Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Hubungi: joanna.jia@wecistanche.com

Abstrak

Teknologi LC ialah kaedah diiktiraf yang digunakan di seluruh dunia untuk menilai kualiti ubat-ubatan tradisional Cina (TCM). Kualiti TCM mempunyai kesan langsung ke atas keberkesanannya. Oleh itu, untuk mendedahkan secara menyeluruh bagaimana TCM melaksanakan keberkesanannya, pertama sekali, adalah perlu untuk memahami asas bahan untuk keberkesanannya, dan kemudian untuk mengawal kualiti sebatian aktif. Penggunaan kaedah perhubungan spektrum-kesan adalah penting untuk menentukan asas bahan farmakologi. Matlamat kertas ini adalah untuk menyiasat korelasi asas antara profil kimia dan aktiviti estrogenikCistanche, untuk mendedahkan sebatian aktif. Profil kimia bagiCistanchetelah direkodkan menggunakan HPLC/Q-TOF-MS/MS, dan aktiviti estrogenik ditentukan oleh ujian pertumbuhan Uterus dan ujian MTT. Kemudian dengan menggabungkan keputusan analisis bivariat, analisis komponen utama, dan kaedah analisis korelasi kelabu, lima belas sebatian aktif telah dikenalpasti. Ia adalah 8-asid epilognik, salidroside, syringalide A 3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A,echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2'-acetylacteoside, dan dua sebatian yang tidak diketahui. Kajian ini meletakkan asas untuk kajian in vivoCistanche, dan untuk pembangunan aplikasi klinikalnya.

Cistanche boleh meningkatkan estrogen, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Kata kunci:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; aktiviti estrogenik; analisis komponen utama (PCA); Ujian pertumbuhan rahim.

Singkatan

TCM: Perubatan Tradisional Cina

HPLC/Q-TOF-MS: Kromatografi cecair berprestasi tinggi/spektrometri jisim masa penerbangan empat kali ganda

BA: analisis bivariat

PCA: analisis komponen utama

GCAM: kaedah analisis korelasi kelabu

MTT :Trypsin, 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromide

DMSO: dimetil sulfoksida

RPMI1640 Institut Memorial Taman Roswell 1640

1. Pengenalan

Baru-baru ini, TCM telah menjadi semakin popular di negara Asia dan Barat kerana kesan terapeutik yang stabil dan ketoksikan yang rendah di klinik. Akibatnya, adalah perlu untuk membangunkan jenis baru TCM dan memahami komposisi berkesan yang digunakan semasa aplikasi klinikalnya [1-6].

Pertama, hubungan kesan spektrum dikaji untuk membezakan korelasi antara cap jari kromatografi dan keberkesanan farmakodinamik. Kemudian menggunakan perhubungan untuk mencari komponen yang berkesan dalam TCM, dan untuk merumuskan piawaian kawalan untuk mencerminkan kualiti dalaman mereka. Hubungan kesan spektrum telah digunakan dalam banyak bidang penyelidikan TCM, seperti asas material TCM tunggal dan kompaun, keserasian komponen, mekanisme pemprosesan, ramalan kesan farmakologi dan pengoptimuman teknologi [7-12]. Hubungan kesan spektrum digunakan untuk mengemukakan idea dan kaedah baharu untuk meneroka bahan aktif, mengoptimumkan formula, menambah baik proses penyediaan, menjejak dan mengasingkan bahan sasaran dan untuk pembangunan ubat TCM baharu [13-17].

