Sitotoksisiti Selektif Akteosida Bahan Herba Terhadap Sel Tumor Dan Wawasan Mekanistiknya

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Christina Cheimonidi et al

ABSTRAK

Produk semula jadi dicirikan oleh kepelbagaian struktur yang melampau dan oleh itu ia menawarkan sumber unik untuk mengenal pasti agen anti-tumor baru. Di sini, kami melaporkan bahawa bahan herbaacteosidediasingkan dengan kaedah fitokimia lanjutan daripada daun Lippia citriodora menunjukkan sitotoksisiti yang dipertingkatkan terhadap sel tumor metastatik; bertindak secara sinergi dengan pelbagai agen sitotoksik dan sel-sel kanser kemoresistant yang sensitif.Acteosidetidak toksik dalam konteks selular fisiologi, sementara ia meningkatkan beban oksidatif, menjejaskan aktiviti modul proteostatik, dan menindas metalloproteinase matriks dalam saluran sel tumor. Pentadbiran acteoside secara intraperitoneal atau oral (melalui air minuman) dalam model tikus melanoma mengawal tindak balas antioksidan dalam tumor; namun, hanya penghantaran intraperitoneal menyekat pertumbuhan tumor dan mendorong tindak balas imun anti-tumor-reaktif. Analisis pengenalpastian/kuantisasi jisim-spektrometri mendedahkan bahawa penghantaran intraperitonealacteosidemenghasilkan kepekatan kompaun dalam plasma dan tumor tikus yang dirawat dengan ketara lebih tinggi, berbanding pemberian oral, menunjukkan bahawa kesan anti-tumor in vivo bergantung pada laluan pemberian dan kepekatan yang dicapai dalam tumor. Akhirnya, kajian pemodelan molekul dan ujian aktiviti enzimatik menunjukkan bahawaacteosidemenghalang protein kinase C. Secara konklusif, acteoside memegang janji sebagai perancah kimia untuk pembangunan agen anti-tumor baru.

Kata kunci:Acteoside, Kanser, Kompaun semula jadi, Tekanan oksidatif, Proteostasis, Imunomodulasi

cistanche acteoside

1. Pengenalan

Karsinogenesis dicirikan oleh penyahkawalseliaan beberapa laluan isyarat sel dan dikaitkan dengan peningkatan tekanan oksidatif, replikatif, metabolik, genotoksik dan proteotoksik selular [1]. Untuk menyesuaikan dan mengatasi fenotip tekanan ini, sel-sel malignan mengimbangi (selain daripada onkogen) beberapa laluan bukan onkogenik yang bertujuan untuk menekan atau (sekurang-kurangnya) mengurangkan tekanan yang berterusan. Antara pelbagai laluan bukan onkogenik yang didapati kerap dikawal semasa tumorigenesis adalah modul rangkaian proteostasis (PN) bersama-sama dengan tindak balas antioksidan selular [2,3].

Komponen utama PN ialah dua jentera degradasi utama, iaitu laluan Autophagy-Lisosom (ALP) dan Laluan Ubiquitin-Proteasome (UPP), bersama-sama dengan rangkaian pendamping molekul selular. ALP terlibat terutamanya dalam degradasi agregat protein dan organel yang rosak [4], manakala UPP merendahkan protein jangka pendek biasa dan protein tersalah lipat atau terbentang yang tidak boleh diperbaiki [5-8]. Proteasom 26Seukariotik terdiri daripada zarah pengawalseliaan (RP) 19S dan zarah Skor 20 (CP); yang terakhir ini terdiri daripada empat gelang heptamerik bertindan (dua daripada jenis mengelilingi dua jenis) yang membentuk struktur seperti tong. Aktiviti seperti chymotrypsin (CT-L), trypsin-like (TL), dan caspase-like (CL) proteasome peptidase terletak pada 5, 2, dan 1 subunit proteasomal, masing-masing [6]. Keberkesanan klinikal yang ditunjukkan perencat proteasome Bortezomib (Velcade®; juga dinamakan PS-341) dan Carfifilzomib terhadap pelbagai keganasan hematologi [9] telah menyediakan "bukti konsep" penyasaran UPP sebagai strategi yang menjanjikan untuk rawatan kanser. Rangkaian kompleks laluan pertahanan antioksidan selular yang kerap dikawal semasa karsinogenesis [3,10] termasuk enzim antioksidan, serta beberapa faktor transkripsi yang menggerakkan tindak balas genomik sitoprotektif; ini termasuk kotak kepala fork O (Foxo) dan faktor berkaitan erythroid 2-nuklear (Nrf-2). Nrf-2 adalah penting dalam perlindungan sel terhadap kerosakan oksidatif dan/atau xenobiotik kerana ia merangsang ekspresi gen antioksidan dan fasa II [11-13].

