Induksi Pantas Kekebalan Perlindungan Terhadap Wabak Pneumonik Oleh Yersinia Pestis Polimer F1 Dan Antigen LcrV

Abstrak:

Dalam kajian baru-baru ini, kami menunjukkan bahawa vaksinasi dengan antigen kapsul F1 polimer patogen wabak Yersinia pestis membawa kepada induksi pantas tindak balas imun humoral pelindung melalui pengaktifan penting sel B1b seperti semula jadi. Sebaliknya, versi monomerik F1 gagal melindungi haiwan yang divaksin dengan segera dalam model wabak bubonik ini. Dalam kajian ini, kami mengkaji keupayaan F1 untuk memberikan permulaan imuniti perlindungan yang cepat dalam model tetikus wabak pneumonik yang lebih mencabar. Vaksinasi dengan satu dos F1 yang diserap pada aluminium hidroksida menimbulkan perlindungan berkesan terhadap pendedahan intranasal maut berikutnya kepada ketegangan Y. pestis yang ganas sepenuhnya dalam masa seminggu. Menariknya, penambahan antigen LcrV memendekkan masa yang diperlukan untuk mencapai imuniti perlindungan yang pantas kepada 4-5 hari selepas vaksinasi. Seperti yang ditemui sebelum ini, struktur polimer F1 adalah penting dalam memberikan tindak balas perlindungan yang dipercepatkan yang diperhatikan oleh vaksinasi dengan LcrV. Akhir sekali, dalam kajian panjang umur, satu vaksinasi dengan polimer F1 menyebabkan tindak balas humoral yang lebih tinggi dan lebih seragam daripada vaksinasi serupa dengan monomerik F1. Walau bagaimanapun, dalam keadaan ini, sumbangan dominan LcrV kepada imuniti tahan lama terhadap cabaran paru-paru yang membawa maut telah diulangi.

Terdapat hubungan rapat antara tindak balas imun humoral pelindung dan imuniti. Tindak balas imun humoral pelindung adalah tindak balas pertahanan badan terhadap patogen asing, yang sebahagian besarnya disertai oleh antibodi. Kekebalan merujuk kepada keupayaan tubuh untuk menentang pencerobohan patogen asing. Tindak balas imun humoral pelindung boleh menggalakkan kesan membunuh sel imun, meningkatkan daya tahan badan, dan dengan itu meningkatkan imuniti. Di samping itu, tindak balas imun humoral pelindung juga boleh mengawal keseimbangan sistem imun, mengawal aktiviti sistem imun, dan mengelakkan tindak balas berlebihan dan berlakunya penyakit autoimun. Oleh itu, tindak balas imun humoral pelindung adalah penting untuk mengekalkan kesihatan badan dan meningkatkan imuniti. Selain itu, imuniti manusia juga sangat penting, yang dapat mengelakkan kita daripada diserang virus. Cistanche boleh meningkatkan imuniti. Cistanche kaya dengan pelbagai bahan antioksidan, seperti vitamin C, vitamin C, karotenoid, dan lain-lain. Bahan-bahan ini boleh menghilangkan radikal bebas, Mengurangkan tekanan oksidatif dan meningkatkan daya tahan sistem imun.

Klik manfaat cistanche tubulosa

Kata kunci:

vaksinasi; wabak pneumonik; perlindungan pantas; polimer F1; monomer F1; LcrV; model tetikus.

1. Pengenalan

Bakteria Gram-negatif Yersinia pestis merupakan agen etiologi wabak bubonik dan pneumonik. Beratus-ratus juta telah meninggal dunia disebabkan sifat jangkitan maut yang ditimbulkan oleh patogen yang memusnahkan ini dalam tiga wabak utama dan dalam banyak wabak tempatan yang direkodkan dalam dua milenium yang lalu [1,2]. Disebabkan oleh infektiviti dan kematian yang tinggi, Y. pestis diklasifikasikan sebagai agen biokeganasan yang berpotensi (https://www.cdc.gov/plague/ bioterrorism/index.html, diakses pada 9 Julai 2021). Sejak penemuan dan penggunaan antibiotik yang meluas, kelaziman dan kematian yang disebabkan oleh wabak telah berkurangan secara mendadak [3,4].

Namun begitu, terapi antibiotik terhadap wabak mempunyai batasan; untuk menjadi berkesan, rawatan mesti diberikan sejurus selepas permulaan simptom yang, pada mulanya, adalah serupa dengan jangkitan pernafasan atas biasa dan oleh itu sering tersalah diagnosis. Sebarang kelewatan dalam pemberian antibiotik khusus untuk terapi wabak boleh menjejaskan keberkesanannya dan mengakibatkan kematian yang ketara di kalangan individu yang dirawat [5]. Pengasingan baru-baru ini bagi strain Y. pestis virulen yang tahan kepada pelbagai antibiotik, termasuk yang disyorkan untuk terapi, dan kebimbangan bahawa fenotip yang diubah sedemikian mungkin secara berniat jahat dimasukkan ke dalam strain ganas untuk peperangan biologi atau bioterorisme memerlukan pembangunan langkah balas tambahan [6-8] . Sesungguhnya, penggunaan antibiotik barisan kedua baru-baru ini, modaliti terapeutik tambahan, dan gabungan terapi antibiotik dan fag menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam model tetikus wabak pneumonik [9,10].