Cistanchetelah digunakan secara meluas untuk rawatan disfungsi seksual, sembelit, prostatitis, dan kekurangan buah pinggang. Ia mempunyai spektrum bioaktiviti yang luas termasuk kesan estrogenik, anti-penuaan, antioksida dan tindakan imun [18-19]. Secara amnya, glikosida fenilethanoid (seperti cistanoside A, tubuloside A), lignan dan glikosida iridoid dianggap sebagai juzuk farmakologi dan penanda kimia untuk kawalan kualiti Cistanche dan produknya [20-21]. Spektrum kimia bagiCistanchedari kawasan berbeza telah direkodkan menggunakan Kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) [22-23]. Dalam kajian ini, kami memilih ujian pertumbuhan rahim dan ujian proliferasi sel MCF7 untuk menilai aktiviti estrogen mereka. Analisis komponen utama, analisis bivariat, dan kaedah analisis korelasi kelabu digunakan untuk mengaitkan aktiviti estrogen dengan komponen individu. Kajian ini bertujuan untuk mengenal pasti sebatian bioaktif Cistanche yang bertanggungjawab untuk kesan estrogenik in vivo. Kajian itu meletakkan asas untuk kajian mendalam tentangCistanche.

Semua prosedur eksperimen telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Perdagangan Harbin.

Cistanchedeserticola(cd-20120227-005) telah dibeli daripada pasaran ubat dan dikenal pasti oleh Prof. Zhang Delian (Universiti Perdagangan Harbin). Diethylstilbestrol telah dibeli daripada HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 dan RPMI1640 tanpa phenol red telah dibeli daripada HyClone Company (USA). MTT dan DMSO semuanya dibeli daripada Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, Amerika Syarikat). Barisan sel kanser payudara manusia MCF7 disediakan oleh Pusat Penyelidikan Sains Hayat dan Sains Alam Sekitar (Universiti Perdagangan Harbin). Piawaian yang digunakan adalah seperti berikut: acteoside (111530- 200505), echinacoside (111670-200503), dan salidroside (110736-200628) diperoleh daripada Institut Kebangsaan untuk Kawalan Produk Farmaseutikal dan Biologi (Beijing). , China). Acetonitrile, metanol, dan asid formik adalah gred MS, manakala air adalah ultratulen. Reagen lain adalah gred analitik dan boleh didapati secara komersial.

EchinacosidedalamCistanchetubulosa mempunyai banyak kesan

2 Prosedur Eksperimen

2.1 Bahan

Sistem Agilent 1290 HPLC, sistem Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) dan stesen kerja Chemical HPLC-3D telah digunakan untuk eksperimen kimia analitik dan pemprosesan data. Air ultratulen Milli-Q digunakan untuk penyediaan sampel dan piawaian. Instrumen tambahan termasuk Analytical Balance AR1140 elektronik (Ohaus International Ltd), 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation), dan 64R High-Speed ​​Centrifuge (Beckman Coulter Allegra).

Tikus Kunming betina yang belum matang (kira-kira 21 hari lahir, disapih) seberat (12 ± 2) g, telah dibeli dari Pusat Haiwan Pangkalan Industri Biologi Kebangsaan Changchun (Changchun, China). Tikus ditempatkan di dalam bilik yang dikawal suhu (22 ± 2 darjah) dengan akses tanpa had kepada makanan dan air. Eksperimen haiwan telah dimulakan selepas lima hari penyesuaian. Tikus-tikus itu dipuasakan semalaman dengan akses percuma kepada air sebelum memberikan larutan ujian. Kajian ini dijalankan mengikut ketat mengikut cadangan dalam Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal Institut Kesihatan Kebangsaan.

2.2 Penyediaan larutan sampel

Sampel cistanche dikumpul dari sepuluh habitat yang pelbagai, iaitu Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan, dan Wilayah Hubei.

Larutan (1.0 g/mL) sampel Cistanche telah disediakan dalam air suling untuk pentadbiran oral. Kepekatan diethylstilboestrol ialah 20ug/mL dan digunakan sebagai penyelesaian kawalan positif. Penyelesaian (1.0 g/mL) sampel Cistanche telah disediakan dalam 50 peratus asetonitril. Acteoside, echinacoside dan salidroside (2.0 mg setiap satu) telah dilarutkan dalam 10 mL larutan asetonitril 50 peratus. Kedua-dua sampel dan penyelesaian standard telah ditapis menggunakan penapis 0.45-μm sebelum analisis.

