Perhimpunan Transkrip De Novo Berasaskan RNA-Seq Dan Penemuan Gen Batang Berdaging Cistanche Deserticola-Ⅱ

Klasifikasi Fungsian Semua Transkrip Dinyatakan Berdasarkan Ontologi Gen Dan Pangkalan Data KEGG

Anotasi Gene Ontology (GO) diperoleh daripada anotasi UniProt dan fail persatuan identiti. Secara keseluruhan, 20,907 transkrip, menyumbang 32.69% daripada jumlah jujukan yang dinyatakan, telah diberikan kepada 1,745 istilah berfungsi. Daripada jumlah istilah GO berfungsi, tugasan kepada proses biologi membentuk majoriti (1,116, 63.95%) diikuti oleh komponen selular (329, 18.85%) dan fungsi molekul (300, 17.20%). Fungsi yang diperuntukkan bagi transkrip dinyatakan meliputi pelbagai kategori GO, dan 10 istilah GO teratas dengan transkrip beranotasi paling banyak disenaraikan dalam Jadual 3. Kami menyediakan semua pengedaran transkrip yang dinyatakan dalam tiga kategori Ontologi Gen (Fungsi Molekul, komponen Selular dan proses biologi) dalam fail tambahan (Set Data S3). Istilah GO yang berkaitan dengan fungsi mengikat dan aktiviti transferase kebanyakannya diwakili dalam kategori fungsi molekul. Mengenai fungsi pengikatan, pengikatan kation (4,394 transkrip) mewakili yang paling banyak, diikuti oleh pengikatan nukleotida/nukleosida (purata 3,404 transkrip) dan pengikatan protein (2,422 transkrip). Manakala dalam kumpulan aktiviti pemindahan, paling ramai adalah kumpulan yang mengandungi fosforus pemindahan (2,256 transkrip, 65.77%). Antara kategori komponen selular, transkrip lebih banyak terletak di dalam sel (10,581 transkrip secara purata), manakala dalam kalangan kategori proses biologi, transkrip lebih banyak terlibat dalam proses metabolik biopolimer (purata 6,683 transkrip), diikuti dengan pengawalseliaan proses selular (4,841 transkrip. ), ekspresi gen (4,678 transkrip) dan pengangkutan (3,512 transkrip).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENCEGAH PENYAKIT ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Untuk melombong gen yang terlibat dalam biosintesis lignin dan PhG, 21,358 jujukan protein berpotensi tidak berlebihan telah dicari terhadap jujukan gen 13 organisma tumbuhan dalam pangkalan data KEGG, dan mereka ditugaskan kepada 275 laluan KEGG dengan sekurang-kurangnya 5 hits. 10 laluan teratas dengan urutan paling sejajar disenaraikan dalam Jadual 4. Kebanyakan laluan terlibat dalam proses metabolik primer, seperti asid amino atau metabolisme protein (ko01230, ko04141, dan ko04120), metabolisme karbohidrat (ko01200 dan ko00500), dan nukleotida atau metabolisme nukleosida (ko03018, ko00230, dan ko00240). Selain itu, terdapat 27 laluan berkaitan metabolisme sekunder (Rajah 2), seperti biosintesis tulang belakang terpenoid, biosintesis fenilpropanoid, biosintesis karotenoid, biosintesis alkaloid isoquinoline, dan biosintesis alkaloid tropana, piperidine dan piridin. Keputusan ini memberikan petunjuk lanjut bahawa proses metabolik aktif sedang dijalankan dalamC. deserticolatisu batang. Semua transkrip yang dinyatakan yang dikaitkan dengan laluan KEGG disenaraikan dalam fail tambahan (S4 Dataset). Walaupun terdapat beberapa laluan yang berubah dengan ketara antara C. deserticola dan tumbuhan lain, seperti beras (S5 Dataset), matlamat utama kami dalam kajian ini adalah untuk mendedahkan keseluruhan profil transkriptom C. deserticola stem dan untuk menggambarkan laluan berkaitan biosintesis PhGs. yang boleh berguna untuk membimbing penanaman.

