Pembelajaran Sebelum Maklumat Nonaversive Relevan Adalah Keadaan Sempadan Untuk Mengelak Penyatuan Semula Memori dalam Hippocampus Tikus

Untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Kenangan yang diaktifkan semula boleh diubah suai semasa penyatuan semula, menjadikan proses ini sebagai sasaran terapeutik yang berpotensi untuk gangguan tekanan selepas trauma (PTSD), penyakit mental yang dicirikan oleh pengelakan berulang situasi yang menimbulkan ketakutan berkaitan trauma. Namun, mengelakingatanpenyatuan semula bergantung pada satu set syarat sempadan yang masih ditakrifkan secara longgar, mengehadkan nilai translasi penyelidikan asas. Khususnya, penglibatan hippocampus dalam pengelakan bermotivasi ketakutaningatanpenyatuan semula masih menjadi kontroversi. Menggabungkan analisis tingkah laku dan elektrofisiologi dalam tikus Wistar jantan, kami mendapati bahawa pembelajaran sebelumnya mengenai maklumat nonaversif yang relevan adalah penting untuk mendapatkan penyertaan hippocampus dalam mengelakkaningatanpenyatuan semula, yang dikaitkan dengan peningkatan kuasa ayunan theta dan gamma dan gandingan frekuensi silang dalam CA1 dorsal semasa pengaktifan semula tindak balas pengelakan. Keputusan kami menunjukkan bahawa hippocampus terlibat dalamingatanpenyatuan semula hanya apabila pengaktifan semula menghasilkan perwakilan yang bercanggah mengenai akibat pengelakan dan mencadangkan bahawa sarang teguh irama theta-gamma hippocampal pada masa pengambilan adalah penanda penyatuan semula yang khusus.

Kata kunci: mengelak; ketakutan; ayunan gamma; hippocampus; penyatuan semula; theta-ayunan

XAndressa Radiske,* Maria Carolina Gonzalez,* Sergio A. Conde-Ocazionez, XAnatildes Feitosa, Cristiano A. Ko¨hler, Lia R. Bevilaqua, dan XMartín Cammarota

Makmal Penyelidikan Memori, Institut Otak, Universiti Persekutuan Rio Grande do Norte, RN 59056-450 Natal, Brazil

Kenyataan Kepentingan

Gangguan tekanan selepas trauma (PTSD) dicirikan oleh tindak balas pengelakan maladaptif terhadap rangsangan atau tingkah laku yang mewakili persamaan dengan beberapa aspek pengalaman atraumatik. Gangguan penyatuan semula, proses di mana ingatan yang diaktifkan semula menjadi terdedah kepada pengubahsuaian, adalah pendekatan yang menjanjikan untuk merawat pesakit PTSD. Walau bagaimanapun, kebanyakan perkara yang diketahui tentang pengelakan bermotivasi ketakutaningatanpenyatuan semula diperoleh daripada kajian berdasarkan pelaziman ketakutan dan bukannya paradigma pembelajaran mengelak. Menggunakan tugas mengelak perencatan langkah ke bawah dalam tikus, kami mendapati bahawa hippocampus terlibat dalamingatanpenyatuan semula hanya apabila haiwan memperoleh tindak balas pengelakan dalam persekitaran yang mereka pelajari sebelum ini sebagai selamat dan menunjukkan bahawa gandingan theta dan gamma-ayunan yang meningkat semasa pengaktifan semula adalah tandatangan elektrofisiologi proses ini.