2.3 Keadaan LC-MS

Waters Symmetry Shield RP18 (3.9 mm×150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA) telah digunakan untuk menganalisis sampel. Fasa mudah alih terdiri daripada asetonitril (A) dan 0.2 peratus (v/v) larutan akueus asid formik (B) dan dipam pada kadar aliran 0.5 mL/min. Isipadu suntikan setiap sampel ialah 10 μL. Program elusi kecerunan adalah seperti berikut: Fasa mudah alih A dimulakan pada 5 peratus dan meningkat secara linear kepada 23 peratus pada 35 minit. Penyelesaian A kemudiannya dinaikkan kepada 25 peratus (35 hingga 65 minit). Fasa mudah alih A kemudiannya dikurangkan kepada 5 peratus untuk 5 minit terakhir larian (65 hingga 70 minit). Suhu lajur dikekalkan pada 30 darjah. Kromatogram dipantau pada 254 nm. Tekanan gas pengatoman ialah 30 psi, dan voltan kapilari ialah 3.5 kV. Kadar aliran gas kering ditetapkan kepada 8 L/min dengan suhu 30 darjah . Spektrum jisim telah direkodkan dalam julat imbasan 100- 3,000 Da dan berada dalam mod pengimbasan ion negatif.

2.4 Penilaian cap jari

Cap jari LC sampel yang dikumpul daripada 10 kelompok berbeza telah ditubuhkan dan dipadankan secara automatik menggunakan Sistem Penilaian Kesamaan untuk Cap Jari Kromatografi TCM (versi 2012; Jawatankuasa Farmakope China, Beijing, China). Tambahan pula, peta kromatogram rujukan dijana menggunakan kaedah median. Di samping itu, analisis kelompok digunakan untuk menilai kualiti sampel daripada sepuluh habitat yang pelbagai.

2.5 Analisis komponen utama (PCA)

PCA ialah kaedah statistik multivariate. Ia boleh mengekalkan maklumat yang mencukupi daripada pemerolehan data. Dalam kajian ini, puncak ciri daripada kromatogram LC telah disaring lebih lanjut oleh PCA dan bertujuan untuk mengenal pasti sebatian aktif berdasarkan hubungan kesan spektrum.

2.6 Ujian pertumbuhan rahim

Tikus dibahagikan kepada 12 kumpulan (10 setiap kumpulan). Penyelesaian sampel yang disediakan daripada Cistanche dikumpul dari sepuluh habitat yang pelbagai dan ditadbir dua kali sehari (pagi dan petang) secara gavage pada dos 30 g/kg berat badan selama empat hari. Kumpulan kawalan kosong dan positif terdiri daripada jumlah yang sama air suling dan larutan diethylstilboestrol dan ditadbir dua kali sehari selama empat hari. Pada hari kelima, sampel darah yang mengandungi dadah telah ditarik balik daripada tikus yang telah dibius. Sampel telah disentrifugasi (5,000 rpm, 10 min), dan supernatan (sampel serum yang mengandungi ubat) diasingkan. Sampel serum yang mengandungi ubat dinyahaktifkan dengan memanaskan pada 56 darjah dalam mandi air selama 30 minit dan ditapis melalui penapis 0.22-μm sebelum ujian MTT. Seiring dengan itu, rahim tikus segera dipotong dan ditimbang untuk mengira indeks berat rahim. Eksperimen haiwan telah dimulakan selepas lima hari penyesuaian. Tikus telah berpuasa semalaman dengan akses percuma kepada air sebelum pemberian larutan ujian. Kajian ini telah dijalankan mengikut ketat mengikut cadangan Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal Institut Kesihatan Kebangsaan. Semua prosedur eksperimen telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Perdagangan Harbin. Semua prosedur yang berpotensi menimbulkan tekanan dilakukan di bawah anestesia natrium pentobarbital.