Enzim Pengekodan Gen Calon Yang Terlibat Dalam Biosintesis Lignin

Lignin ialah polimer terestrial semula jadi kedua yang paling banyak dalam kerajaan tumbuhan, membentuk sehingga satu pertiga daripada bahan yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan. Sebagai komponen penting dinding sel, lignin membantu pengangkutan air, memberikan sokongan mekanikal dan integriti struktur, dan mempertahankan daripada patogen dan herbivor. Peranan lignin tersebut sangat berharga dalam menyokong pertumbuhan erektif bawah tanah C. deserticola di padang pasir. Dalam kajian ini, kami membentangkan gambaran lengkap laluan biosintesis lignin dalam C. deserticola (Rajah 3), di mana monomer lignin dibiosintesis daripada fenilalanin melalui satu siri tindak balas enzim, termasuk hidroksilasi, metilasi, pengurangan, dan proses pempolimeran oksidatif. Enzim berkaitan biosintesis lignin dikesan untuk tiga bentuk yang disintesis terutamanya dalam tisu vaskular (p-hydroxyl-phenyl (H), guaiacyl (G) dan syringyl (S) lignin) dan 5-hydroxyl-guaiacyl lignin yang hanya dikenal pasti. dalam tumbuhan COMT (asid kafeik 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) kekurangan (seperti knock-down).

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) ialah enzim utama pertama dalam laluan biosintesis lignin (Rajah 3) yang mengubah fenilalanin kepada asid sinamik melalui deaminasi bukan oksidatif. Sebanyak 6,297 bacaan PAL telah disusun dan 7 transkrip PAL telah dipasang di C. deserticola (Jadual 5). Dengan perbandingan persamaan jujukan, kami mendapati bahawa 4 daripadanya (comp28550_c1_seq1/2/3/5) mempunyai lebih daripada 95% persamaan dengan jujukan mRNA C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), manakala comp28550_c1_seq4 dan comp25940_c0_seq1 masing-masing mempunyai 77% dan 82% persamaan. Ramalan ORF mendedahkan 5 transkrip mempunyai potensi pengekodan protein dan dibawa dengan domain asid amino lyase aromatik (PF00221.14). Antaranya, hanya transkrip comp28550_c1_seq4 boleh mengekod urutan protein lengkap 718 sisa asid amino. Telah dilaporkan bahawa PAL telah dikodkan oleh keluarga multigen kecil dalam kebanyakan spesies tumbuhan, seperti 4 dalam Arabidopsis thaliana, 5 dalam Populus trichocarpa, 3 dalam Scutellaria baicalensis, dan 7 Cucumis sativus, dll. Analisis filogenetik kami mencadangkan bahawa terdapat 4 Gen pengekodan PAL dalam C.

deserticola dan kami menamakan mereka CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 dan CdPAL4, masing-masing (S2 Rajah). 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) dan trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) ialah dua enzim yang bertanggungjawab untuk mengubah asid sinamik kepada dicoumarol-CoA dalam dua terbalik pesanan. Mereka juga berada dalam tulang belakang, dan nilai ekspresi FPKM masing-masing ialah 39.57 dan 51.93.

Empat jenis lignin telah dibiosintesis oleh laluan berbeza yang dikawal oleh tiga enzim utama, cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), dan ferulat{{1{ {56}}}}hidroksilase (F5H, EC 1.14.-.-). CCR dilaporkan sebagai titik kawalan bagi laluan lignin [50, 51] yang memangkinkan X-CoA (X termasuk dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl, dan sinapoyl) kepada Y-aldehyde (Y termasuk p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl, and snap), manakala HCT memangkinkan p-coumaroyl-CoA kepada p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl quinic acid. Kedua-dua enzim, sama seperti suis, mengawal biosintesis P-hidroksil-fenil lignin atau tiga jenis lignin yang lain. F5H ialah satu lagi suis cawangan yang mengawal syringyl lignin dan 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Enzim penting lain termasuk asid caffeic 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), dan cinnamyl-alcohol dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195 ) juga dikesan dinyatakan. Maklumat ekspresi terperinci disenaraikan dalam Jadual 6. Gen enzim yang dikenal pasti dalam kajian ini akan menyediakan sumber yang berharga untuk kajian genomik berfungsi dalam tumbuhan ubatan yang penting ini. 10 gen yang berkaitan dengan laluan biosintesis lignin dalam Jadual 6 telah dipilih untuk pengesahan RT-qPCR untuk mengesahkan keputusan RNAseq kami (Rajah 4), dan korelasi tinggi mereka (pekali korelasi Pearson: 0.90343) menunjukkan ketepatan tinggi dan kebolehulangan analisis transkrip kami. Set Data S1 menyenaraikan jujukan primer yang digunakan dalam analisis ini.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Enzim Pengekodan Gen Calon Yang Terlibat Dalam Biosintesis PhG

