Lipocalin Berkaitan Neutrofil Gelatinase yang Dirahsiakan Menunjukkan Keupayaan Yang Lebih Kuat Untuk Menghalang Pembesaran Sista Sel ADPKD Berbanding Dengan Bentuk Tidak Rembes Ⅱ

3. Keputusan

3.1. Perbandingan Ekspresi NGAL dan Percambahan Sel antara M-1 Jenis Liar dan Sel ADPKD 2L3

Barisan sel 2L3 telah ditubuhkan oleh transduksi virus SV40 sel epitelium buah pinggang utama daripada tikus Pkd1L3/L3 [17]. M-1 sel (talian sel epitelium renal jenis liar tikus) yang dibeli daripada BCRC (Hsinchu, Taiwan) telah digunakan sebagai kawalan. Genotaip PCR bagi transkrip Pkd1 bagi sel 2L3 dan M-1 telah dijalankan untuk memeriksa genotip menggunakan primer sebelum dan selepas tapak loxP pertama dalam intron 30 alel yang disasarkan (Rajah 1A). Tisu tetikus Pkd1+/+, Pkd1L3/+ dan Pkd1L3/L3 telah digunakan sebagai kawalan genotaip. Produk PCR daripada sel M-1 menunjukkan satu jalur Pkd1+/+ jenis liar (WT) tunggal (473 bp), manakala produk PCR daripada sel 2L3 menunjukkan satu jalur Pkd1L3/L3 tunggal (507 bp) disebabkan oleh segmen loxP tambahan (34 bp) (Rajah 1B).

Untuk mencirikan sama ada sel M-1 dan 2L3 berasaltubul renal dari asal yang sama, kami mula-mula membandingkan morfologi antara 2 garisan sel; M-1 sel dan sel 2L3 menunjukkan morfologi yang hampir sama (Rajah 1C). Di samping itu, pewarnaan lektin dengan Lotus tetragonolobus lectin (LTL, penanda tubul proksimal terbeza, dilabelkan dengan fluorescein) dan Dolichos biflorus agglutinin (DBA, penanda tubul distal yang berbeza dan saluran pengumpul, dilabelkan dengan rhodamine) telah dilakukan untuk memeriksa asal usulnya. daripada tubul renal (Rajah 1D). Keputusan pewarnaan menunjukkan bahawa sel M-1 dan 2L3 adalah LTL- (kebanyakannya dikolokalisasikan dengan DAPI) dan DBA-positif (disetempatkan dalam sitoplasma) (Rajah 1D). Keputusan ini mencadangkan bahawa sel M-1 dan 2L3 berasal daripadatubul renalasal-usul yang sama dan mungkin mempunyai ciri-ciri yang serupa. Keputusan PCR masa nyata menunjukkan bahawa sel 2L3 telah sangat mengurangkan tahap ekspresi mRNA Pkd1 berbanding dengan sel M-1 (Rajah 1E), yang konsisten dengan data daripada tikus 2L3 dengan tahap ekspresi protein Pkd1 hanya 25% daripada tikus jenis liar [17]. Tikus 2L3 telah ditunjukkan mempunyai tahap protein NGAL dan NGAL reseptor (NGAL-R) yang lebih tinggi dalam buah pinggang mereka daripada tikus jenis liar [31]. Keputusan PCR masa nyata menunjukkan bahawa tahap ekspresi mRNA Lcn2 ialah 15.96-kali ganda lebih besar dalam 2L3 berbanding dalam sel M-1 (Rajah 1F), selaras dengan data yang dilaporkan untuk tikus 2L3 [31], manakala tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam ekspresi mRNA Slc22a17 antara kedua-dua kumpulan (Rajah 1G). Keputusan Western blot juga menunjukkan bahawa sel 2L3 mempunyai tahap ekspresi NGAL yang lebih tinggi daripada sel M-1, manakala tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam tahap ekspresi NGAL-R antara kedua-dua kumpulan (Rajah 1H). Sel dan supernatan sel M-1 dan 2L3 kedua-duanya dituai selepas kultur selama 48 jam untuk mengukur NGAL dalam lisat dan supernatan sel (mewakili NGAL yang dirembes) oleh ELISA. Selaras dengan keputusan western blot, ELISA menunjukkan bahawa 2L3 mempunyai NGAL intraselular yang jauh lebih tinggi dan rembesan NGAL dalam supernatan daripada M-1 (Rajah 1I).