2.7 ujian MTT

Sel MCF7 telah dikultur bersama dengan RPMI 1640 tanpa fenol merah (mengandungi 5 peratus CDT-FBS) selama empat hari. Sel-sel telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 2,000 sel/telaga. Budaya yang melekat telah dicapai dan selepas 72 jam kultur, sel-sel telah dikultur bersama dalam medium RPMI 1640 yang mengandungi sampel serum daripada tikus yang dirawat Cistanche. Eksperimen telah dijalankan dalam enam ulangan. Selepas itu, 20 μL larutan MTT (5 mg/mL dalam PBS) telah ditambah kepada setiap telaga, dan sel-sel telah diinkubasi selama 4 jam. Selepas penyingkiran sederhana, 150 µL DMSO telah ditambah untuk menghasilkan produk formazan, dan plat digoncang dalam gelap untuk larut sepenuhnya. Penyerapan diukur pada 570 nm menggunakan Pembaca Microplate. Kadar percambahan dikira sebagai nilai penyerapan purata kumpulan serum yang mengandungi ubat dibahagikan dengan nilai penyerapan purata kumpulan kawalan kosong (sel yang dikultur bersama dalam RPMI 1640 tanpa serum).

2.8 Analisis statistik

Ujian-t sampel berpasangan (dua ekor) digunakan untuk mengenal pasti perbezaan signifikan secara statistik antara nilai dalam kumpulan kawalan kosong dan eksperimen. Perbezaan tersebut dianggap ketara pada tahap keyakinan 95 peratus (p <>

PCA digunakan untuk menilai kawasan puncak ciri dalam kromatogram sampel daripada sepuluh habitat pelbagai. Analisis bivariat dan analisis korelasi Kelabu digunakan untuk menilai korelasi kawasan puncak dan aktiviti estrogeniknya. Kaitan itu dikira oleh statistik perisian statistik SPSS (SPSS untuk Windows 21.0, SPSS Inc., USA). Perbezaan itu dianggap ketara pada tahap keyakinan 95 peratus (dua ekor).

Kelulusan etika: Penyelidikan yang dijalankan tidak berkaitan dengan penggunaan manusia atau haiwan.

cistanche acteoside mempunyai banyak fungsi

3. Keputusan dan perbincangan

3.1 Analisis kluster dan penilaian persamaan

Sisihan piawai relatif bagi masa pengekalan dan kawasan puncak puncak ciri ialah {{0}}.58 dan 0.34 peratus untuk ketepatan, 0.52 dan {{8} }.31 peratus untuk kebolehulangan dan {{10}}.19 dan 0.13 peratus untuk kestabilan, masing-masing. Penemuan ini menunjukkan bahawa kaedah penubuhan cap jari LC kami adalah munasabah dan boleh dipercayai. Persamaan kromatogram bagi sepuluh sampel adalah lebih besar daripada 0.9. Puncak biasa untuk semua sampel tidak dapat mewakili konstituen ciri Cistanche sepenuhnya, kerana puncak itu mungkin telah hilang. Oleh itu, nombor padanan sampel telah dilaraskan daripada 26 kepada 20 untuk mendapatkan peta kromatogram yang lebih tepat. Sebanyak 26 puncak telah diperolehi, dan jumlah kawasannya adalah lebih besar daripada 0.8 berbanding dengan kawasan puncak keseluruhan dalam sampel. Oleh itu, kami menyimpulkan bahawa puncak kromatografi ini secara berkesan dapat mencerminkan konstituen kimia utama Cistanche. Keputusan analisis kelompok ditunjukkan dalam Rajah 1. Sebanyak sepuluh habitat pelbagai dibahagikan kepada tiga kategori seperti berikut: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang dan 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia dan 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Trend analisis kluster menunjukkan bahawa habitat herba ubatan adalah serupa apabila berada di bawah ambang. Tetapi dengan peningkatan ambang, iklim dan keadaan pertumbuhan habitat adalah hampir. Ia menunjukkan bahawa analisis kluster bukan sahaja dapat membezakan pelbagai habitat dengan baik tetapi juga mencerminkan pertalian antara mereka.