pengenalan

Mengelak ialah tingkah laku pertahanan biasa yang bertujuan untuk mengelakkan situasi yang tidak selesa atau menakutkan. Walau bagaimanapun, pada pesakit dengan gangguan tekanan selepas trauma (PTSD), mengelakkan emosi, pemikiran, dan rangsangan yang melambangkan atau menyerupai peristiwa traumatik menjadi lebih teruk dan tidak seimbang. Pengaktifan semula boleh menyebabkan ingatan menjadi labil sementara dan, untuk berterusan, ingatan ini mesti menjalani proses penstabilan yang bergantung kepada ekspresi gen dan protein yang dirujuk sebagai penyatuan semula, di mana ia juga boleh dikemas kini atau dipertingkatkan (Misanin et al., 1968; Spear, 1973; Lewis, 1979; Przybyslawski dan Sara, 1997; Nader et al., 2000, Haubrich dan Nader, 2016). Oleh itu, telah dicadangkan bahawa campur tangan terapeutik berdasarkan gangguan penyatuan semula ingatan penghindaran yang didorong oleh ketakutan mungkin membantu pesakit PTSD menyusun semula ingatan yang mengganggu dan mengatasi kebimbangan (Schwabe et al., 2014; Dunbar dan Taylor, 2017). Namun begitu, mungkin kerana ketakutan terkondisi telah lama dikaitkan dengan pengukuhan tindak balas pengelakan yang didorong oleh ketakutan (Mowrer dan Lamoreaux, 1946; Miller, 1948), kebanyakan kajian tentang perkaitan penyatuan semula untuk rawatan gangguan berkaitan tekanan telah dilakukan menggunakan paradigma pembelajaran pengkondisian ketakutan (Johansen et al., 2011; Reichelt dan Lee, 2013). Walau bagaimanapun, terdapat perbezaan neuroanatomi dan neurokimia yang penting antara pengkondisian ketakutan dan pemprosesan ingatan penghindaran yang bermotivasi ketakutan (Wilensky et al., 2000; Tinsley et al., 2004; Alberini, 2005) dan beberapa laporan telah mengasingkan dengan jelas pengelakan yang disebabkan oleh ketakutan daripada ekspresi ketakutan terkondisi (Riccio dan Silvestri, 1973; Overmier dan Brackbill, 1977; Mineka, 1979). Malah, terdapat kekurangan maklumat tentang keadaan tingkah laku yang mengekang penyatuan semula pengelakan akibat ketakutan dan sifat fisiologi yang membezakan proses ini daripada fenomena lain yang bergantung pada pengaktifan semula ingatan.

Klik untuk Cistanche tubulosa dos untuk ingatan

Khususnya, peranan hippocampus, yang didokumentasikan dengan baik dalam penyatuan semula ingatan pengkondisian ketakutan (de Oliveira Alvares et al., 2008; Besnard et al., 2013; Ishikawa et al., 2016), masih sukar difahami untuk kes pengelakan. dan beberapa penyiasatan, termasuk kami sendiri, telah gagal untuk mencari bukti bahawa sintesis protein de novo hippocampal diperlukan untuk penstabilan semula ingatan pengelakan yang disebabkan oleh ketakutan selepas pengaktifan semula (Taubenfeld et al., 2001; Cammarota et al., 2004; Power et al. , 2006; Arguello et al., 2013). Satu penjelasan yang mungkin untuk keputusan negatif ini ialah ingatan pengelakan tidak pernah mengalami penyatuan semula, yang sangat tidak mungkin kerana telah dilaporkan bahawa pentadbiran sistemik penyekat sintesis protein selepas pengambilan semula ingatan pengelakan yang disebabkan oleh ketakutan menyebabkan amnesia (Taubenfeld et al., 2001). Kemungkinan lain ialah pengaktifan semula mendorong penyatuan semula ingatan mengelak tetapi hippocampus tidak memainkan apa-apa peranan dalam proses ini, yang juga kelihatan tidak masuk akal kerana hippocampus adalah penting, bukan sahaja untuk penyatuan, pengambilan semula dan kepupusan tindak balas pengelakan yang disebabkan oleh ketakutan (Bernabeu). et al., 1995; Cammarota et al., 2005; Bonini et al., 2006) tetapi juga untuk penyatuan semula ingatan kepupusan mengelakkan (Radiske et al., 2015). Pemerhatian terakhir ini mencadangkan hipotesis ketiga, yang kami siasat dalam kajian ini, bahawa hippocampus terlibat dalam penyatuan semula ingatan pengelakan yang didorong oleh ketakutan hanya apabila pengaktifan semula menghasilkan ramalan yang bercanggah mengenai kemungkinan hasil tindak balas pengelakan.