Phenylethanoid glycosides (PhGs) dikenali sebagai bahan aktif utama dalam C. deserticola dengan aktiviti meningkatkan potensi seksual, menghilangkan radikal bebas dan anti-penuaan. Tiga komponen kimia PhG ialah asid organik, sakarida, dan phenylethanol aglycon (Rajah 3). Asid organik termasuk asid caffeic, asid ferulik, dan asid kuumalik adalah produk daripada laluan biosintesis fenilpropanoid. Komponen sakarida termasuk glukosa dan rhamnose adalah produk laluan metabolisme karbohidrat, seperti metabolisme kanji dan sukrosa, gula amino dan metabolisme gula nukleotida, metabolisme fruktosa dan mannose, dll. Walau bagaimanapun, laluan biosintesis bahagian phenylethanol masih belum jelas. Di sini, kami mencadangkan dua kemungkinan laluan biosintesis phenylethanol berdasarkan data jujukan kami. Satu ialah laluan asid kafeik atau asid ferulik yang dilaporkan, juga dikenali sebagai laluan asid sinamik yang serupa dengan laluan tulang belakang biosintesis lignin. Satu lagi adalah berdasarkan laluan metabolisme fenilalanin (Rajah 3), di mana fenilalanin kepada phenylethanol dicapai oleh 'laluan Enrlich' yang dikenali yang pertama kali ditemui dalam yis satu abad yang lalu dan disahkan dalam bunga petunia, tomato, dan mawar. Empat gen enzim yang mengekod aspartat/tirosin aminotransferase, histidine-phosphate aminotransferase, dan primer-amine oxidase yang bertanggungjawab untuk penukaran fenilalanin kepada phenylethanol telah dikesan dinyatakan dalam batang C. deserticola. Produk fenil etanol boleh dioksidakan lagi oleh monooxygenase atau dimetilasi oleh metiltransferase ke dalam derivatnya (fenil etanol aglycon) yang mengambil bahagian dalam biosintesis PhG. Secara ringkasnya, dua laluan biosintesis yang diduga bagi phenylethanol aglycon telah dicadangkan untukC. deserticolatetapi masih memerlukan kajian lebih lanjut.

Perbincangan

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, genomik tumbuhan telah berkembang pesat dengan aplikasi teknologi penjujukan generasi akan datang, manakala beberapa penyelidikan telah ditumpukan pada genomik tumbuhan ubatan padang pasir. Ia amat diperlukan untuk melaksanakan penyelidikan genomik atau transkriptomi untuk memahami penyesuaiannya terhadap persekitaran kemarau dan kemasinan serta laluan biosintesis komponen bioaktif utama. Penemuan transkrip de novo untuk beberapa tumbuhan perubatan,

