Kesan Perlindungan Jumlah glikosida Dari Cistanche Salsa Pada Kecederaan Hati Eksperimen

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

Wang Yanfang, Zhao Jijun, Hai Pengli, Xue Peifeng, Li Hui, Li Minhui

Abstrak

Dalam eksperimen ini, model kecederaan hati alkohol pada tikus telah ditubuhkan, dan penunjuk biokimia fungsi hati dan perubahan histopatologi hati digunakan sebagai penunjuk pemeriksaan. Menyiasatkesan perlindungan jumlah glikosida cistanche salsa pada kecederaan hati alkohol eksperimen. Berikan jumlahglycoside of cistanche salsados tinggi (130 mg/kg) dan dos sederhana oleh gavage (100 mg/kg), dos rendah (65 mg/kg), dan bidentate (150 mg/kg) sebagai ubat kawalan positif. Keputusan menunjukkan bahawa serum ALT dan AST meningkat dengan ketara; Aktiviti SOD di hati dikurangkan, dan kandungan MDA meningkat; lipidosis sel hati muncul. Jumlah glikosida kumpulan dos tinggi cistanche salsa berkesan dalam Meningkatkan indeks fungsi hati dan mengurangkan kemerosotan lipid sel hati. Atas dasar ini, penentuan awalechinacosideDanacteosidekandungan dalam jumlah glikosida cistanche salsa adalah 29.1%. Eksperimen di atas menunjukkan bahawa jumlah glikosida cistanche salsa mempunyai kesan perlindungan terhadap kecederaan hati alkohol pada tikus, dan juga disahkan bahawa echinacoside dan acteoside adalah bahan aktif utama dari jumlah glikosida cistanche salsa.

Kata kunci: jumlah glikosida cistanche salsa; kromatografi cecair berprestasi tinggi; acteoside; echinacoside; kecederaan hati alkohol

Citanche salsaadalah tumbuhan Cistanche keluarga Orobanchaceae (Orobanchaceae), juga dikenali sebagai salina, tumbuhan parasit herba saka, terutamanya diedarkan di padang pasir, padang pasir, dan kawasan kering lain. Kawasan pengeluar utama adalah di Xinjiang dan Mongolia Dalam. 1]. Oleh kerana Herba Cistanche dari keluarga yang sama dan genus yang sama telah digali dalam kuantiti yang banyak, dan tumbuhan parasit sukar untuk menghasilkan semula, sumber perubatan menurun dari hari ke hari, dan sukar untuk memenuhi permintaan pasaran. Di negara kita, cistanche salsa rakyat digunakan sebagai pengganti untuk cistanche deserticola, tetapi laporan penyelidikannya sedikit. Untuk menjelaskan lebih lanjut nilai perubatannya, jumlah glikosida cistanche salsa (jumlah glikosida Cistanche salsa), kelas bahan yang mengandungi phenylethanoid glikosida, telah dikaji secara farmakologi.Jumlah glikosida cistanche salsa mempunyai kesan perlindungan pada saraf[2] dan boleh melindungi DNA daripada kerosakan oksidatif yang disebabkan oleh hydroxyl (OH·) [3]. Cistanche salsa phenylethanoid glikosida boleh meningkatkan aktiviti dismutase superoksida (SOD) dengan ketara dalam jantung tetikus, hati, dan tisu otak [4]. Penyelidikan di atas menunjukkan bahawatotal glycoside of cistanche salsamempunyai kesan antioksidan.

Kejadian penyakit hati alkohol (ALD) semakin meningkat dari tahun ke tahun di negara saya. Alkohol telah menjadi penyebab utama kedua kerosakan hati selepas hepatitis virus [5]. Untuk rawatan kecederaan hati alkohol, terdapat kekurangan ubat yang selamat dan berkesan. Cara menggunakan sumber tumbuhan untuk membangunkan ubat-ubatan anti-alkohol dan melindungi hati dan produk kesihatan telah menarik perhatian yang luas dalam industri farmaseutikal dan makanan. Selepas kesusasteraan yang luas, didapati bahawa kecederaan hati alkohol berkaitan dengan tekanan oksidatif, danjumlah glikosida cistanche salsa mempunyai kesan ke atas injur hati alkoholy. Penyelidikan mengenai kesan perlindungan masih kosong. Penyelidikan dalam eksperimen ini menyediakan asas saintifik untuk pembangunan dan penggunaan jumlah glikosida cistanche salsa.

