan seterusnya mineralisasi matriks disebabkan oleh tahap p yang tinggi.s) Sebagai intraselular. Tahap P meningkat, VSMC mula menyatakan faktor transkripsi osteogenik, seperti faktor transkripsi berkaitan runt 2(Runx2)(16) Kesan ini diikuti dengan peningkatan ekspresi gen khusus osteoblas, seperti osteopontin dan osteocalcin. Di samping itu, mengurangkan ekspresi protein khusus otot licin. seperti protein otot licin 22-0 (SM22-0), berlaku. Akibatnya, VSMC diubah menjadi sel seperti osteoblas. (1718)Kajian klinikal terkini telah menunjukkan bahawa paras darah kalsium. zarah protein (CPP), yang mewakili zarah koloid kalsium fosfat, meningkat dengan penurunan fungsi buah pinggang. (19-21)Tambahan pula, korelasi dengan paras CPP darah dan P telah dilaporkan.2o2i) Ada kemungkinan bahawa CpP boleh mencetuskan perkembangan kalsifikasi vaskular.22-24)

Walau bagaimanapun, kalsifikasi vaskular telah diperhatikan pada pesakit dengan CKD peringkat awal dengan tahap plasma P normal. (13) Selain itu.PiT-1 mRNA dinyatakan di mana-mana dalam semua tisu. Oleh itu, molekul lain boleh bertindak terutamanya dalam bidang kalsifikasi vaskular. Terdapat laporan bahawakeradanganmenggalakkan kalsifikasi vaskular. Faktor keradangan seperti interleukin (IL)-1B, IL-6 dan tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) menyebabkan pembezaan VSMC kepada sel seperti osteoblas(2s26) TNF-a mendorong kalsifikasi vaskular melalui laluan cAMP, yang memainkan peranan dalam pembezaan osteoblast.2728) IL-6 mengawal pelbagai laluan yang membawa kepada kalsifikasi vaskular VSMC2-31) Tambahan pula. IllB, IL-6 dan TNF-a juga merupakan faktor yang dikaitkan dengan peningkatan kalsifikasi vaskular yang disebabkan oleh tahap p yang tinggi.3233) Walau bagaimanapun. data semasa tidak menjelaskan sepenuhnya mekanisme vaskular

kalsifikasi yang disebabkan oleh faktor-faktor ini. Kami membuat hipotesis bahawa mungkin terdapat molekul lain yang berkaitan dengan P seperti yang terdapat dalam superfamili SLC, yang terlibat dalam kalsifikasi vaskular. Kami menumpukan pada protein membran dalam superfamili SLC dan menyiasat calon berpotensi molekul berkaitan P selain PiT-1 untuk penglibatan dalam kalsifikasi vaskular. Tambahan pula, kami mengkaji hubungan antara molekul calon dan kalsifikasi vaskular dalam video dan dalam vivo.

Bahan dan Kaedah

Kultur sel. Sel-sel otot lancar manusia biasa (AoSMC) diperolehi daripada Lonza (Basel, Switzerland) AoSMC telah dikultur mengikut arahan pengilang. AoSMC dikekalkan dalam medium pertumbuhan (medium basal sel otot licin ditambah dengan 5% serum lembu janin (FBS), faktor pertumbuhan epidermis, insulin, faktor pertumbuhan fibroblast-B, dan gentamicin/amphotericin-B). Media ditukar setiap hari. AoSMC ditanam dalam inkubator CO 5% yang dilembapkan pada 37 darjah dan dikekalkan sehingga pertemuan dicapai dan kemudian digunakan dalam eksperimen.

AoSMC yang dikalsifikasi.Pengkalsifikasian AoSMC telah diinduksi seperti yang diterangkan sebelum ini.435) AOSMC telah dibiakkan dalam medium Eagle yang diubah suai Dulbecco ditambah dengan 15% FBS dan penicillin-streptomycin dan dikultur dengan 2.6 mM P selama 3, 6, 9, 12 dan 14 hari. Kepekatan P diselaraskan oleh penampan P NaH, PO / Na, dan HPO. pH 7.2). AoSMC lain tidak dibiakkan dengan 2.6 mM P.