Pengubahsuaian dalam aktiviti ayunan hippocampal dikaitkan dengan pemprosesan ingatan (Lisman, 2005). Khususnya, peningkatan interaksi theta- gamma dikaitkan dengan pengambilan semula ingatan (Gruber et al., 2004; Montgomery dan Buzsaki, 2007) dan ayunan ini berfungsi untuk mengira isyarat ketidakpastian (Garrido et al., 2015) dan untuk membezakan antara betul dan salah. tindak balas (Sederberg et al., 2007), yang semuanya berkaitan dengan beberapa aspek penyatuan semula ingatan dalam persediaan yang berbeza (Ferna'ndez et al., 2016).

Oleh itu, kami juga menyatakan bahawa persaingan surih pada permulaan penyatuan semula meningkatkan gandingan theta-gamma dalam hippocampus. Untuk menguji andaian ini, kami menggunakan paradigma pengelakan perencatan langkah ke bawah (SD-IA), satu percubaan, tugas pembelajaran yang bergantung kepada hippocampus yang sesuai untuk mengkaji perubahan yang bergantung pada masa yang berkaitan dengan pengambilan pengelakan yang dipelajari dalam tikus.

Bahan dan Kaedah

Mata pelajaran. Kami menggunakan 3-tikus Wistar jantan naif berusia sebulan dengan berat 300 – 350 g untuk eksperimen. Haiwan ditempatkan dalam kumpulan berlima dan dikekalkan pada kitaran terang/gelap 12:12 jam (lampu pada 6:00 PG) pada 23 darjah dengan akses ad libitum kepada makanan dan air. Kami melakukan eksperimen semasa kitaran cahaya. Haiwan dilatih dan diuji sekali sahaja. Semua prosedur adalah mengikut Panduan Institut Kesihatan Kebangsaan untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal dan telah diluluskan oleh jawatankuasa etika institusi tempatan (Comissa˜o de E´tica no Uso de Animais, CEUA). Eksperimen dijalankan secara buta terhadap keadaan rawatan haiwan.

Cannula dan implan pelbagai elektrod. Kami menanam haiwan dengan {{0}}panduan keluli tahan karat tolok yang ditujukan pada kawasan CA1 hippocampus dorsal (koordinat stereotaksik, dalam milimeter: anteroposterior, 4.2; anterolateral, 3.0; dorsoventral, 3 .0). Enam haiwan telah diimplan secara kronik dengan 16-tatasusunan elektrod saluran dalam hippocampus dorsal kiri (koordinat stereotaksik, dalam milimeter: anteroposterior, 3.6; anterolateral, 2.4; dorsoventral, 3.6 mm) dan dua skru epidural disetempat di tulang parietal sebagai tanah elektrod. Tatasusunan elektrod diperbuat daripada wayar mikro tungsten (AM Microsystems) bersalut tumpul, bersalut PFA 50 m yang diletakkan dalam konfigurasi 2 8 dengan jarak 250 m antara elektrod bersebelahan. Implan dilakukan di bawah anestesia ketamin (80 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) dan, sejurus selepas pembedahan, haiwan menerima satu dos subkutaneus meloxicam (0.2 mg/kg) sebagai analgesik. Selepas pembedahan, tikus dengan implan elektrod ditempatkan secara individu. Prosedur tingkah laku bermula 7-10 hari selepas pembedahan.