1 Bahan dan peralatan

1. 1 Ubat dan reagen

Cistanche salsadisediakan oleh Makmal Utama Pengenalpastian dan Penyeragaman Bahan Perubatan Mongolia, Kolej Perubatan Baotou; Bifendate menjatuhkan pil (Zhejiang Wanbang Pharmaceutical Co., Ltd., nombor batch A02121139); Alanine Aminotransferase (ALT) Kit, Kit aminotransferase Asid Aspartame (AST), kit ujian malondialdehid (MDA), kit superoksida dismutase (SOD), Kit penentuan protein biru coomassie cemerlang (Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering, nombor batch 20110422); 56 ° Minuman keras (Beijing Red Star Co., Ltd.); reagen lain adalah tulen di dalam negeri.

1. 2 Haiwan

72 tikus jantan spesies Kunming, seberat 17-22 g (Pusat Haiwan Makmal Universiti Mongolia Dalam, Sijil Kelayakan Haiwan No.: 6 (Mongolia 2002-0001)).

1. 3 Instrumen

Spektrofikometer yang kelihatan ultraviolet [Unico (Shanghai) Instrument Co., Ltd., model UV-2000]; Pembaca mikroplate (Beckman Coulter, Amerika Syarikat, model AD340); sentrifuge berkelajuan tinggi (Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co., Ltd., model TG18-WS); Kromatograf Cecair Berprestasi Tinggi (Thermo Fisher Scientific, Model Ultimate 3000); Imbangan Analisis (METTLER TOLEDO Instruments Co., Ltd. Model AR153O); Pengayun Ultrasonik (Shanghai Branson, Model SB3200); Freeze desiccant (Beijing Boyikang Experimental Instrument Co., Ltd., model FD-1-50).

2 Kaedah dan keputusan

2. 1 Kajian mengenai jumlah glikosida aktiviti cistanche salsa

2. 1. 1 Jumlah glikosida pengekstrakan cistanche salsa

2. 1. 1. 1 Pengekstrakan ekstrak mentah

Berat 100 g serbuk kasar cistanche salsa kasar, tambah 600 mL 70% etanol dan rendam selama 3 h, ekstrak ultrasonically selama 30 minit, penapis, dan ulangi langkah-langkah di atas dua kali pada residu penapis, gabungkan filtrate dan pekat untuk memulihkan etanol sehingga ia tidak mempunyai rasa alkohol, mengumpul ekstrak dan beku-kering untuk mendapatkan cistanche salsa ekstrak mentah 19.46 g.

2. 1. 1. 2 Proses pembersihan

Letakkan 10 g ekstrak mentah cistanche salsa dalam bikar, tambah 20 mL air untuk larut dalam ultrasound, tambah 80 mL etanol mutlak, goncang dengan baik dan letakkan selama 12 jam dan kemudian lakukan penapisan, filtrate tertumpu untuk memulihkan etanol sehingga tiada rasa alkohol, dan beku-kering untuk mendapatkan 8.408 g daripada jumlah glikosida ekstrak cistanche salsa.

2. 1. 2 Pengumpulan dan pentadbiran haiwan

72 tikus diberi makan secara adaptif selama 2 hari sebelum percubaan dan secara rawak dibahagikan kepada 6 kumpulan, masing-masing dengan 12 tikus, iaitu kumpulan kawalan kosong, kumpulan model kecederaan hati alkohol, dan kumpulan kawalan positif (150 mg / kg bidentate), Jumlah glikosida cistanche salsa kumpulan dos tinggi (130 mg / kg), jumlah glikosida cistanche salsa kumpulan dos sederhana (100 mg / kg) dan jumlah glikosida cistanche salsa kumpulan dos rendah (65 mg / kg). Haiwan dalam setiap kumpulan diberi pentadbiran intragastrik (ig) dua kali sehari, dan jumlah ig adalah 0.2 mL / 20 g berat badan. Kumpulan kawalan kosong dan kumpulan model diberi jumlah garam yang sama. Dua jam selepas setiap pentadbiran, kecuali kumpulan kawalan kosong, kumpulan lain diberi minuman keras 56 ° pada 0.4 mL / 20 g berat badan ig selama 10 hari berturut-turut untuk menyebabkan model kecederaan hati alkohol akut. Pada hari ke-9 bangunan model, puasa tidak dibenarkan. Pada hari ke-10, wain putih 56 ° diberikan selama 3 jam. Bola mata diambil darah dan serum dipisahkan. Selepas pengumpulan darah, tikus telah dikorbankan. Timbang, ambil lobus hati yang betul dan letakkan dalam larutan fiksatif formaldehid 10%, dan letakkan seluruh hati di dalam peti sejuk pada -20 °C.