3.2 Pengenalpastian juzuk kimia

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Semakin tinggi, nilai mutlak beban Eigen, semakin tinggi pengaruh sebatian pada indeks estrogen.

Kromatogram Cistanche dan sampel standard dibandingkan untuk mengenal pasti komponen individu di bawah keadaan LC-MS yang sama. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1, sejumlah 26 juzuk telah dikenal pasti berdasarkan masa pengekalan dan data MS [24-26]. Bahan aktif ditadbir secara lisan dalam bentuk campuran dan bukannya monomer kerana perubatan tradisional Cina adalah dalam bentuk campuran untuk memainkan peranan terapeutik. Sebatian tunggal selepas diasingkan secara individu tidak didapati memainkan peranan. Matlamat kami adalah untuk mendedahkan sebatian yang mempunyai aktiviti estrogenik dalam komponen Cistanche [23-30] yang diketahui, dan oleh itu tidak memilih NMR dan cara teknikal lain untuk mengesahkan identiti mereka. Puncak 1 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 373 (C16H22O10), yang sama dengan komposisi unsur asid geniposidik. Ini disokong oleh kehilangan bahagian glukosa yang menghasilkan ion serpihan dengan nisbah m/z 211. Puncak 2 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 461 (C20H30O12), yang sama dengan komposisi unsur. decaffeoylacteoside, dan disokong oleh kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk pemecahan dengan nisbah m/z 315. Puncak 4 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 375 (C16H24O10), yang sama dengan komposisi unsur 8-asid epilognik. Kehilangan bahagian glukosa, membentuk pemecahan dengan nisbah m/z 213, seterusnya menyokong inferens. Puncak 6 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 607 (C29H36O14), yang sama dengan komposisi unsur syringalide A3'- - l-rhamnopyranoside.

Kehilangan sekeping caff, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 445, seterusnya menyokong inferens. Puncak 8 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 799 (C36H48O20), yang sama dengan komposisi unsur cistanoside A. Kehilangan sekeping caff, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 637, seterusnya menyokong inferens. Puncak 11 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 487 (C21H28O13 ), yang sama dengan komposisi unsur cistanoside F. Ini disokong oleh kehilangan bahagian rhamnosyl yang menghasilkan ion serpihan dengan m/z nisbah 341, dan kehilangan bahagian caff lain membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 179, seterusnya menyokong inferens. Puncak 12 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 813 (C37H50O20), yang sama dengan komposisi unsur cistanoside B. Kehilangan bahagian glukosa, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 651, seterusnya menyokong inferens. Puncak 13 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 827 (C37H48O21), yang sama dengan komposisi unsur tubuloside A. Kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk pemecahan dengan nisbah m/z 681, seterusnya menyokong inferens. Puncak 14 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 637 (C30H38O15), yang sama dengan komposisi unsur cistanoside C. Kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 491, seterusnya menyokong inferens.

Puncak 15 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 591 (C29H36O13), yang sama dengan komposisi unsur osmanthuside B. Kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 445, seterusnya menyokong inferens. Puncak 16 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 623 (C29H36O15), yang sama dengan komposisi unsur acteoside. Kehilangan sepotong caff, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 461,seterusnya menyokong inferens. Puncak 18 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 623 (C29H36O15), yang sama dengan komposisi unsur isoacteoside. Kehilangan sepotong caff, forrepeak15 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 591 (C29H36O13), yang sama dengan komposisi unsur osmanthuside B. Kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 445, selanjutnya menyokong inferens. Puncak 16 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 623 (C29H36O15), yang sama dengan komposisi unsur acteoside. Kehilangan sekeping caff, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 461, seterusnya menyokong inferens. Puncak 17 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 623 (C29H36O15), yang sama dengan komposisi unsur cis-acteoside. Kehilangan sekeping caff, membentuk serpihan ioion serpihan da dengan nisbah m/z 461, seterusnya menyokong inferens. Puncak 21 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 653 (C30H38O16), yang sama dengan komposisi unsur campneoside Ⅰ.