Kami baru-baru ini telah menunjukkan menggunakan model tetikus wabak bubonic bahawa pemberian antigen kapsul F1 Y. pestis menimbulkan imuniti perlindungan dalam beberapa hari dan, oleh itu, boleh berfungsi sebagai campur tangan terapeutik untuk mencegah penyakit [11,12]. Permulaan perlindungan yang cepat ini melibatkan pengaktifan pantas sel B1b seperti semula jadi yang berada dalam rongga peritoneal dan pleura, mengakibatkan pengeluaran antibodi anti-F1 IgM dan IgG peredaran darah [11,12]. Struktur polimer F1 adalah penting untuk induksi pantas imuniti anti-wabak, seperti yang ditunjukkan oleh pemerhatian bahawa, bertentangan dengan polimer F1, protein F1 permutasi pekeliling monomerik yang direka bentuk (monoF1) gagal untuk dikaitkan dengan sel B1b peritoneal sejurus selepas imunisasi, dan Oleh itu, pengeluaran antibodi anti-F1 telah ditangguhkan [12]. Dalam kajian ini, menggunakan model tetikus jangkitan Y. pestis intranasal, kami mengkaji keupayaan antigen F1 untuk memberikan imuniti perlindungan yang cepat terhadap wabak pneumonik, yang mewakili manifestasi penyakit yang paling teruk.

Kajian ini membuktikan bahawa, seperti dalam kes imuniti wabak bubonik, sifat polimer F1 adalah penting untuk imuniti cepat serta tahan lama selepas vaksinasi dengan satu dos antigen. Oleh kerana antigen F1 dan LcrV mewakili calon vaksin subunit anti-wabak yang paling berkemungkinan dan ditunjukkan untuk menimbulkan imuniti perlindungan yang cepat dalam model tetikus wabak pneumonik [13], kami melanjutkan kajian ini dengan menangani kemungkinan mempercepatkan lagi pemasangan perlindungan terhadap wabak pneumonik oleh gabungan F1 dengan formulasi LcrV.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Pernyataan Etika

Kajian ini telah dijalankan mengikut ketat dengan cadangan untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal Institut Kesihatan Kebangsaan. Semua eksperimen haiwan dilakukan mengikut undang-undang Israel dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika untuk eksperimen haiwan di Institut Penyelidikan Biologi Israel (Nombor Permit: IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). Berikutan cabaran intranasal, tikus dipantau setiap hari. Titik akhir yang berperikemanusiaan telah digunakan dalam kajian survival kami. Tikus yang menunjukkan kehilangan refleks pembetulan telah dislokasi oleh terkehel serviks.

2.2. Haiwan

Tikus betina inbred C67BL/6 berumur enam hingga lapan minggu telah dibeli dari Envigo (Jerusalem, Israel). CD lelaki dan perempuan-1 yang sama umur telah dibeli dari Charles River (UK).

2.3. Imunisasi Haiwan dengan Antigen Dimurnikan

PolyF1: Protein polimer F1 telah disucikan daripada supernatan kultur sel E. coli yang menyatakan operon caf1 daripada strain Y. pestis Kimberley53, seperti yang diterangkan sebelum ini dalam [14]. Berat molekul F1 yang telah dimurnikan ditentukan untuk lebih tinggi daripada 1000 kDa oleh kromatografi pengecualian saiz menggunakan lajur Superdex 200 (Cytiva, MA, USA).

MonoF1: ​​Pengekodan plasmid pAH34L untuk monomerik F1 (cpCaf1) diperoleh daripada Dr. Daniel Peters dan Prof. Jeremy H. Lakey, Universiti Newcastle, UK [15]. pAH34L telah diperkenalkan ke dalam Lemo21 (DE3) E. coli yang dibeli daripada New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Transforman yang dipilih secara rawak ditanam pada 37 ◦C dan 220 rpm dalam sup Terrific ditambah dengan ampicillin (200 µg/mL). Ekspresi telah diinduksi pertengahan log dengan penambahan isopropil -thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM), dan kultur kemudiannya diinkubasi pada 18 ◦C dan 220 rpm untuk tambahan 19 jam. Pelet bakteria ditimbang (berat basah) dan dilarutkan dengan reagen lisis sel CelLytic™ B mengikut arahan pengilang (Merck-Sigma, Rehovot, Israel).

Protein gabungan Tol3–cpCaf1 rekombinan telah disucikan oleh kromatografi cecair tekanan termudah (PFLC) pada lajur HisTrap™ HP mengikut garis panduan pengilang (Cytiva, MA, USA). Bahagian Tol3 dipisahkan daripada cpCaf1 dengan belahan dengan trombin (Merck-Sigma, Rehovot, Israel) dan penyerapan semula bekas pada lajur HisTrap™ HP yang dijana semula. Bahagian cpCaf1 (monoF1) dikumpulkan daripada pecahan aliran melalui dan didialisis secara meluas terhadap 1 × PBS. Endotoksin telah dialih keluar melalui kaedah pemisahan fasa Triton X-114, seperti yang diterangkan sebelum ini dalam [16]. Kuantiti protein diukur menggunakan kaedah asid bicinchoninic (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). Ketulenan F1 monomerik telah disahkan oleh SDS-PAGE diikuti oleh pewarnaan biru Coomassie dan oleh analisis blot Barat menggunakan antibodi anti-F1 arnab, seperti yang diterangkan sebelum ini dalam [11].

LcrV: Urutan pengekodan LcrV panjang penuh daripada strain Y. pestis Kimberley53 yang virulen telah diklon ke dalam vektor ekspresi pGEX (GE Healthcare, Chicago, IL, Amerika Syarikat) dan diperkenalkan ke dalam sel E. coli. Urutan pengekodan LcrV didapati sama dengan LcrV strain Y. pestis CO92. LcrV rekombinan telah dihasilkan dan disucikan seperti yang diterangkan oleh Leary et al. [17]. Endotoksin telah dikeluarkan daripada LcrV yang telah disucikan seperti yang diterangkan di atas.

Sebanyak 20 hingga 160 µg poliF1 dan LcrV atau 80 µg monoF1 telah diserap pada 2 peratus gel aluminium-hidroksida (AlOH) (Brennentag Biosector, Denmark) kepada kepekatan akhir 0.36 peratus . Tikus individu telah diimunisasi secara subkutan menggunakan isipadu tetap 200 µL yang diberikan ke bahagian bawah belakang.