Reka bentuk eksperimen dan analisis statistik. Sebelum latihan dalam SD-IA (lihat di bawah), tikus telah diserahkan kepada salah satu daripada tiga prosedur berbeza seperti berikut. Haiwan kawalan dikendalikan selama 5 min/d semasa 5 d (kumpulan kawalan). Haiwan kumpulan padang terbuka (OF) dibenarkan meneroka 60 * 6{{30}} * 60 cm gelanggang kelabu muda OF selama 5 min/h selama 5 hari. Haiwan kumpulan kotak latihan (TB) diletakkan pada platform TB SD-IRA dan dibenarkan menerokai radas secara bebas selama 5 min/hari selama 5 hari. Satu hari atau 28 hari selepas tamat prosedur ini, tikus telah dilatih dalam tugas SD-IA. Radas SD-IA ialah kotak Plexiglas 50 25 25 sm dengan platform setinggi 5-cm, 8-lebar, 25-cm panjang di hujung kiri satu siri bar gangsa yang membentuk lantai kotak itu. Untuk latihan (satu sesi dilakukan antara 8:00 PG dan 11:00 PG), haiwan diletakkan di atas pelantar menghadap sudut kiri belakang radas SD-IRA. Apabila mereka berundur dan meletakkan empat kaki mereka pada grid, mereka menerima 0.8 mA (latihan kuat) atau 0.4 mA (latihan lemah) renjatan kaki bergegas selama 2 saat dan segera dikembalikan ke sangkar rumah mereka. Untuk mengaktifkan semula jejak ingatan pengelakan, 24 jam selepas latihan SD-IA, haiwan itu diletakkan semula pada platform TB selama 40 saat. Selama 40-an ini, tikus-tikus meneroka pelantar mengelak daripada turun daripadanya. Pengekalan dinilai menggunakan kumpulan haiwan bebas 3 jam, 1 hari, atau 14 hari selepas pengaktifan semula memori SD-IA. Untuk melakukan itu, haiwan diletakkan pada platform TB SD-IA dan kependaman untuk berhenti daripadanya diukur. Sesi ini tamat apabila haiwan itu turun ke grid atau selepas 500 s. Tiada kejutan kaki diberikan. Oleh kerana siling 500 s yang dikenakan ke atas kependaman sesi ujian pengekalan dan fakta bahawa tiada ujian ANOVA berbilang faktor yang disahkan untuk pembolehubah bukan parametrik, data dinyatakan sebagai median (julat antara kuartil) dan dianalisis dengan ujian Mann–Whitney U dua ekor atau Kruskal– Ujian Wallis diikuti dengan perbandingan post hoc Dunn, apabila sesuai. Data daripada sesi prapendedahan dan latihan (tiada siling dikenakan) dinyatakan sebagai min SEM dan dianalisis menggunakan ANOVA diikuti dengan ujian perbandingan berbilang Bonferroni. Kepentingan ditetapkan pada p 0.05. Analisis data dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism 6 (RRID: SCR_002798).