Mikroarray DNA. Jumlah RNA sampel AoSMC yang dibiakkan dan tidak dibiakkan dengan 2.6 mM P telah digunakan. Jumlah RNA 5.0 ug telah dianalisis menggunakan susunan mikro DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Jepun). SurePrint G3 Manusia GE 8 x 60k ver. 2 Microarray digunakan untuk memeriksa kira-kira 26,000 gen. Nisbah dikira dengan membahagikan tahap ekspresi AoSMC yang dikultur dengan 2.6 mM selama 12 hari dengan tahap ekspresi AoSMC yang tidak dikultur dengan 2.6 mM P

Mikroarray DNA

Jumlah RNA sampel AoSMC yang dibiakkan dan tidak dibiakkan dengan 2.6 mM P telah digunakan. Jumlah RNA 5.0 ug telah dianalisis menggunakan susunan mikro DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Jepun). SurePrint G3 Manusia GE 8 x 60k ver. 2 Microarray digunakan untuk memeriksa kira-kira 26,000 gen. Nisbah dikira dengan membahagikan tahap ekspresi pada AoSMC yang dikultur dengan 2.6 mM selama 12 hari dengan tahap ekspresi pada AoSMC yang tidak dikultur dengan 2.6 mM P. Ekspresi SLC37A2 dalam keradangan vaskular. Untuk mendorong tindak balas keradangan dalam AoSMC, sel telah dibiakkan dengan medium pertumbuhan sehingga mereka mencapai pertemuan dan kemudian dirawat dengan 1 ugmL lipopolysaccharides (LPS) (LPS dari escherichia coli O111: B4; Sigma, St. Louis, MO) selama 24 dan 72 tanpa 2.6 mM P. AoSMC lain tidak dikultur dengan analisis tindak balas rantai polimerase (PCR) masa nyata. Jumlah RNA diekstrak daripada AoSMC yang dirawat dengan LPS selama 24 dan 72 jam dan sel tidak dirawat dengan LPS. PCR masa nyata kuantitatif berasaskan hijau SYBR telah dilakukan menggunakan cDNA yang disintesis dan set primer yang sesuai untuk setiap gen sasaran dengan sistem PCR masa nyata aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Jujukan primer adalah seperti berikut: IL manusia-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' dan 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; manusia SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' dan 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- dan 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 dan tahap ekspresi mRNA SLC37A2 dikira selepas penormalan dengan GAPDH. Ungkapan SLC37A2 dalam SLC37A2 AoSMC. Jumlah diekstrak daripada AoSMC yang tidak dikultur dengan 2.6 mM P dan sel AoSMC yang dikultur dengan 2.6 mM P selama 3, 6, 9, 12, dan 14 hari. PCR masa nyata dilakukan menggunakan cDNA yang disintesis. Urutan primer adalah seperti berikut: Runx2 manusia, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3', dan 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Tahap ekspresi mRNA Runx2 dan SLC37A2 dikira selepas penormalan dengan APPH.

Analisis Western blotting.

Jumlah protein dikumpul daripada sampel AoSMC yang dibiakkan di bawah keadaan yang sama digunakan untuk analisis PCR masa nyata. Sampel-sampel ini telah dilisiskan menggunakan garam penimbal Tris (pH 75) ditambah dengan 5% NP-40 dan koktel perencat protease 1%. Sampel kepekatan protein diukur menggunakan Kit Assay Protein BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). dan kepekatannya diselaraskan dengan western blotting, 10 ugs protein diasingkan dalam gel poliakrilamida 10% menggunakan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida. Membran telah dirawat dengan antibodi SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) atau antibodi GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) sebagai antibodi utama, diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi peroksidase arnab lgG Horseradish (R&D Systems, Minneapolis, MN) sebagai antibodi sekunder dan digambarkan menggunakan Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, England) dan penganalisis imej bercahaya (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Jepun). Band ini dikira menggunakan lmagel.

Percubaan

Semua protokol kajian telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Universiti Hyogo, Pusat Pengajian Sains Manusia dan Alam Sekitar. Tikus jantan Sprague-Dawley berumur dua belas minggu telah dibeli dari Jepun SLC (Shizuoka, Jepun). Tikus dikekalkan pada 12-kitaran gelap, 12-j (09:00-21:00) dan membenarkan akses percuma kepada makanan dan air lebih tulen.