2.4. Pencirian Tindak Balas Serologi

Tikus telah berdarah ekor, dan titer IgG individu yang dihasilkan terhadap F1 dan LcrV dalam serum ditentukan oleh ELISA, seperti yang dilaporkan sebelum ini dalam [11]. Titer IgG1 dan IgG3 diukur menggunakan antibodi anti-tikus kambing berkonjugasi alkali fosfatase khusus isotype (Jackson Laboratories, Farmington, CT, Amerika Syarikat).

Lavage bronchoalveolar (BAL): Tikus telah dibius dengan larutan ketamin/xylazine, dan trakea terdedah, dengan berhati-hati agar tidak menyebabkan sebarang pendarahan. Senggatan kecil telah dibuat dan {{0}}kanula fleksibel tolok (BD Neoflon™) telah dimasukkan dan diikat dengan jahitan pembedahan. Paru-paru telah dibasuh dengan 1 × PBS menggunakan picagari kunci luer 1 mL yang disambungkan ke kanula yang selamat. Cecair lavage yang tercemar dengan sebarang tanda darah telah dibuang. Cecair bilas dibersihkan dengan sentrifugasi (400× g, 4 ◦C), dan supernatan ditapis steril sebelum ELISA. Kepekatan antibodi anti-F1 dan anti-LcrV dalam cecair BAL (BALF) haiwan yang divaksin ditentukan menggunakan Mab 57 ( F1) dan Mab 59 ( LcrV) yang dicairkan yang sebelum ini dilaporkan dalam [18] sebagai lengkung piawai yang disertakan dalam setiap {{14} }plat uji telaga. Had pengesanan (LOD) untuk antibodi anti-F1 IgG dan anti-LcrV dalam BALF ditentukan masing-masing ialah 0.8 ng/mL dan 0.15 ng/mL.

2.5. Jangkitan Tikus

Jangkitan intranasal (dalam) dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini dalam [19]. Secara ringkas, gelung yang penuh dengan koloni bakteria Y. pestis Kim53 tipikal telah dituai dan dicairkan dalam sup infusi jantung (HIB, Difco) ditambah dengan 0.2 peratus xilosa dan 2.5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kepada OD660 sebanyak 0.01 dan berkembang selama 22 jam pada 28 ◦C dan 100 rpm. Pada akhir tempoh inkubasi (OD660 ≈ 4), kultur telah dibasuh dan dicairkan dalam salin (0.9 peratus NaCl) kepada dos berjangkit yang dikehendaki yang disahkan dengan mengira unit pembentuk koloni selepas penyaduran dan pengeraman pada plat BHIA (48 jam). pada 28 ◦C). Tikus telah dibius dengan campuran 0.5 peratus ketamin HCl dan 0.1 peratus xilazine dan kemudian dijangkiti secara intranasal dengan 35 µL/tikus penggantungan bakteria. LD50 intranasal bagi terikan Kim53 terhadap C57BL/6 tikus ialah 1100 cfu dan 2100 cfu terhadap CD{32}} tikus. Nilai LD50 dikira mengikut kaedah yang diterangkan oleh Reed dan Muench [20]. Morbiditi dan mortaliti tikus dipantau setiap hari selama 21 hari. Pada penghujung tempoh ini, pembersihan patogen telah disahkan dengan menyadur homogenat limpa daripada haiwan yang masih hidup ke atas plat BHIA yang ditambah dengan 200 µg/mL streptomycin (48 jam pada 28 ◦C).

2.6. Pencirian Model Tetikus Wabak Pneumonik

Tikus yang dijangkiti secara intranas telah dibius pada titik masa yang dinyatakan selepas pendedahan dengan larutan ketamin/xylazine, dan darah berheparin diambil melalui tusukan jantung. Selepas itu, nodus limfa mediastinal (mdLN), paru-paru dan limpa dipotong dan ditumbuk kepada penggantungan sel tunggal pada jaring nilon 70 µm (penapis sel, Falcon, Corning, NY, USA) dalam 1× PBS . Bilangan Y. pestis Kim53 dalam pelbagai organ dan darah ditentukan dengan menyadurkan ampaian sel yang dicairkan secara bersiri pada plat BHIA yang ditambah dengan 200 µg/mL streptomycin. Untuk analisis histologi, tikus telah dibius, dan trakea mereka dikannulasi seperti yang ditunjukkan di atas. Satu lajur (0.7 × 30 cm, KONTES, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) yang diisi dengan larutan formaldehid terkumpul (10 peratus konk. akhir) telah disambungkan ke kanula, dan paru-paru "mengembung" hanya oleh graviti. Paru-paru yang dipenuhi fiksatif disimpan dalam penimbal yang sama selama 14 hari dan kemudian diproses untuk membentuk blok tertanam parafin. Bahagian satu hingga tiga mikrometer telah diwarnai dengan pewarnaan eosin/hematoksilin (H&E) standard dan dengan kit pewarnaan Masson-Goldner (Merck, Rehovot, Israel) untuk pengesanan fibrosis. Selain itu, bahagian paru-paru telah diwarnakan untuk Y. pestis menggunakan antibodi IgG anti-F1 arnab dalaman (1:10,000) dan kit Histostain®-SP (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, USA ). Bahagian bernoda telah diimej menggunakan kamera ICC3 yang digabungkan dengan mikroskop Axioscope A1 (Zeiss, Jerman).

2.7. Analisis statistik

Kepentingan antara titer yang direkodkan dalam tikus yang tergolong dalam lebih daripada dua kumpulan ditentukan oleh Kruskal-Wallis bukan parametrik dengan ujian post hoc Dunn. Ujian peringkat log (Mantel-Cox) digunakan untuk perbandingan antara lengkung kelangsungan hidup yang diperoleh dalam pelbagai kumpulan vaksinasi. Perbezaan dianggap penting jika p Kurang daripada atau sama dengan 0.05. Pengiraan dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism.