Kehilangan bahagian caff membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 491, dan kehilangan bahagian rhamnosyl yang lain membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 345, seterusnya menyokong inferens. Puncak 22 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 665 (C31H38O16), yang sama dengan komposisi unsur tubuloside B. Kehilangan bahagian CH3 CO membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 623, dan kehilangan bahagian caff lain membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 461, seterusnya menyokong inferens. Puncak 23 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 639 (C29H36O16), yang sama dengan komposisi unsur campneoside. Kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 493, seterusnya menyokong inferens. Puncak 24 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 665 (C31H38O16), yang sama dengan komposisi unsur 2'-asetillakteosida. Kehilangan bahagian Ac, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 623, dan kehilangan bahagian kaf lain membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 461, seterusnya menyokong inferens. Puncak 25 menunjukkan ion terdeprotonasi yang dominan dengan nisbah m/z 445 (C20H30O11), yang sama dengan komposisi unsur cistanoside G. Kehilangan bahagian rhamnosyl, membentuk ion serpihan dengan nisbah m/z 299, seterusnya menyokong inferens. Struktur sebatian disenaraikan dalam Rajah 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Puncak ini adalah seperti berikut: 9, 12, 14, dan 15. Akibatnya, echinacoside, cistanoside B, osmanthuside B, dan acteoside, bersamaan dengan sejumlah 4 puncak telah dipilih sebagai pembolehubah wakil untuk aktiviti estrogenik (Rajah 3).

.

3.4 Penentuan aktiviti estrogenik

Nisbah berat basah rahim kepada berat badan setiap tikus telah dikira (Rajah 4). Haiwan yang terdedah kepada Cistanche dari sembilan habitat mempamerkan aktiviti estrogenik yang ketara dengan meningkatkan berat rahim mereka berbanding dengan tikus dalam kumpulan kawalan kosong. Rajah 4 selanjutnya menunjukkan kadar percambahan sel MCF7 yang dirawat dengan serum tikus yang dirawat Cistanche. Sel-sel yang dirawat dengan sera tikus yang diberi Cistanche dari sepuluh habitat menunjukkan pertumbuhan yang jauh lebih tinggi berbanding dengan sel-sel tanpa rawatan.

3.5 Analisis bivariat

Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa berat rahim tikus Kunming betina yang tidak matang meningkat dan percambahan sel kanser payudara manusia MCF7 telah dipromosikan. Penemuan ini mengesahkan aktiviti estrogenik Cistanche. Rajah 5 menunjukkan indeks rahim dan kadar percambahan sel MCF7 bagi juzuk ini. Pekali korelasi Pearson digunakan untuk mengira kawasan puncak relatif, yang sepadan dengan aktiviti estrogenik sampel. Pekali korelasi lebih tinggi daripada 0.3 dianggap signifikan (p < 0.05),="" manakala="" pekali="" korelasi="" lebih="" tinggi="" daripada="" 0.5="" dianggap="" sangat="" ketara="" (p="">< 0.01).="" berdasarkan="" keputusan,="" cistanche="" telah="" ditunjukkan="" mempunyai="" aktiviti="">

Sebanyak sembilan sebatian berkorelasi dengan ketara dengan pertambahan berat rahim (p < {{0}}.05),="" manakala="" sepuluh="" sebatian="" berkorelasi="" dengan="" ketara="" dengan="" percambahan="" selular="" mcf7="" (p="">< 0.05).="" sebatian="" yang="" berkorelasi="" secara="" signifikan="" dengan="" berat="" rahim="" dan="" percambahan="" sel="" ialah="" 8-asid="" epilognik,="" salidroside,="" syringalide="" a3'-="" -="" l-rhamnopyranoside,="" cistanoside="" a,="" cistanoside="" b,="" cistanoside="" c,="" osmanthuside="" b,="" acteoside,="" isoacteoside,="" tubuloside="" b,="" 2'-acetylacteoside,="" dan="" dua="" sebatian="" yang="" tidak="" diketahui="" (rajah="" 5).="" tiga="" belas="" sebatian="" ini="" mempunyai="" aktiviti="">