Tikus 2L3 telah ditunjukkan untuk menunjukkan percambahan sel yang lebih tinggi daripada tikus jenis liar [17]. Ujian penggabungan MTT dan BrdU telah dijalankan untuk menyiasat sama ada garisan sel 2L3 juga menunjukkan daya maju dan percambahan yang lebih baik daripada sel jenis liar (Rajah 2A-C). Imej perwakilan mendedahkan pertemuan sel 2L3 yang lebih besar daripada sel M{10}} selepas kultur selama 48 jam dengan nombor pembenihan awal yang sama (Rajah 2A). Ujian MTT menunjukkan bahawa sel 2L3 mempunyai daya maju yang jauh lebih baik daripada sel M-1 yang dikultur selama 24 dan 48 jam (Rajah 2B). Untuk membandingkan keupayaan percambahan sel M-1 dan 2L3, sel telah dikultur selama 24 jam berikutan ujian penggabungan BrdU, yang menunjukkan bahawa sel 2L3 mempunyai pembiakan yang jauh lebih baik daripada sel M-1 (Rajah 2C) .

HERBA BARU UNTUK PENYAKIT BUAH PINGGANG

3.2. Kesan Penambahan mNGAL terhadap Daya Maju dan Pembiakan Sel 2L3

Pentadbiran NGAL eksogen telah ditunjukkan untuk mengurangkan pertumbuhan sista secara in vitro [25]. Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan NGAL dalam model tetikus ADPKD (Pkd1L3 / L3; NGALTg / Tg tikus) mengurangkan perkembangan sista disertai dengan perubahan dalam satu siri laluan molekul yang terlibat dalampercambahan sel, apoptosis, danfibrosis[31]. Oleh itu, kami menyiasat kesan mNGAL rekombinan pada daya maju sel 2L3 menggunakan ujian MTT (Rajah 3). Ketulenan mNGAL rekombinan (tanpa peptida isyarat) yang disucikan daripada E. coli pertama kali ditentukan oleh SDS–PAGE dan pewarnaan dengan biru Coomassie, yang mendedahkan satu 20-jalur kD dan jalur dimer yang sangat ringan pada kepekatan tinggi ( Rajah 3A). Di samping itu, kestabilan mNGAL dalam medium kultur sel dianalisis oleh western blotting, yang menunjukkan kestabilan mNGAL dalam medium selama sekurang-kurangnya 48 jam (Rajah 3B). Kami mendapati bahawa mNGAL telah mengurangkan daya maju sel 2L3 dengan ketara berbanding dengan kumpulan kawalan selepas rawatan selama 8 jam (Rajah 3C). Rapamycin digunakan sebagai kawalan positif dalam eksperimen ini, yang diiktiraf sebagai perencat mTOR dan diketahui menghalang percambahan sel epitelium dan pertumbuhan sista dalam model tetikus PKD [32]. Di samping itu, ujian penggabungan BrdU juga menunjukkan bahawa rawatan mNGAL selama 24 jam dengan ketara menghalang percambahan sel 2L3 (Rajah 3D). Proliferasi sel adalah ciri utama ADPKD, dan penemuan bahawa percambahan sel 2L3 dapat dikurangkan oleh mNGAL mencadangkan bahawa mNGAL mungkin menghalang pembentukan sista dalam sel 2L3.

3.3. Laluan Isyarat Terpengaruh oleh Penambahan mNGAL kepada Sel 2L3

Gandingan NGAL dan NGAL-R telah ditunjukkan untuk mengasingkan besi intraselular dan seterusnya mendorong apoptosis [29]. Di samping itu, kajian telah menunjukkan bahawa NGAL boleh mendorong apoptosis dalam model ADPKD in vitro dan in vivo [25,31]. Untuk menyiasat sama ada mNGAL boleh mendorong apoptosis sel 2L3, kami menganalisis apoptosis sel 2L3 oleh sitometri aliran. Berdasarkan penemuan bahawa mNGAL menghalang percambahan sel 2L3 selepas rawatan mNGAL selama 8 jam (Rajah 3D), kami menganalisis kesan mNGAL pada sel 2L3 pada kedua-dua titik masa awal (4 jam) dan kemudian (12 jam).