3. Keputusan

Dalam kajian terdahulu, kami menunjukkan bahawa vaksinasi tikus dengan bentuk polimer asli antigen kapsul F1 Yersinia pestis menghasilkan perlindungan pantas terhadap wabak bubonik. Sehubungan itu, adalah dicadangkan bahawa pentadbiran F1 mungkin dianggap bukan sahaja sebagai langkah profilaksis tetapi juga sebagai campur tangan terapeutik dalam kes kecemasan seperti wabak yang melibatkan strain tahan antibiotik yang berlaku secara semula jadi atau direka bentuk secara berniat jahat [12]. Dalam laporan ini, elisitasi perlindungan pantas telah disoal siasat dalam kes wabak pneumonik menggunakan model murine yang mantap yang terdiri daripada pendedahan tikus kepada patogen melalui inokulasi intranasal. Model ini ditunjukkan untuk mengekalkan sifat patogenik yang mencirikan manifestasi pernafasan wabak pneumonik primer (Tambahan Rajah S1) [10,19,21-24].

3.1. Imuniti Perlindungan Cepat yang Diberikan oleh F1 dan LcrV dalam Model Tetikus Wabak Pneumonic

Keupayaan antigen F1 untuk mendapatkan perlindungan pantas telah diuji dengan eksperimen di mana tikus C57BL/6 telah divaksinasi dengan satu pentadbiran poliF1 terjerap AlOH (20, 80, dan 160 µg/tikus), manakala haiwan kawalan hanya disuntik dengan pembantu itu. Keupayaan tikus yang divaksin untuk bertahan daripada jangkitan intranasal maut dengan strain Y. pestis Kim53 (10LD50=11,000 cfu) telah dinilai tiga dan tujuh hari selepas vaksinasi berbanding haiwan kawalan (Rajah 1). ). Selepas tiga hari, hanya lanjutan sederhana masa untuk kematian dan kelangsungan hidup (kepentingan statistik yang tidak memuaskan) diperhatikan (Rajah 1A). Memanjangkan masa antara vaksinasi dan cabaran dengan hanya 4 hari lagi (jumlah 7 hari) membolehkan penyelamatan semua tikus yang divaksinasi dengan dos tinggi polyF1 (80 dan 160 µg/tikus) serta 87 peratus daripada tikus yang divaksin dengan dos rendah poliF1 (Rajah 1B).

Keupayaan antigen F1 untuk mendorong tindak balas imun perlindungan yang cepat terhadap wabak pneumonik menggalakkan kami untuk memeriksa sama ada imunisasi dengan antigen pelindung tambahan, LcrV, akan meningkatkan lagi keadaan imun haiwan dengan mempercepatkan permulaan imuniti perlindungan. Sesungguhnya, apabila cabaran Y. pestis yang mematikan dijalankan 3 hari selepas vaksinasi gabungan, pemberian formulasi campuran LcrV dan polyF1 (80 µg atau 160 µg setiap antigen) dapat menyelamatkan 30–50 peratus daripada tikus (Rajah 1C). Paling ketara, memanjangkan tempoh antara vaksinasi dan cabaran kepada tujuh hari memberikan perlindungan penuh kepada semua haiwan yang divaksin pada semua dos antigen (Rajah 1D). Keupayaan polyF1 sahaja atau dalam kombinasi dengan LcrV untuk memberikan imuniti perlindungan yang cepat terhadap wabak pneumonik dalam masa seminggu tidak terjejas dengan meningkatkan dos cabaran pendedahan intranasal sebanyak sepuluh kali ganda (Rajah 1E), mengesahkan keteguhan keadaan yang dilindungi.

3.2. Kinetik Tindak Balas Humoral Selepas Pemvaksinan dengan F1 dan LcrV

Pemerhatian bahawa gabungan vaksin LcrV dan F1 menyebabkan imuniti perlindungan yang cepat menunjukkan bahawa tindak balas humoral telah ditimbulkan tidak lama selepas itu. Untuk menangani kemungkinan ini dan untuk menentukan sumbangan tindak balas humoral terhadap setiap antigen kepada perlindungan terhadap Y. pestis, kinetik antibodi IgG khusus yang dihasilkan terhadap dua antigen individu telah dianalisis 5-9 hari selepas vaksinasi dos tunggal. daripada tikus C57BL/6 dengan rumusan campuran poliF1 dan LcrV (Rajah 2A). Seperti yang dijangkakan, berdasarkan pemerhatian sebelum ini, titer antibodi IgG anti-F1 (GMT=1.35 × 103 ) sudah dapat dikesan dalam sera semua haiwan yang divaksinasi pada Hari 5 selepas vaksinasi (Rajah 2B).

Peningkatan beransur-ansur dalam titer antibodi IgG anti-F1 diperhatikan pada hari-hari berikutnya, mencapai ~60-kali ganda tahap yang lebih tinggi pada Hari ke-9 selepas vaksinasi (GMT=8.26 × 104, Rajah 2B). Antibodi IgG anti-F1 juga boleh dikesan dalam cecair paru-paru bermula dari Hari 7 selepas vaksinasi, mencapai kepekatan setinggi ~1 µg/mL pada Hari 9 (Rajah 2C). Menariknya, sementara tindak balas humoral anti-LcrV ketinggalan berbanding dengan yang ditimbulkan oleh polyF1 (Hari 7 GMT=613, Rajah 2D), peningkatan yang lebih tinggi dalam tahap antibodi IgG anti-LcrV diukur pada hari-hari berikutnya, menunjukkan peningkatan keseluruhan sebanyak ~160-kali ganda (GMT=1 × 105, Rajah 2D). Antibodi IgG anti-LcrV juga boleh dikesan dalam cecair paru-paru tikus yang divaksin bermula dari Hari ke-8, walaupun pada kepekatan yang lebih rendah berbanding dengan paras anti-F1 (Rajah 2E).