Elektrofisiologi in vivo. Isyarat neurofisiologi diperoleh secara berterusan menggunakan sistem Pemproses Isyarat Neural Cerebus (Black rock Microsystems). Data telah dikuatkan, ditapis pada frekuensi cutoff 0.3 dan 150 Hz, disampel pada 1000 Hz dan dianalisis di luar talian dalam MATLAB (RRID: SCR_001622) menggunakan rutin terbina dalam dan tersuai ( Kotak Alat Pemprosesan Isyarat). Lapisan sel piramid CA1 telah dikenal pasti oleh koordinat stereotaxic dan parameter elektrofisiologi piawai seperti kuasa theta maksimum pada fisur hippocampal dan pembalikan fasa aktiviti theta merentasi stratum radiatum (Brankack et al., 1993; Bragin et al., 1995). Kami menggunakan kaedah periodogram Welch (5 s Hamming windows, 75 peratus bertindih) untuk pengkomputeran spektrum kuasa. Nisbah kuasa menunjukkan kuasa seunit frekuensi dinormalkan oleh kuasa semasa zaman garis dasar (40 saat pertama rakaman stabil dalam sangkar rakaman). Potensi medan garis dasar diperoleh dalam sangkar rakaman 1 jam sebelum pengaktifan semula ingatan. Kuasa jalur theta, gama perlahan dan gamma cepat ditakrifkan sebagai kuasa purata dalam julat frekuensi 5–10, 35–55, dan 55–100 Hz, masing-masing. Untuk analisis gandingan frekuensi silang, amplitud gamma perlahan dan cepat serta fasa theta sepanjang rakaman telah dikira daripada transformasi Hilbert versi ditapis bagi setiap jalur frekuensi. Fasa Theta telah dibinkan kepada 18 selang 20 darjah. Purata amplitud jalur gamma telah dikira untuk setiap tong fasa theta dan dinormalkan dengan jumlah nilai amplitud ke atas semua tong. Kekuatan modulasi antara jalur frekuensi dinyatakan oleh indeks modulasi (MI), yang menunjukkan jarak Kullback-Leiber antara taburan seragam dan fungsi kebarangkalian yang diperoleh daripada amplitud min setiap taburan fasa (Tort et al., 2010). Peta modulasi Co diperoleh dengan menyatakan MI beberapa pasangan jalur frekuensi (lebar jalur 4 Hz, langkah 1 Hz untuk frekuensi fasa; lebar jalur 10 Hz, langkah 5 Hz untuk frekuensi amplitud) dalam plot pseudocolor dwidimensi (Tort et al., 2010) . Purata MI diperoleh dengan purata nilai MI yang sepadan dalam kawasan (5–10 Hz) (35–55 Hz) atau (5–10 Hz) (55–100 Hz) bagi peta modulasi bersama. MI dikira daripada elektrod tunggal menggunakan 40-s-panjang rakaman LFP bersebelahan daripada sesi pengaktifan semula. Peristiwa amplitud gamma perlahan dan cepat telah dikenalpasti dan fasa theta yang berkaitan ditentukan. Peristiwa ini ditakrifkan sebagai selang masa apabila kuasa gamma melepasi 2 SD kuasa purata masa masing-masing seperti dalam Colgin et al. (2009). Untuk mengelakkan analisis peristiwa gamma artifak, kami tidak mempertimbangkan selang masa dengan kuasa 6 SD dalam pengiraan. Acara yang dipisahkan sebanyak 100 ms telah digabungkan dan dianggap sebagai satu acara. Fasa Theta pada titik masa yang sepadan dengan maksimum setiap peristiwa gamma telah diekstrak dan min bulatan dikira, memperoleh nilai fasa tunggal yang dikaitkan dengan kejadian amplitud gamma yang tinggi. Kamera video digital yang dipasang di atas radas SD-IA dan sangkar rakaman digunakan untuk mengesan kedudukan haiwan itu. Data video diperoleh pada 30 bingkai/s dan dianalisis menggunakan sistem TopScan (CleverSys). Data dinyatakan sebagai min SEM dan dianalisis menggunakan ujian-t Pelajar tidak berpasangan atau ujian-t satu sampel dengan min teori 1. Peletakan elektrod telah disahkan postmortem. Tikus telah dibius secara mendalam dan diperas secara intrakardi terlebih dahulu dengan garam, pH 7.2, dan kemudian dengan 4 peratus paraformaldehid, pH 7.2. Otak dikeluarkan, dibiarkan dalam 30 peratus sukrosa selama 48 jam, dan dipotong secara korona (50 m bahagian). Bahagian yang berkaitan telah dipilih dan diwarnai dengan cresyl violet untuk mengesahkan lokasi elektrod. eksperimen, 1 l daripada 4 peratus metilena biru telah diselitkan seperti yang diterangkan di atas dan lanjutan pewarna 30 minit selepas itu diambil sebagai petunjuk resapan kenderaan/ubat yang disuntik sebelum ini. Hanya data daripada haiwan dengan implan kanula yang betul (96 peratus) dimasukkan dalam analisis statistik.

Keputusan

Pendedahan pralatihan tidak bertetulang berulang kepada peralatan latihan menimbulkan penyertaan hippocampus dalam penyatuan ingatan mengelakkan