Kami dan yang lain baru-baru ini mencadangkan bahawa menyasarkan kebergantungan tumor ini (iaitu, modul proteostatik dan/atau laluan tindak balas antioksidan) atau meningkatkan tahap selular ROS dalam konteks genotip yang diubah menawarkan tetingkap terapeutik yang berpotensi untuk pembunuhan terpilih sel tumor [3 ,14]; sebagai sokongan, pembunuhan terpilih sel-sel kanser oleh molekul kecil yang mengawal tahap ROS selular telah dilaporkan [2]. Adalah dijangka bahawa pendekatan kombinatorial termasuk juga pengaktifan tindak balas imun anti-tumor-reaktif [15] mungkin akan memaksimumkan tetingkap terapeutik yang ditawarkan dengan menghalang tindak balas PN dan antioksidan dan/atau dengan meningkatkan tahap ROS selular.

Produk semula jadi (ekstrak atau sebatian tulen) (NP) daripada pelbagai sumber (tumbuhan, organisma marin, mikroorganisma, dll) disaring untuk keupayaannya untuk bertindak sebagai agen anti-tumor disebabkan oleh kepelbagaian struktur yang melampau dan kerumitan kimia, serta kerana mereka bertindak pleiotropik memodulasi beberapa laluan isyarat selular [16]. Dilaporkan, NP mengaktifkan tindak balas anti-radang, anti-tumor dan/atau anti-metastatik [16,17] dan juga mengelakkan rintangan multidrug [18,19]. Antaranya, sebatian fenolik (termasuk glikosida phenylethanoid) telah menarik minat yang ketara kerana peranannya yang dilaporkan dalam pencegahan dan/atau rawatan pelbagai penyakit manusia.

Acteoside, juga dipanggil penggunaan atau verbascoside [20], ialah glikosida phenylethanoid yang diasingkan daripada banyak dikotiledon. Dilaporkan, acteoside menggunakan beberapa aktiviti biologi yang menarik, termasuk sifat antioksidan, anti-radang, dan apoptosis sel [21,22]. Walau bagaimanapun, potensi aktiviti anti-tumornya belum ditangani. Kami melaporkan di sini, bahawa acteoside menunjukkan peningkatan sitotoksisiti terhadap sel-sel kanser mamalia tanpa kesan toksik yang jelas dalam konteks selular fisiologi. Tambahan pula, acteoside menyekat pertumbuhan tumor melanoma dalam model tetikus Vivo, dengan (antara lain) mengaktifkan tindak balas imun anti-tumor-reaktif.

kesan daripadacistanche acteoside

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Bahan tumbuhan dan pengekstrakan

daun Lippia citriodora (Lamiaceae) kering (4.5 kg) dibeli dari pasaran tempatan di Athens, Greece. Daun telah dihancurkan dan diekstrak dengan kacau mekanikal selama 12 jam dengan metanol (2 × 20 L). Ekstrak metanol telah disejat hingga kering dan dibasuh dengan campuran CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). Sisa yang tidak larut dipisahkan dan dikeringkan, menghasilkan serbuk hijau-kuning (450 g).

2.2. Pemurnian analisis acteoside dan UPLC-HRMS

Sebahagian (1{3}} g) daripada sisa yang dinyatakan di atas tertakluk kepada kromatografi arus balas menggunakan radas kromatografi partition emparan pantas (FCPC) (Kromaton, Perancis); campuran EtOAc/EtOH/H2O pada nisbah 5/0.5/4.5 digunakan sebagai sistem pelarut dwifasa. Pecahan terkumpul tertakluk kepada Kromatografi Lapisan Nipis; kemudian kromatogram telah diperhatikan di bawah lampu UV (254 dan 365 nm) dan divisualisasikan dengan menyembur dengan metanol vanillin sulfat diikuti dengan pemanasan selama dua minit. Sebanyak 2.1 g acteoside (ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 90 peratus ) telah diasingkan oleh proses yang dinyatakan di atas. Pengenalpastian acteoside dilakukan oleh spektrum resonans magnetik nuklear (NMR) dan spektrometri jisim (MS), manakala ketulenannya ditubuhkan oleh analisis UPLC-MS dan NMR; untuk butiran lihat Suppl. Bahan dan Kaedah.