2. 1. 3 Pemprosesan statistik

Gunakan perisian statistik SPSS 11.5 untuk memproses data, analisis varians, P<0.05 is="" statistically="">

2. 1. 4 Kesan jumlah glikosida cistanche salsa pada berat badan, berat hati, dan indeks hati kecederaan hati alkohol akut pada tikus

Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1, berat hati dan indeks hati tikus dalam kumpulan model jauh lebih tinggi daripada yang berada dalam kumpulan kawalan kosong (P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1. 5 Kesan jumlah glikosida cistanche salsa pada serum AST dan ALT

Darah yang dikumpul disempitkan pada 3.5×103 r / min selama 10 minit untuk menyediakan serum. Menggunakan kaedah Lai, bacaan UV-Vis spectrophotometer 505 nm digunakan untuk menentukan aktiviti ALT dan AST dalam serum. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2, serum ALT dan AST dalam kumpulan model jauh lebih tinggi daripada yang berada dalam kumpulan kawalan kosong (P<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 6 Kesan jumlah glikosida cistanche salsa pada kandungan MDA dan aktiviti SOD di hati

Ambil 0.3 g tisu hati untuk menyediakan 10% dan 1% homogenat. Centrifuge 1% homogenat hati dengan 3.5 × 103 r / min selama 10 minit dan ambil supernatant. Penyelesaiannya, protein dalam homogenat hati ditentukan oleh kaedah Coomassie Brilliant Blue. Ambil 1% hati homogenate supernatant, beroperasi mengikut kotak ujian SOD, dan baca pada 450 nm pada pembaca mikroplate. Ambil 10% supernatant homogenatan homogen hati, beroperasi mengikut kit penentuan MDA, dan ukur penyerap (A532) dengan spektrofotoometer pada 532 nm.

Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 3, kandungan MDA dalam hati kumpulan model jauh lebih tinggi daripada itu dalam kumpulan kawalan kosong (P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 7 Kesan jumlah glikosida cistanche salsa pada perubahan patologi tisu hati pada tikus

Pemeriksaan patologi: tisu hati tetap dengan 10% formaldehid, seksyen parafin konvensional (ketebalan kepingan 5 μm), pewarnaan HE, dan pemerhatian perubahan histopatologi hati di bawah mikroskop cahaya.

Hati kumpulan kawalan kosong berwarna merah gelap dan tekstur lembut. Struktur tisu hati adalah normal dan struktur lobules hati adalah utuh. Ia adalah poligonal dengan sempadan yang jelas, dan nukleus adalah bulat dan jelas terletak di tengah-tengah sel. Jumlah hati tikus dalam kumpulan model dan jumlah glikosida cistanche salsa sederhana dan kumpulan dos rendah meningkat dan warna menjadi kuning. Perubahan patologi di bawah mikroskop adalah terutamanya degenerasi lemak hepatosit, dengan vacuoles lipid yang tersebar dan hepatosit dalam sel-sel. Besar, cytoplasm dipenuhi dengan titisan lipid kecil dan vacuoles, dan nukleus masih di tengah. Dalam kumpulan kawalan positif dan jumlah glikosida kumpulan dos tinggi cistanche salsa, lipidosis sel hati pada tikus dikurangkan ke tahap tertentu, dan bilangan titisan lipid dikurangkan ke tahap tertentu.

2. 2 Analisis komponen utama jumlah glikoside cistanche salsa

2. 2. 1 Keadaan Kromatografi

Keadaan kromatografi adalah lajur kromatografi ZORBAX ODS (250×4.6 mm, 5μm); fasa mudah alih: metanol 0.2% larutan asid formik (27.5∶72.5), elution kecerunan; suhu lajur 30°C; kadar aliran 1 mL / min; pengesanan panjang gelombang 334 nm. Di bawah keadaan kromatografi di atas, pemisahanechinacosideDanacteosideadalah baik.