Untuk menentukan kesan pembelajaran sebelumnya terhadap penyatuan semula ingatan pengelakan bermotivasi ketakutan, tikus Wistar jantan (3 bulan; 300 –350 g) dikendalikan (kumpulan kawalan) atau dibenarkan meneroka secara bebas sama ada arena OF (kumpulan OF) atau TB SD-IA (kumpulan TB) selama 5 minit sekali sehari selama 5 hari. Dua puluh empat jam kemudian, haiwan itu dilatih dalam SD-IA (0.8 mA/2 s renjatan kaki) dan 1 hari selepas itu diserahkan kepada 40-s-long sesi pengaktifan semula ingatan tidak bertetulang. Sejurus selepas itu, tikus menerima suntikan dua hala kenderaan (VEH; 0.9 peratus salin), penyekat transkripsi gen AMA (45 ng/sisi), atau perencat sintesis protein ANI (160 g / sisi) ke kawasan CA1 hippocampus dorsal. Kawalan dan OF haiwan menunjukkan pengekalan memori SD-IA yang normal semasa sesi ujian yang dilakukan 24 jam selepas pengaktifan semula tanpa mengira rawatan. Haiwan TB yang menerima VEH juga menunjukkan pengekalan normal, tetapi yang diberi AMA atau ANI adalah amnesik (Rajah 1B; kumpulan kawalan: H 0.8501, p 0.6537; DARI kumpulan: H 0.1925, p 0.9082; kumpulan TB: H 12.23, p 0.0022, VEH lwn AMA p 0.05, VEH lwn ANI p 0.01 dalam perbandingan berganda Dunn selepas ujian Kruskal–Wallis).

Pentadbiran Intra-CA1 selepas pengaktifan AMA dan ANI juga menyebabkan amnesia kepada haiwan TB yang dilatih dalam SD-IA menggunakan renjatan kaki yang lemah (0.4 mA/2 s; Rajah 1C; kumpulan kawalan: H {{7} }.2679, p 0.8747; Kumpulan TB: H 14.96, p 0.0006, VEH lwn AMA p 0.05, VEH lwn ANI p 0.001 in Perbandingan berganda Dunn selepas ujian Kruskal–Wallis).

Dalam persetujuan dengan tanggapan bahawa pembelajaran terdahulu maklumat nonaversif yang bercanggah adalah syarat yang diperlukan untuk penglibatan hippocampus dalam penyatuan semula ingatan mengelakkan, amnesia yang disebabkan oleh AMA dan ANI berlangsung selama sekurang-kurangnya 14 hari (Rajah 1D; H 15.43, p { {4}}.0004, VEH lwn AMA p 0.001, VEH lwn ANI p 0.05 in Perbandingan berbilang Dunn selepas ujian Kruskal–Wallis) dan tidak diperhatikan apabila AMA dan ANI disuntik 6 jam selepas (Rajah 1E; H 2.376, p 0.3049) atau tanpa pengaktifan semula ingatan (Rajah 1F; H 2.282, p 0.3196 ), apabila kami menguji haiwan untuk pengekalan 3 jam dan bukannya 24 jam selepas pengaktifan semula (Rajah 1G; H 1.959, p 0.3754), atau apabila kami menyerahkan haiwan ke sesi prapendedahan TB tunggal (Rajah 1H; H 1.478, p. 0.4776).

Prapendedahan berulang kepada TB mengurangkan kependaman step-down semasa latihan tetapi tidak menjejaskan kekuatan atau kegigihan memori SD-IA (Rajah 2A, kiri: F(2,47) 26.46, p 0.0 01 kesan prapendedahan; t(47) 2.144, p 0.05 untuk kumpulan kawalan lwn OF kumpulan; t(47) 7.1{{30}} 6, p 0.001 untuk kumpulan kawalan lwn kumpulan TB; t(47) 4.994, p 0.001 untuk kumpulan OF lwn kumpulan TB dalam Bonferroni's ujian berbilang perbandingan selepas ANOVA sehala; Rajah 2A, kanan, hari 1: H 0.4478, p 0.7994; hari 14: H 0.2072, p 0.9016). Selain itu, pengaktifan semula tidak bertetulang tidak menjejaskan kekuatan tindak balas pengelakan yang dipelajari tanpa mengira intensiti renjatan kaki semasa latihan (Rajah 2B, C; U 24.50, p 0.9999, kumpulan tanpa RA vs kumpulan RA untuk latihan yang kuat dan U 20.00, p 0.5594, kumpulan tanpa RA vs kumpulan RA, untuk latihan yang lemah).