seperti Panax ginseng, Ginkgo biloba, dan Glycyrrhiza uralensis telah mula dieksploitasi menggunakan platform Roche 454 untuk panjang bacaannya yang panjang. Oleh kerana keupayaan pemasangan yang berkesan dengan bacaan pendek, terutamanya bacaan akhir berpasangan yang berfaedah, penjujukan transkrip dan pemasangan berasaskan Illumina juga telah digunakan secara meluas untuk organisma model dan bukan model. Dalam kajian ini, kami menjana kira-kira 8G daripada 101 bp bacaan akhir berpasangan dan menghasilkan jujukan unigene yang lebih panjang dengan panjang purata 725 bp. Data transkriptom khusus batang berskala besar boleh menyediakan data rujukan yang berguna dan digunakan untuk melombong metabolisme sekunder komponen bioaktif C. deserticola. Terdapat 81.62% daripada jumlah bacaan mentah yang diluluskan penapis kualiti yang ketat (termasuk pemangkasan penyesuai dan pembuangan bacaan berkualiti rendah) sebelum pemasangan, mencadangkan kualiti tinggi data penjujukan kami, dan 82.08% daripada bacaan berkualiti tinggi berguna untuk pemasangan. Bacaan lain yang gagal digunakan untuk pemasangan mungkin datang daripada ralat penjujukan, parameter pemasangan et al. Bacaan berkualiti tinggi yang tidak digunakan itu kekal membantu dalam menambah baik pemasangan de novo digabungkan dengan bacaan yang lebih panjang daripada platform lain (seperti Roche 454) pada masa hadapan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sebilangan besar transkrip terkumpul (30,098) menunjukkan persamaan jujukan tinggi dengan gen yang diketahui dalam pangkalan data awam, menunjukkan bahawa data akhir berpasangan berasaskan Illumina kami meliputi sebahagian besar transkrip C. deserticola. Transkrip tanpa hits BLAST mungkin disebabkan oleh kawasan 3' atau 5' yang tidak diterjemahkan, RNA bukan pengekodan atau jujukan gen baharu C. deserticola. Transkrip yang dinyatakan telah diberi anotasi kepada pelbagai kategori GO dan laluan KEGG (Jadual 3 dan 4), di mana banyak transkrip diberikan kepada laluan berkaitan metabolisme sekunder. Seperti yang kita ketahui, fenilpropanoid boleh berfungsi sebagai sebatian antimikrob yang boleh diinduksi dengan salutary yang hebat untuk gaya hidup bawah tanah [1], dan juga bertindak sebagai molekul isyarat dalam interaksi tumbuhan-mikrob selain kegunaan perubatannya [68, 69]. Terpenoid digunakan untuk biosintesis komponen bioaktif (seperti 6- deoxycatalpol) [70]. Kami mendapati gen yang terlibat dalam laluan biosintesis tulang belakang fenilpropanoid dan terpenoid sangat banyak dalam C. deserticola. Lebih penting lagi, penemuan laluan biosintesis lignin yang diwakili dengan baik (Rajah 3) menunjukkan proses metabolik aktif lignin dalam batang C. deserticola. Semua gen enzim yang diketahui terlibat dalam biosintesis lignin (Rajah 3) dikesan dinyatakan, dan empat enzim utama termasuk PAL, CCR, HCT, dan F5H mempunyai kelimpahan ekspresi yang lebih rendah (FPKM 26.47, 3.89, 3.4, dan 3.83, masing-masing) berbanding dengan gen enzim lain (Jadual 6). Sama ada perubahan ekspresi ketiga-tiga gen tersebut boleh mempengaruhi pengeluaran lignin dalam C. deserticola layak untuk dikaji lebih lanjut. PAL ialah enzim utama dalam biosintesis lignin dan juga terlibat dalam biosintesis fenilpropanoid, resveratrol, flavonoid, dan kumarin [71-74]. Kami mengesan empat gen PAL yang berbeza dalam genom C. deserticola (S2 Fig) yang bertepatan dengan PAL dikodkan oleh keluarga multigen kecil [39, 43, 45-49] dan seterusnya membuktikan ia mungkin memainkan peranan penting dalam fluks karbon metabolik .

PhG ialah bahan aktif utama dalam C. deserticola. Gen yang terlibat dalam biosintesis phenylethanol adalah penting untuk kualiti C. deserticola. Kami menyimpulkan dua laluan biosintesis berbeza bagi etanol fenil dan 17 gen enzim yang terlibat dalam biosintesis PhG dalam batang C. deserticola. Kemungkinan proses pasca-kafeik/asid ferulik (Rajah 3) juga disimpulkan buat kali pertama berdasarkan formula struktur perantaraan dan sifat pemangkin bagi enzim yang sepadan, di mana asid kafeik/ferulik akan mula-mula dioksidakan kepada terbitan fenilpiruvat; kemudian, kumpulan karboksil telah dilucutkan oleh dekarboksilase; akhirnya, kumpulan aldehid ditukar semula kepada kumpulan alkohol oleh dehidrogenase. Ini adalah aplikasi pertama teknologi penjujukan akhir berpasangan Illumina untuk menyiasat keseluruhan transkrip C. deserticola dan untuk memasang bacaan RNA-seq tanpa genom rujukan. Kajian ini akan menyediakan sumber dan jujukan gen yang berguna untuk penyelidikan genomik dan proteomik berfungsi pada C. deserticola pada masa hadapan.

Kesimpulan

Dalam kajian ini, kami memprofilkan transkriptom batang C. deserticola berdasarkan data penjujukan pemprosesan tinggi, mengenal pasti gen yang terlibat dalam laluan biosintesis lignin, dan juga menyimpulkan laluan biosintesis berpotensi PhGs untuk kali pertama, yang pastinya akan mempercepatkan pemahaman proses fisiologi yang tidak jelas dan nilai perubatan yang besar dalam tahap molekul. Sehingga kini, ini adalah percubaan pertama untuk mengumpulkan keseluruhan transkriptom C. deserticola stem dan mengesan laluan biosintesis komponen perubatan menggunakan set data penjujukan berasaskan Illumina. Kajian kami mungkin menggalakkan pembangunan ubat-ubatan semula jadi dan pemilihan kultivar dengan ciri-ciri perubatan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%