2. 2. 2 Penyediaan penyelesaian rujukan

Tepat berat 1.3 mg dan 1.2 mg daripadaechinacosideDanacteosidebahan rujukan untuk menyediakan penyelesaian bahan rujukan echinacoside 0.13 mg / mL dan penyelesaian rujukan acteoside 0.12 mg / mL.

2. 2. 3 Penyediaan penyelesaian ujian

Tepat berat 0.1082 g daripada jumlah glikosida ekstrak salsa cistanche dan cairkan hingga 50 mL dengan penyelesaian fasa mudah alih.

2. 2. 4 Hubungan linear

Tepat menarik penyelesaian rujukan 0. 06, 0. 12. 0. 18. 0. 24. 0. 30, 0. 48. 0. 54. 0. 72. 1. Pada 20 mg / mL, suntik 5 μL ke dalam kromatografi cecair dalam urutan, dan hitung persamaan regresi dengan jumlah suntikan (μg) kedua-dua bahan rujukan sebagai abscissa dan kawasan puncak yang sepadan sebagai koordinat. echinacoside: Y = 11.868 X-0.0785, R = 0.9997; acteoside: Y = 18.026X-0.1913, R = 0.9997. Akibatnya, bahan rujukan echinacoside mempunyai hubungan linear yang baik dalam julat 0.0635 hingga 0.4445 μg; bahan rujukan acteoside adalah dalam julat 0.059 hingga 1.18 μg Hubungan linear dalaman adalah baik.

2. 2. 5 Ujian ketepatan

Tepat menarik 10 μL penyelesaian ujian yang sama, dan ulangi suntikan 5 kali di bawah keadaan kromatografi di atas. Rakam kromatogram dan tentukan kawasan puncak. Hasilnya ialah RSD echinacoside 0.89%,RSD daripadaacteoside adalah 1.87%, menunjukkan bahawa ketepatan instrumen adalah baik.

2. 2. 6 Ujian kestabilan

Penyelesaian ujian yang sama, masing-masing, pada 0, 2, 4, 8, 16, 32, 40, 48 h, dengan tepat menarik 10 L, menyuntiknya ke dalam kromatograf cecair, rekod kromatogram, dan mengukur kawasan puncaknya. Hasilnya ialah RSD echinacoside 1. 58%, RSDacteosideialah 0. 49%, menunjukkan bahawa penyelesaian ujian adalah dalam masa 48 jam

Kestabilan adalah baik.

2. 2. 7 Ujian kebolehulangan

Tepat berat kira-kira 0.2 mg daripada kumpulan sampel yang sama, 5 bahagian secara keseluruhan, dan menyediakan 5 bahagian penyelesaian. Mengikut kaedah penentuan kandungan, tepat paip 10 μL ke dalam kromatograf cecair, rekod kromatogram, dan tentukan kawasan puncak. Hasilnya adalah echinacoside RSD 1.91% dan RSD Verbascum glikosida adalah 2.08%, menunjukkan bahawa kaedah penentuan mempunyai kebolehulangan yang baik.

2. 2. 8 Ujian kadar pemulihan

Tepat berat 0.2 g atotal glycoside of cistanche salsa, tambah jumlah tertentuechinacoside dan acteosidebahan rujukan masing-masing, menyediakan penyelesaian ujian mengikut kaedah di bawah 2.2.3 di atas, dan melaksanakan penentuan mengikut kaedah penentuan kandungan di bawah keadaan kromatografi yang ditentukan. Hasilnya Kadar pemulihan purata echinacoside adalah 98. 49%, RSD 1. 06%, kadar pemulihan purata acteoside ialah 97.35%, dan RSD ialah 1.45%.

2. 2. 9 Penentuan sampel

Tepat menarik 10 μL setiap penyelesaian rujukan dan penyelesaian ujian, menyuntik sampel, menentukan keadaan kromatografi di atas, dan hitung kandungan sampel dengan kaedah standard luaran. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 4 Kandungan purata echinacoside ialah 24.5%, dan kandungan purataacteosideialah 4.6%.