Peningkatan mendadak dalam titer IgG anti-LcrV, yang diperhatikan pada Hari 8-9 selepas vaksinasi, nampaknya tidak melibatkan pengaktifan sel B1b seperti semula jadi, seperti yang dicadangkan oleh pemerhatian bahawa pecahan IgG3 antibodi ini berada di bawah pengesanan berbanding dengan pecahan antibodi anti-F1 IgG3 ([12] dan Rajah Tambahan S2). Oleh itu, data menunjukkan bahawa LcrV juga boleh menjana tindak balas humoral yang cepat memberikan, dalam kombinasi dengan F1, perlindungan berkesan terhadap wabak pneumonik seawal seminggu selepas vaksinasi. Tambahan pula, pemerhatian bahawa antibodi IgG anti-F1 dan anti-LcrV terkumpul di dalam paru-paru haiwan yang divaksin menunjukkan bahawa tindak balas tempatan dalam paru-paru mungkin penting untuk mencapai imuniti wabak anti-pneumonik.

3.3. Kepentingan Struktur Polimer F1 untuk Permulaan Pantas Imuniti Pelindung

Kami sebelum ini telah menerbitkan penemuan dengan kuat menyokong tanggapan bahawa seni bina polimer kuaterner F1 adalah penting untuk keupayaannya untuk mendorong tindak balas perlindungan yang cepat terhadap wabak bubonik [12]. Oleh yang demikian, dalam kajian ini, isu ini turut dibincangkan dalam kes perlindungan terhadap wabak pneumonik. Tikus telah divaksinasi dengan monomerik atau polimer F1, dalam kedua-dua kes melibatkan pentadbiran bersama LcrV (80 µg setiap antigen/tikus). Tiga, empat, dan lima hari kemudian, tikus dicabar secara intranasal dengan dos mematikan Y. pestis Kim53. Data survival yang digambarkan dalam Rajah 3 menunjukkan bahawa vaksinasi dengan campuran polyF1 dan LcrV melindungi 25 peratus , 62.5 peratus dan 87.5 peratus tikus, masing-masing (Rajah 3A), daripada cabaran maut.

Sebaliknya, semua tikus yang divaksinasi dengan campuran monoF1 dan LcrV tunduk kepada jangkitan kecuali kumpulan yang divaksinasi 5 hari sebelum cabaran, yang menunjukkan tahap perlindungan 25 peratus yang rendah (Rajah 3B). Vaksinasi dengan formulasi bukan campuran yang terdiri daripada sama ada polyF1, monoF1 atau LcrV (80 µg/tikus) 4 hari sebelum cabaran tidak melindungi haiwan. Walau bagaimanapun, vaksinasi dengan polyF1 menyebabkan kelewatan yang ketara dalam kematian berbanding semua kumpulan eksperimen lain (p <0.001; Rajah 3C). Diambil bersama, keputusan ini jelas menunjukkan bahawa bentuk polimer F1 adalah penting untuk mendapatkan tindak balas perlindungan yang cepat dalam kombinasi dengan LcrV.

3.4. Pencirian Imuniti Perlindungan Jangka Panjang yang Dicetuskan oleh Pemvaksinan Tunggal dengan F1 dan LcrV

Akhirnya, kami mengkaji sama ada imuniti perlindungan jangka panjang klasik terhadap wabak pneumonik berbeza pada tikus yang divaksinasi oleh monoF1 atau polyF1. Sehubungan itu, tikus CD1 telah divaksin sekali dengan monoF1 atau polyF1 sahaja, serta dengan pemberian formulasi yang termasuk gabungan dengan LcrV. Tahap antibodi spesifik dalam serum haiwan yang divaksin diukur enam bulan kemudian. Data yang digambarkan dalam Rajah 4A menunjukkan bahawa titer IgG anti-F1 adalah lebih tinggi dalam semua kumpulan yang divaksinasi dengan poliF1 daripada yang divaksinasi dengan monoF1. Titer IgG anti-LcrV yang tinggi dan konsisten diukur dalam semua tikus yang divaksinasi dengan LcrV.

Tempoh 6 bulan postimmunization (3 hari selepas pengeluaran darah untuk penentuan titer), tikus dicabar secara intranasal dengan dos maut yang terdiri daripada 100LD50 Y. pestis Kim53, dan kemandirian dipantau selama 21 hari (Rajah 5). Tikus yang divaksinasi dengan polyF1 sebagai antigen tunggal hanya dilindungi sebahagiannya, manakala semua tikus yang divaksinasi dengan monoF1 meninggal dunia kepada jangkitan, sama seperti tikus kawalan naif (Rajah 5A). Terutamanya, titer IgG anti-F1 yang diukur dalam sera haiwan yang divaksin1-poliF tidak menunjukkan perkaitan yang kuat dengan kemandirian terhadap cabaran paru-paru (Rajah 5B). Penambahan LcrV membolehkan perlindungan penuh untuk tikus yang telah divaksinasi dengan monoF1 serta bagi mereka yang telah divaksinasi dengan polyF1 (Rajah 5A), menunjukkan bahawa tindak balas antiLcrV membolehkan manifestasi penuh nilai perlindungan tindak balas anti-F1. Keputusan yang sama berkenaan tindak balas humoral dan kelangsungan hidup selepas cabaran paru-paru diperolehi pada tikus CD{19}} jantan yang divaksin (Tambahan Rajah S3), menunjukkan bahawa kajian itu tidak berat sebelah oleh jantina haiwan (perhatikan bahawa eksperimen awal dilakukan dengan haiwan betina) .

Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa F1 dengan sendirinya boleh mendorong permulaan pantas perlindungan terhadap wabak pneumonik, yang bergantung kepada struktur polimer semulajadinya. Penambahan LcrV kepada polyF1 bukan sahaja memendekkan masa yang diperlukan untuk mencapai perlindungan pantas itu tetapi juga memberikan imuniti perlindungan yang berpanjangan dan berkesan terhadap manifestasi pulmonari wabak, seperti yang diterangkan sebelum ini.