2.3. Talian sel

Fibroblas embrionik paru-paru manusia (sel IMR90) bersama-sama dengan garisan sel tikus B16.F1, B16.F10, YAC-1 dan WEHI-164 telah diperoleh daripada American Tissue Culture Collection (ATCC). Talian sel osteosarcoma manusia U2 OS dan Sa OS telah didermakan oleh Prof. V. Gorgoulis (Sekolah Perubatan, Universiti Kebangsaan dan Kapodistrian Athens, Greece), manakala sel osteosarcoma KH OS dan sel sel osteosarcoma kemotahan [23] adalah sumbangan Dr. E. Gonos (Yayasan Penyelidikan Hellenic Kebangsaan, Greece). Barisan sel kanser tikus C5N dan A5 tergolong dalam model karsinogenesis kulit tikus berbilang peringkat [24,25] dan telah disumbangkan oleh Prof. A. Balmain (Pusat Kanser Komprehensif, Universiti California, Amerika Syarikat). Keadaan kultur garisan sel terpakai dilaporkan dalam Suppl. Bahan dan Kaedah.

faedah daripadacistanche acteoside

2.4. Model tikus melanoma jantan

C57BL/6 tikus (25–30} g berat, umur 6–8 minggu) diperoleh daripada Hellenic Pasteur Institute dan ditempatkan di bawah suhu terkawal (22 darjah ) dan fotoperiod (12 jam cahaya:12 jam gelap ) dengan akses percuma kepada air dan makanan. Tikus telah diinokulasi secara subkutan dengan 105 sel melanoma B16.F1 (dalam 100 μL PBS) dan secara rawak ditugaskan kepada 3 kumpulan (n=5/kumpulan). Apabila tumor menjadi ketara (hari ke-11) tikus menerima acteoside melalui dua laluan; sama ada secara intraperitoneal (IP) (1 mg/tikus dicairkan dalam 200 μL PBS; dalam jumlah 6 dos diberikan setiap hari) atau secara lisan dengan air minuman (OR) (2.5 mg/tikus; dalam jumlah 13 dos selama 13 hari berturut-turut). Tikus kawalan telah diberikan PBS. Pertumbuhan tumor direkodkan setiap 2 hari dengan mengukur paksi besar dan kecil tumor yang terbentuk dengan caliper digital. Pengukuran telah diubah menjadi isipadu tumor menggunakan formula: isipadu tumor (cm3)=paksi utama × paksi kecil2 × 0.5. Pada hari ke-28, haiwan telah dieutanasi dengan dislokasi serviks, dan limpa dikeluarkan secara aseptik. Eksperimen diulang tiga kali dengan penemuan yang sama.

Splenosit telah diasingkan daripada limpa yang dihomogenkan secara individu dan segera diuji untuk sitotoksisitinya berbanding sasaran sel B16.F1, YAC-1 dan WEHI-164. Sitotoksisiti dinilai berdasarkan pengesanan pendedahan CD107 pada permukaan sel, akibat degranulasi sel effector. Splenocytes (105 sel/telaga) dikultur bersama dengan sasaran dalam 96-plat mikro bawah telaga U pada nisbah efektor kepada sasaran (E: T) 100:1, pada 37 darjah dalam 5 peratus CO2. Antibodi monoklonal anti-CD107a dan anti-CD107b konjugasi FITC (25 μL/mL) dan monensin (6 μL/mL; semuanya daripada BD Biosciences) telah ditambah dalam setiap telaga. Sel dituai 6 jam kemudian dan dianalisis menggunakan sitometer aliran FACSCanto II. Secara selari, tumor telah dipotong dan diproses untuk ujian hiliran seperti yang diterangkan dalam Suppl. Bahan dan Kaedah.

cistanche acteoside