Diet percubaan termasuk diet P kawalan (1.0% P, 0.6Ca, 20% protein), diet adenine (0.75% adenine , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% protein), diet rendah P (LP) (0.2% P,0 .6% Ca, 10%protein) dan diet P tinggi (HP) (1.0% P, 0.6% Ca, 10% protein)berasaskan diet AIN93-G (Timur Yis, Tokyo, Jepun) dengan kasein sebagai sumber protein.3637) Diet rendah protein telah dilaporkan menggalakkan kalsifikasi vaskular pada tikus dengan kegagalan buah pinggang yang disebabkan oleh adenine, jadi sekatan protein dilakukan.3738)Sebelum pengelompokan, semua tikus (n=23) telah diberi diet MF standard (Oriental Yis) selama seminggu untuk menyesuaikan diri. Pada usia 13 minggu, tikus dibahagikan kepada 2 kumpulan: kumpulan kawalan (n=5) dan kumpulan CKD yang disebabkan oleh adenine (n=18). Kumpulan kawalan menerima diet P kawalan selama 6 minggu. . Kumpulan CKD yang disebabkan oleh adenine menerima diet adenine selama kira-kira 3 minggu dan kemudian dibahagikan lagi kepada 2 subkumpulan: kumpulan CKD-LP (n=8) atau kumpulan CKDHP (n=10). Tikus kumpulan CKD-LP dan kumpulan CKD-HP menerima diet LP dan diet HP selama 3 minggu, masing-masing semasa tempoh percubaan, pengambilan makanan direkodkan setiap hari. Semasa diet adenine, sampel darah dikumpulkan dari urat ekor antara 10:00 PG dan 11:00 PG sekali seminggu sehingga minggu kedua, dan selepas itu sekali setiap 2 hari untuk memantau tahap plasma. Semasa diet LP atau diet HP, sampel darah dikumpulkan seminggu sekali. Sampel air kencing dikumpul dan jumlah air kencing direkodkan sekali setiap minggu. Tikus dikorbankan dengan anestetik menggunakan isoflurane (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) dan laparotomi. Sampel darah yang diambil dari vena kava inferior dan aorta thoracoabdominal telah dikumpulkan untuk analisis.

Ekspresi SLC37A2 pada aorta.

Kira-kira satu pertiga daripada aorta thoracoabdominal yang dikumpul digunakan untuk menggambarkan kalsifikasi dan menjalankan imunostaining. Aorta dibenamkan dalam parafin dan 4-bahagian um telah dipotong. Bahagian telah diwarnakan menggunakan Kaedah Von Kossa untuk Kit Kalsium (Polysciences. Warrington, PA) mengikut arahan pengilang. analisis imunostaining dilakukan dengan bahagian bersiri. Bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi SLC37A2 semalaman pada 4 darjah dan kemudian dirawat dengan Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Jepun) selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas itu, bahagian telah dirawat dengan kit DABsubstrat (Nichirei).

Jumlah RNA telah diekstrak dari seluruh aorta thoracoabdominal beku. PCR masa nyata dilakukan menggunakan cDNA yang disintesis. Urutan primer adalah seperti berikut: tikus osteo-pontin, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' dan 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' dan; tikus SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' dan 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3.Tahap ekspresi mRNA osteopontin dan SLC37A2 mRNA dikira selepas penormalan dengan GAPDH

Analisis statistik.

Data dibentangkan sebagai min + SE. Perbezaan antara kumpulan dianalisis menggunakan ujian-t. Dalam eksperimen AoSMC terkalsifikasi yang disebabkan oleh fosfat, perbezaan dianalisis menggunakan analisis varians sehala diikuti dengan kaedah Dunnett. Dalam eksperimen model CKD, perbezaan dianalisis menggunakan ujian K ruskal-Wallis diikuti dengan kaedah Steel-Dwass. Pekali korelasi (rs) ditentukan menggunakan ujian pangkat pekali korelasi Spearman. Untuk semua ujian. nilai p dua hujung<0.05 were considered statistically significant.