4. Perbincangan

Pengasingan baru-baru ini bagi strain Y. pestis virulen yang tahan terhadap beberapa antibiotik termasuk yang disyorkan untuk terapi [8,25,26], dikaitkan dengan pencarian langkah balas tambahan terhadap wabak pneumonik, seperti vaksin yang mendorong imuniti yang cepat, tinggi. kesihatan awam, dan kaitan klinikal. Vaksin, secara amnya, dianggap sebagai langkah pencegahan terhadap penyakit berjangkit dan dengan itu dihantar kepada orang yang sihat bertahun-tahun lebih awal. Sehubungan itu, majoriti kajian praklinikal yang mengkaji pembangunan vaksin terhadap wabak melibatkan rejim vaksinasi yang berpanjangan sebelum cabaran maut [13,27-29]. Kami sebelum ini telah melaporkan bahawa vaksinasi dengan bentuk polimer semula jadi antigen F1 kapsul mencetuskan tindak balas imun bergantung kepada sel B yang sangat cepat dan kuat yang melindungi haiwan walaupun beberapa jam selepas cabaran Y. pestis subkutaneus yang mematikan [11,12].

Dalam kajian ini, kami telah menunjukkan bahawa vaksinasi tunggal dengan F1 mendorong pengumpulan antibodi anti-F1 (IgM dan IgG) dalam serum dalam masa beberapa hari melalui pengaktifan sel B1b seperti semula jadi. Subpopulasi sel B ini berada dalam rongga peritoneal tikus dan biasanya menghasilkan tindak balas serologi terhadap antigen polimer bukan protein, seperti LPS dan polisakarida yang membentuk kapsul banyak patogen (pneumokokus, meningokokus, dll.) [30]. Tindak balas imun yang cepat ini dicirikan oleh kebebasan sel T dan penjanaan serotype antibodi murine IgG3. Kami menunjukkan bahawa semua ciri yang disebutkan di atas juga digunakan pada tindak balas perlindungan pantas yang dihasilkan oleh F1. Tambahan pula, kami menunjukkan bahawa sifat polimer F1 adalah penting untuk tindak balas imun yang cepat ini, kerana F1 monomerik (dijana oleh pilih atur bulat gen caf1) gagal untuk mengaktifkan sel B1b, ketinggalan selepas F1 polimer dalam kinetik titer IgG, melakukan tidak menjana serotype IgG3, dan gagal memberikan permulaan perlindungan yang cepat. Tindak balas pantas ini disertai dengan tindak balas penyesuaian bergantung kepada sel T yang lebih perlahan terhadap F1. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa polimer F1 menjana dua tindak balas serologi yang bertindak selari: satu yang bebas sel T melalui sel B1b dan yang kedua melibatkan sel B folikel dalam cara yang bergantung kepada sel T [12].

Dalam laporan ini, kajian terdahulu telah dilanjutkan dengan menangani keupayaan antigen F1 untuk memberikan tindak balas perlindungan yang pantas dalam model tetikus wabak pneumonik yang lebih mencabar. Kami menunjukkan bahawa satu pentadbiran polimer F1 yang diserap AlOH, tujuh hari sebelum cabaran intranasal yang membawa maut dengan ketegangan Y. pestis yang virulen, boleh mendorong tindak balas perlindungan yang berkesan (Rajah 1). Pemerhatian yang mengejutkan ini hampir tidak mempunyai preseden, bukan sahaja mengenai kelajuan tindak balas tetapi juga dari segi fakta bahawa keupayaan antigen F1 untuk memberikan perlindungan dalam model tetikus wabak pneumonik hanya jarang ditangani [31]. Pemerhatian yang dilaporkan di sini adalah selaras dengan yang didokumenkan oleh Derbise dan rakan-rakannya [32] mengenai pengesanan antibodi anti-F1 sejurus selepas vaksinasi. Di sini, kami menunjukkan bahawa penambahan LcrV kepada polyF1 bukan sahaja berfaedah dalam jangka panjang, seperti yang dilaporkan sebelum ini [33,34], tetapi juga mempercepatkan tindak balas imun perlindungan terhadap cabaran intranasal Y. pestis kepada beberapa hari sahaja (Rajah 2). dan 5).

Keupayaan untuk menjana perlindungan pantas terhadap wabak pneumonik melalui vaksinasi dengan F1 dan LcrV mengukuhkan penemuan serupa yang dilaporkan sebelum ini oleh Williamson dan rakan sekerja [13], di mana vaksinasi dengan F1 dan LcrV memberikan perlindungan pantas terhadap cabaran aerosol dengan Y. pestis. Peningkatan mendadak dalam titer IgG anti-LcrV yang diperhatikan pada Hari 8 dan 9 menunjukkan bahawa mekanisme imun yang sangat kuat telah diaktifkan oleh LcrV lebih awal selepas imunisasi. Kekurangan antibodi anti-LcrV IgG3 dalam serum, kinetiknya yang berbeza, dan tahap antibodi IgG anti-LcrV yang lebih rendah yang ditemui dalam cecair paru-paru sangat mencadangkan bahawa mekanisme imun diskret telah diaktifkan oleh antigen F1 dan LcrV, yang kedua-duanya paling banyak berkemungkinan menyumbang kepada peningkatan pantas tindak balas perlindungan (Rajah 3C).