3.6 Kaedah analisis korelasi kelabu

Rajah 6 menunjukkan korelasi relatif bagi puncak ciri 26 sebatian dengan indeks rahim, dan Rajah 7 menunjukkan korelasi relatif puncak ciri bagi 26 sebatian dengan kadar percambahan selnya. Sebanyak tiga sebatian mempamerkan korelasi tertinggi dengan indeks rahim, iaitu 8-asid epiloganik, cistanoside F, dan acteoside (Rajah 6, dalam susunan menurun); manakala enam sebatian yang menunjukkan korelasi tertinggi dengan percambahan sel MCF7 ialah echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, osmanthuside B, isoacteoside, dan tubuloside B (Rajah 7, dalam susunan menurun). Korelasi relatif echinacoside, osmanthuside B, acteoside dan isoacteoside adalah lebih tinggi daripada 0.5.

3.7 Pengoptimuman keadaan LC-MS

Untuk mendapatkan peta kromatogram yang lebih baik, metanol dan asetonitril telah dibandingkan. Pada akhirnya, gabungan asid formik akueus (0.2 peratus , v/v) - asetonitril ialah fasa mudah alih terbaik untuk pengasingan. Dalam julat pengimbasan panjang gelombang penuh 200-400nm, 254nm telah dipilih sebagai yang optimum. Selain itu, parameter MS juga telah ditambah baik. Mod pengimbasan ion negatif telah dipilih kerana ia meningkatkan nilai tindak balas kebanyakan ramuan dalam Cistanche.

4. Kesimpulan

Teknologi LC-Q-TOF-MS digunakan untuk mengenal pasti konstituen aktif estrogenik Cistanche. Kajian ini menggambarkan bahawa 8-asid epiloganik, salidroside, syringalideA3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside 2'-acetylacteoside, dan dua sebatian yang tidak diketahui adalah juzuk aktif utama Cistanche. Walau bagaimanapun, penemuan ini memerlukan kajian lanjut untuk meneroka kesan in vivo dan mekanisme tindakan konstituen.

cistancheacteoside mempunyai banyak fungsi, seperti meningkatkan sistem imun

Penghargaan:

Projek ini disokong oleh Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (No. 81073015), Yayasan Saintifik Alam Semula Jadi Wilayah Heilongjiang (ZD2017014), dan pelan latihan bakat inovatif Muda Kolej di Wilayah Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . Penulis mengisytiharkan bahawa tidak ada konflik kepentingan mengenai penerbitan kertas ini.