Untuk analisis sitometri aliran, bilangan sel yang lebih tinggi dan tempoh kultur yang lebih pendek diperlukan daripada ujian MTT yang dijalankan sebelum ini; oleh itu, sel 2L3 telah disemai pada 6-plat perigi, dan kepekatan mNGAL yang lebih tinggi (600–1200 µg/mL) telah digunakan pada sel tersebut. Keputusan menunjukkan bahawa 1200 µg/mL mNGAL dengan ketara menghalang daya maju sel selepas 4 dan 12 jam rawatan, manakala 600 µg/mL mNGAL menghalang daya maju sel hanya selepas 4 jam rawatan (Rajah 3E). Ujian apoptosis dilakukan oleh sitometri aliran untuk mengesan sel bernoda Annexin V-FITC- dan PI. Annexin V mempunyai pertalian tinggi untuk phosphatidylserine (PS) dan digunakan untuk mengenal pasti sel apoptosis dengan PS terdedah [33]. Mengikut keputusan pewarnaan, sel boleh dikelaskan sebagai normal (AV−/PI−), apoptosis awal (AV+/PI−), apoptosis lewat (AV+/PI+), dan nekrosis (AV−/PI+), dan ditunjukkan dalam gambar rajah kuadran (Rajah 3F). Sel-sel pada peringkat apoptosis awal mengekalkan membran yang utuh, yang berbeza daripada sel-sel pada peringkat apoptosis lewat dengan membran yang hancur [34]. Keputusan menunjukkan bahawa kadar apoptosis sel 2L3 (termasuk AV+/PI− awal dan apoptosis AV+/PI+ lewat) meningkat dengan ketara berbanding dengan kumpulan kawalan selepas 12 jam rawatan dengan mNGAL (1200 µg/mL; Rajah 3F, G ).

rajah 1. Perbandingan ungkapan NGAL antara jenis liar M-1 dan sel ADPKD 2L3. (A) Struktur jenis liar dan alel L3 gen Pkd1. Genotaip PCR telah dijalankan menggunakan primer sebelum dan selepas loxP pertama dalam intron 30 Pkd1. Segitiga terisi: loxP; gen rintangan neomycin dipacu penganjur mc1 (mc1-neo) yang diapit oleh dua tapak loxP telah dimasukkan ke dalam intron 34 Pkd1.(B) PCR genotaip transkrip Pkd1 bagi sel M-1 (473 bp) dan sel 2L3 (507 bp). Transkrip Pkd1 bagi tikus jenis liar (+/+), heterozigot (L3/+), dan homozigot (L3/L3) digunakan sebagai kawalan. RT–qPCR menunjukkan bahawa 2L3 mempunyai Pkd1 (C) M-1 yang jauh lebih rendah dan sel 2L3 menunjukkan morfologi yang sama. Bar skala: 100 µm. (D) M-1 dan sel 2L3 telah diwarnai dengan Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL, dilabel dengan Fluorescein, hijau) dan Dolichos biflorus agglutinin (DBA, dilabelkan dengan lombong Rhoda, merah) dan DAPI (biru) dan diperhatikan oleh mikroskop confocal. Bar skala: 50 µm. RT–qPCR menunjukkan bahawa 2L3 mempunyai tahap ekspresi Pkd1 (E) dan Lcn2 (NGAL) (F) yang lebih rendah dengan ketara berbanding sel jenis liar M{42}}. (G) Tiada perbezaan ketara dalam tahap ekspresi Slc22a17 (NGAL-R) antara sel M-1 dan 2L3. RQ: kuantifikasi relatif=2 −ΔΔCt; Gapdh digunakan sebagai kawalan dalaman setiap sampel. Nilai telah dinormalkan kepada M-1. (H) Keputusan Western blot menunjukkan bahawa 2L3