Sama seperti pemerhatian kami sebelum ini dalam model tetikus wabak bubonic, keupayaan untuk mendorong tindak balas imun perlindungan yang cepat terhadap wabak pneumonik bergantung pada struktur polimer antigen F1 (Rajah 3). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa calon vaksin subunit anti-wabak lazim, yang terdiri daripada monomerik F1 dan LcrV sebagai protein gabungan [35,36], tidak dijangka memberikan permulaan imuniti yang cepat terhadap wabak pneumonik; namun, andaian ini perlu dikaji secara eksperimen. Tindak balas serologi yang dijana oleh LcrV, walaupun lebih perlahan daripada polyF1 (Rajah 2), masih membenarkan tindak balas penyesuaian perlindungan pantas yang menghalang kesan maut wabak pneumonik. Tindak balas serologi yang agak pantas ini mungkin berpunca daripada keupayaan antigen LcrV untuk membentuk dimer atau tetramer dalam larutan, seperti yang telah ditemui dalam kajian terdahulu [37,38] dan data kami yang tidak diterbitkan. Berdasarkan penemuan kami tentang kesan struktur multimer F1 dalam mempercepatkan penjanaan tindak balas imun humoral, kejuruteraan rekombinan protein LcrV yang membolehkan multimerisasi ke tahap yang lebih besar boleh mempercepatkan lagi tindak balas. Selaras dengan andaian ini, perlu diperhatikan laporan terbaru yang mendokumentasikan bahawa mikrokristal yang mengandungi F1 dan LcrV lebih melindungi daripada vaksin serupa yang terdiri daripada antigen ini dalam bentuk larut [39]. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa peningkatan ketumpatan antigen, yang sememangnya berlaku dalam polimer F1, boleh bertambah baik dan mungkin mempercepatkan tindak balas humoral pelindung.

Sebagai tambahan kepada keupayaannya untuk mendorong induksi imuniti yang cepat, dalam eksperimen yang menangani jangka hayat keadaan perlindungan, imunisasi tunggal dengan polimer F1 menghasilkan titer IgG yang lebih stabil dan seragam berbanding dengan monomer F1 (Rajah 4). Walau bagaimanapun, vaksinasi dengan polyF1 sahaja hanya memberikan perlindungan separa terhadap penyakit pneumonik. Nota, titer IgG anti-F1 spesifik yang diukur dalam tikus individu kurang berkorelasi dengan keupayaan mereka untuk bertahan dalam cabaran (Rajah 5B). Pemvaksinan tikus dengan gabungan setiap bentuk F1 bersama-sama dengan LcrV menjana tahap perlindungan yang lebih tinggi (Rajah 5). Penemuan ini selaras dengan kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa vaksinasi dengan vaksin sel terbunuh (KWC), yang mendorong anti-F1 IgG tetapi bukan titer IgG anti-LcrV, tidak berkesan dalam memberikan imuniti terhadap wabak pneumonik [13,40] .

Walaupun, dalam kajian panjang umur, polyF1 hanya memberikan imuniti lewat separa, protein ini menunjukkan keupayaan untuk melindungi sepenuhnya tikus sejurus selepas vaksinasi, mencadangkan penglibatan mekanisme imun jangka pendek tambahan yang menyumbang kepada pembersihan patogen dalam pesat. eksperimen imuniti. Kami baru-baru ini telah menunjukkan bahawa vaksinasi dengan strain Y. pestis EV76 yang dilemahkan mencetuskan mekanisme pertahanan pemakanan yang membatalkan mekanisme virulensi pengantara siderophore bagi patogen yang bersaing untuk ion besi yang terdapat dalam perumah, menyumbang kepada permulaan pesat imuniti anti-wabak [ 41]. Penjelasan tentang mekanisme jangka pendek yang menyokong yang bersinergi dengan tindak balas imun humoral anti-F1 boleh membantu dalam pembangunan vaksin yang lebih baik terhadap wabak pneumonik serta terhadap penyakit berjangkit maut yang lain.

Bahan Tambahan:

Maklumat sokongan berikut boleh dimuat turun di https: //https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, Rajah S1: Pencirian wabak pneumonic berikutan inokulasi intranasal Y. pestis Kim53. Rajah S2: Pencirian isotaip antibodi anti-F1 dan anti-LcrV dalam sera tikus yang divaksin. Rajah S3: Panjang umur tindak balas serologi dan kemandirian tikus jantan selepas vaksinasi tunggal dengan monomerik F1 dan polimer F1 sama ada bersendirian atau dengan LcrV.

Sumbangan Pengarang:

Pengkonsepan, EM, dan YL; Kurasi data, YL; Analisis formal, YL; Penyiasatan, MA, AT, DG, YV, AZ dan YL; Metodologi, YL; Sumber, TH dan AM; Penyeliaan, EM; Penulisan—Draf asal, EM dan YL; Penulisan—Semakan dan penyuntingan, TC, EM, dan YL Semua pengarang telah membaca dan bersetuju menerima versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:

Penyelidikan ini dibiayai oleh Institut Penyelidikan Biologi Israel, nombor geran SB/07.

Penyata Lembaga Semakan Institusi:

Tidak berkaitan.

Kenyataan Persetujuan Termaklum:

Tidak berkaitan.

Penyata Ketersediaan Data:

Data yang dibentangkan dalam kajian ini tersedia atas permintaan daripada pengarang yang berkaitan.

Konflik Kepentingan:

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Butler, T. Plague, dan Jangkitan Yersinia Lain; Greenough, W., Merigan, TC, Eds.; Syarikat Buku Perubatan Plenum: New York, NY, Amerika Syarikat, 1983.

2. Randremanana, R.; Andrianaivoarimanana, V.; Nikolay, B.; Ramasindrazana, B.; Paireau, J.; Sepuluh Bosch, QA; Rakotondramanga, JM; Rahajandraibe, S.; Rahelinirina, S.; Rakotomanana, F.; et al. Ciri-ciri epidemiologi wabak wabak bandar di Madagascar, Ogos-November, 2017: Laporan wabak. Jangkitan Lancet. Dis. 2019, 19, 537–545. [CrossRef]

3. Kugeler, KJ; Staples, JE; Hinckley, AF; Gage, KL; Mead, PS Epidemiologi wabak manusia di Amerika Syarikat, 1900–2012. Muncul. Jangkitan. Dis. 2015, 21, 16–22. [CrossRef]