3 Perbincangan

Kerosakan hati alkohol merujuk kepada kerosakan hati dan satu siri perubahan patologi yang disebabkan oleh minum berat jangka panjang. Pengambilan alkohol berlebihan jangka panjang boleh menyebabkan kerosakan sel hati, dan kemudian mengalami fibrosis hati, dan juga sirosis hati [6]. Berbanding dengan kumpulan model, jumlah glikosida kumpulan dos tinggi cistanche salsa dalam eksperimen ini dengan ketara mengurangkan aktiviti ALT dan AST dalam serum tetikus, dengan ketara mengurangkan kandungan MDA di hati, dan dengan ketara meningkatkan aktiviti SOD, yang mengurangkan lipidosis sel hati ke tahap tertentu. , Kurangkan bilangan titisan lipid. Tiada perbezaan yang ketara antara kumpulan dos pertengahan dan rendah dan kumpulan model. Hasil percubaan ini adalah konsisten dengan hasil penyelidikan pkesan rotective jumlah glikosida Cistanche pada kecederaan hati alkohol pada tikus[7].

Jumlah glikosida cistanche salsa melindungi kerosakan sel hatidengan mengurangkan kebolehtelapan membran sel dan meningkatkan kandungan ALT dan AST yang dilepaskan ke dalam darah; ia boleh meningkatkan aktiviti SOD dan menghapuskan sebilangan besar radikal bebas yang dihasilkan oleh alkohol dalam metabolisme badan. ; Ia boleh mengurangkan pembentukan MDA dan menghalangnya daripada merosakkan struktur membran sel tisu [8-10]. Jumlah glikosida cistanche salsa mempunyai kesan perlindungan terhadap kecederaan hati alkohol, dan terdapat hubungan kesan kuantitatif. Memeriksa kesusasteraan, tidak ada analisis kuantitatif bahan-bahan aktif jumlah glikosida cistanche salsa. Dalam kertas ini, kandunganacteosideDanechinacoside, komponen utama jumlah glikosida cistanche salsa, dianalisis secara kuantitatif buat kali pertama oleh HPLC, yang menyumbang 29.1% daripada jumlah glikosida. Menyediakan asas saintifik untuk pembangunan dan penggunaan jumlah glikosida cistanche salsa. Kajian farmakologi moden mendapati bahawa echinacoside mempunyai kesan perlindungan pada sel PC12 yang rosak oleh hidrogen peroksida dan kerosakan tekanan oksidatif pada tikus demensia vaskular [11,12]. Kedua-duanyaechinacoside dan acteoside mempunyai kesan perencatan pada sitotoksisik hepatosityang disebabkan oleh D GalN dan TNF-α [13]. Tambahan pula, ia adalah spekulasi bahawajumlah glikosida cistanche salsa melindungi tikus daripada kecederaan hati alkoholboleh dipertingkatkan olehechinacoside dan acteosideuntuk meningkatkan aktiviti enzim antioksidan selular, meningkatkan kapasiti antioksidan sel hati, dengan itu mengekalkan integriti membran plasma sel hati, supaya sel-sel hati boleh berfungsi secara normal Fungsi pertahanan dan pampasan. Kami akan mengasingkan sebatian dalam kajian masa depan dan menggunakan teknik biologi molekul untuk mengkaji peraturan sebatian monomerik pada apoptosis sel hati dan hubungan mereka dengan peraturan gen sasaran yang berkaitan.

Rujukan

1 Zhang HW. Kajian mengenai konstituen kimia dan

cap jari Cistanche salsa (C. A. Mey.) G. Beck. Ho hot: Kolej Perubatan Mongolia Dalam, MSc. 2008.

2 Tian XF, Pu XP. Phenylethanoid glikosida dari Cistanches salsa menghalang apoptosis yang disebabkan oleh metil phenyl pyridinium ion dalam neuron. J Ethnopharmacol, 2005, 97: 59-63.

3 Wang XW, Jiang XY, Wu LY. Kesan scavenging dari glikosida Cistanche pada radikal bebas dan perlindungannya terhadap kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH · di vitro China Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 Wu HH. Penyediaan dan aktiviti antioksidan phenylethanoid glikosida dari Cistanche salsa. Nanjing: Universiti Pertanian Nanjing, MSc. 2008.