Rujukan

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitokimia, farmakologi , kawalan kualiti dan penyelidikan masa depan Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Kajian semula, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Strategi metabolomik pseudotargeted bersepadu dan global digunakan untuk menapis penanda kawalan kualiti Citrus TCMs, Dubur. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., Novel dan Kromatografi Praktikal "Cap Jari-ROC-SVM " Strategi Digunakan untuk Analisis Kualiti Suntikan Perubatan Tradisional Cina: Menggunakan Suntikan KuDieZi sebagai Kajian Kes, Molekul., 2017, 22(7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Menyaring penanda kawalan kualiti bioaktif pil titisan QiShenYiQi berdasarkan hubungan antara prestasi ultra tinggi cap jari kromatografi cecair dan aktiviti perlindungan vaskular, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Aplikasi analisis statistik multivariate dan pemikiran dalam kawalan kualiti perubatan Cina, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, data komponen ciri berorientasikan HPLC/qTOF-MS set dan analisis kemometrik untuk kawalan kualiti holistik penyediaan TCM kompleks: Pil Niuhuang Shangqing sebagai contoh, J. Pharm. Berbiomed. Dubur., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., AP Jimat, Nilai Ramalan Negatif Tinggi, Prevalensi Rendah dan Kesan Spektrum: Berhati-hati dalam Tafsiran, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Menyaring Komponen Hepatotoksik dalam Euodia rutaecarpa oleh UHPLC-QTOF/MS Berdasarkan Hubungan Spektrum-Ketoksikan, Molekul., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Pemeriksaan dan pengenalpastian komponen hepatotoksik dalam Evodia rutaecarpa berdasarkan hubungan kesan spektrum dan UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Kesan Spektrum dan Bias Spektrum dalam Prestasi Ujian Saringan untuk Kemerosotan Kognitif Ringan Amnestic: Apakah Implikasi Klinikal?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Hubungan kesan spektrum sebagai pendekatan sistematik untuk penyelidikan perubatan tradisional Cina: status semasa dan perspektif masa depan, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Hubungan kesan spektrum antara cap jari UPLC dan bioaktiviti akar sekunder mentah Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) dan tiga produknya yang diproses pada pertumbuhan mitokondria ditambah dengan analisis korelasi kanonik, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Hubungan Kesan Spektrum Antara Cap Jari Kimia dan Kesan Antibakteria Lonicerae Japonicae Flos dan Lonicerae Flos Base pada UPLC dan Microcalorimetry, Front. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Kesan spektrum dalam ujian untuk ramalan risiko, pemeriksaan dan diagnosis, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Mengesan sebatian hemostatik novel daripada produk pemanasan jumlah flavonoid dalam Flos Sophorae mengikut spektrum -hubungan kesan dan kromatografi lajur, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Penyiasatan ke atas hubungan kesan spektrum Da-Huang-Fu- Zi-Tang dalam tikus dengan kaedah UHPLC-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Kajian tentang hubungan kesan spektrum rhizoma Rhei, korteks Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus dan formulanya, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Aktiviti antiosteoporotik echinacoside dalam tikus ovariectomized, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Kesan anti-hiperglisemik dan hipolipidemik Cistanche tubulosa dalam tikus DB/DB diabetes jenis 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Glikosida phenylethanoid berasilat , echinacoside dan acteoside dari Cistanche tubulosa, meningkatkan toleransi glukosa pada tikus, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Phenylethanoid glycosides dengan aktiviti anti-radang daripada batang Cistanche deserticola yang dikultur di padang pasir Tarim, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Analisis kuantitatif Cistanches Herba menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi ditambah dengan pengesanan tatasusunan diod dan tinggi- spektrometri jisim resolusi digabungkan dengan kaedah kemometrik, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Pencirian struktur dan pengenalpastian glikosida phenylethanoid daripada Cistanches deserticola YC Ma oleh UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Dubur., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Aktiviti Antiproliferatif Phenylpropanoids Diasingkan daripada Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Penentuan serentak komponen dengan kekutuban yang luas dan julat kandungan dalam Cistanche tubulosa menggunakan kromatografi interaksi hidrofilik interaksi fasa songsang bertandem-tandem spektrometri jisim, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Penggunaan metabolomik berasaskan 1H NMR untuk diskriminasi bahagian yang berbeza dan pembangunan aliran kerja pemprosesan baharu untuk Cistanche deserticola, Acta. Pharm. Dosa. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Kajian tentang juzuk dan bioaktiviti tubulosa Cistanche segar, Ph.D. tesis, Universiti Farmaseutikal Shenyang, Shenyang, China, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Profil metabolik acteoside yang dihasilkan oleh bakteria usus manusia atau tikus atau enzim usus in vitro menggunakan UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Pencirian sistematik metabolit echinacoside dan acteoside daripada Cistanche tubulosa dalam plasma tikus, hempedu, air kencing dan najis berdasarkan UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Satu cara metabolik untuk menyiasat halangan berkaitan yang menyebabkan bioavailabiliti yang lemah dalam penghantaran oral isoacteoside pada tikus yang menggunakan kromatografi cecair prestasi ultra tinggi/ quadrupole time-of-flight spektrometri jisim tandem, Rapid. Commun. Spektrom Jisim, 2017(4), 371-380.