4. Kugeler, KJ; Mead, PS; Campbell, SB; Nelson, CA Corak Rawatan Antimikrob dan Hasil Penyakit Di Kalangan Pesakit Amerika Syarikat Dengan Wabak, 1942–2018. Clin. Jangkitan. Dis. 2020, 70, S20–S26. [CrossRef]

5. Godfred-Cato, S.; Cooley, KM; Fleck-Derderian, S.; Becksted, HA; Russell, Z.; Meaney-Delman, D.; Mead, PS; Nelson, CA Rawatan Wabak Manusia: Kajian Sistematik Data Agregat yang Diterbitkan tentang Keberkesanan Antimikrob, 1939–2019. Clin. Jangkitan. Dis. 2020, 70, S11–S19. [CrossRef]

6. Galimand, M.; Guiyoule, A.; Gerbaud, G.; Rasoamanana, B.; Chanteau, S.; Carniel, E.; Courvalin, P. Rintangan pelbagai ubat dalam Yersinia pestis yang dimediasi oleh plasmid yang boleh dipindahkan. N. Inggeris. J. Med. 1997, 337, 677–680. [CrossRef]

7. Welch, TJ; Fricke, WF; McDermott, PF; Putih, DG; Rosso, ML; Rasko, DA; Mammel, MK; Eppinger, M.; Rosovitz, MJ; Wagner, D.; et al. Rintangan antimikrob berbilang dalam wabak: Risiko kesihatan awam yang muncul. PLoS ONE 2007, 2, e309. [CrossRef]

8. Lei, C.; Kumar, S. Yersinia pestis rintangan antibiotik: Kajian sistematik. Osong Public Health Res. Perspek. 2022, 13, 24–36. [CrossRef]

9. Zauberman, A.; Gur, D.; Levy, Y.; Aftalion, M.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Chitlaru, T.; Mamroud, E. Pentadbiran Pasca Pendedahan Vaksin Hidup Yersinia pestis untuk Potensi Rawatan Antibiotik Barisan Kedua Terhadap Wabak Pneumonic. J. Jangkitan. Dis. 2019, 220, 1147–1151. [CrossRef]

10. Vagima, Y.; Gur, D.; Aftalion, M.; Musa, S.; Levy, Y.; Makovitzki, A.; Holtzman, T.; Oren, Z.; Segula, Y.; Fatelevich, E.; et al. Terapi Phage Menguatkan Rawatan Antibiotik Barisan Kedua terhadap Wabak Pneumonik. Virus 2022, 14, 688. [CrossRef]

11. Levy, Y.; Flashner, Y.; Tidhar, A.; Zauberman, A.; Aftalion, M.; Lazar, S.; Gur, D.; Shafferman, A.; Mahmoud, sel E. T memainkan peranan penting dalam perlindungan pantas pengantara anti-F1 terhadap wabak bubonik. Vaksin 2011, 29, 6866–6873. [CrossRef]

12. Levy, Y.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Aftalion, M.; Gur, D.; Nili, U.; Chitlaru, T.; Zauberman, A.; Mahmoud, E. Menyasarkan antigen kapsul Yersinia pestis F1 oleh sel B1b seperti semula jadi mengantara tindak balas perlindungan yang cepat terhadap wabak bubonik. Vaksin NPJ 2018, 3, 52. [CrossRef]

13. Williamson, ED; Stagg, AJ; Eley, SM; Taylor, R.; Hijau, M.; Jones, SM; Titball, RW Kinetik tindak balas imun terhadap vaksin (F1 tambah V) dalam model wabak bubonik dan pneumonik. Vaksin 2007, 25, 1142–1148. [CrossRef]

14. Holtzman, T.; Levy, Y.; Marcus, D.; Flashner, Y.; Mamroud, E.; Cohen, S.; Fass, R. Penghasilan dan penulenan oligomer berat molekul tinggi antigen kapsul Yersinia pestis F1 yang dikeluarkan oleh kultur ketumpatan sel tinggi sel Escherichia coli rekombinan yang membawa operon caf1. mikrob. Kilang Sel 2006, 5, P98. [CrossRef]

15. Chalton, DA; Musson, JA; Flick-Smith, H.; Walker, N.; McGregor, A.; Lamb, HK; Williamson, ED; Miller, J.; Robinson, JH; Lakey, JH Imunogenisiti antigen vaksin Yersinia pestis yang dimonomerkan oleh pilih atur bulat. Jangkitan. imun. 2006, 74, 6624–6631. [CrossRef]

16. Petsch, D.; Anspach, penyingkiran Endotoksin FB daripada larutan protein. J. Bioteknol. 2000, 76, 97–119. [CrossRef]

17. Leary, SE; Williamson, ED; Griffin, KF; Russell, P.; Eley, SM; Titball, RW Imunisasi aktif dengan antigen V rekombinan daripada Yersinia pestis melindungi tikus daripada wabak. Jangkitan. imun. 1995, 63, 2854–2858. [CrossRef]

18. Mechaly, A.; Vitner, EB; Levy, Y.; Gur, D.; Barlev-Gross, M.; Sittner, A.; Koren, M.; Levy, H.; Mahmoud, E.; Fisher, M. Epitope Binning Antibodi Monoklonal Anti F1 dan Anti LcrV Novel dan Penggunaannya dalam Ujian HTRF Ringkas, Pendek, untuk Pengesanan Wabak Klinikal. Patogen 2021, 10, 285. [CrossRef]

19. Tidhar, A.; Flashner, Y.; Cohen, S.; Levi, Y.; Zauberman, A.; Gur, D.; Aftalion, M.; Elhanany, E.; Zvi, A.; Shafferman, A.; et al. Lipoprotein NlpD adalah novel Yersinia pestis faktor virulensi yang penting untuk perkembangan wabak. PLoS ONE 2009, 4, e7023. [CrossRef]

20. Reed, LJ; Muench, H. Kaedah Mudah Menganggar Lima Puluh Peratus Titik Akhir12. Am. J. Epidemiol. 1938, 27, 493–497. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com