Ungkapan faktor transkripsi Zif268 ialah penanda penyatuan semula hippocampal terpilih (Lee et al., 2004), dan pengaktifan farmakologi isyarat reseptor -adrenergik meningkatkan penyatuan semula ingatan ketakutan (tetapi lihat juga Muravieva dan Alberini, 2010; De˛biec et al., 2011). Dalam haiwan TB, tetapi bukan dalam haiwan kawalan, infusi intra-CA1 oligodeoxynucleotides antisense Zif268 (2 nmol/sisi) 90 min sebelum pengaktifan semula ingatan menimbulkan amnesia 24 jam kemudian (Rajah 3A; kumpulan kawalan: U 49.5{ {55}}, p 0.9999, MSO lwn ASO; Kumpulan TB: U 7.50, p 0.0007, MSO lwn ASO dalam ujian Mann–Whitney) manakala pentadbiran intraperitoneal agonis reseptor adrenergik ISO (5 mg/kg) serta-merta selepas pengaktifan semula memperlahankan pereputan ingatan (Rajah 3B; U 15.{{80}}{{ 89}}, p 0.0{{100}}73, VEH lwn ISO dalam ujian Mann–Whitney). Selain itu, pentadbiran AMA dan ANI selepas pengaktifan semula memori SD-IA tidak menjejaskan pengekalan pada haiwan yang menerima antagonis NMDAr AP5 (5 g/sisi) dalam CA1 dorsal selepas setiap sesi prapendedahan (Rajah 4A, kiri: F(4,196) 5.472, p 0.0003 untuk kesan rawatan; F(1,49) 15.81, p 0.0002 untuk kesan sesi; F(4,196) 5.248, p 0.0005 untuk interaksi; sesi 4-AP5: t(245) 4.000, p 0.038, p 0.038 sesi 4-VEH; sesi 5-AP5:t(245) 4.179, p 0.001 lwn sesi 5-VEH dalam ujian berbilang perbandingan Bonferroni selepas ANOVA dua hala; Rajah 4A, kanan: VEH selepas prapendedahan berulang: H 12.96, p 0.0015, VEH lwn AMAp 0.01, VEH lwn ANI p 0.05; AP5 selepas prapendedahan berulang: H 2.046, p 0.3595 dalam perbandingan berbilang Dunn selepas Kruskal–Wallis ujian lepas) sesi prapendedahan dan sesi latihan ditingkatkan daripada 1 kepada 28 d. Walau bagaimanapun, pendedahan semula kepada TB SD-IA, tetapi bukan kepada arena OF, 27 hari selepas sesi prapendedahan terakhir memulihkan kesan amnesik AMA dan ANI (Rajah 4C kiri: kumpulan dikendalikan: H 0.07045, p 0.9654; kumpulan OF: H 3.214, p 0.2005; kumpulan terdedah semula: H 19.20, p 0.0001, VEH lwn AMAp 0.001, VEH lwn ANI p 0.001 dalam perbandingan berganda Dunn selepas ujian Kruskal–Wallis)

Penyatuan semula ingatan mengelak meningkatkan gandingan theta–gamma hippocampal

Penyatuan semula ingatan telah dicirikan secara meluas pada tahap farmakologi dan molekul (Alberini, 2005; Tronson dan Taylor, 2007; Haubrich dan Nader, 2016). Walau bagaimanapun, analisis elektrofisiologi proses ini hilang, yang sehingga kini menghalang penerangan tandatangan elektrofisiologi penyatuan semula yang pasti.

Dalam hippocampus, ayunan potensi medan setempat (LFP) dalam jalur theta (5–10 Hz) dikaitkan dengan pengesanan luar jangka (Nokia dan Wikgren, 2010), manakala ayunan perlahan (35–55 Hz) dan gamma cepat (55–100 Hz) terlibat dalam pemindahan maklumat dari dan ke kawasan otak yang lain (Fries, 20 09). Gamma perlahan berasal dari CA3 dan merambat ke stratum radiatum CA1 melalui cagaran Schaffer, manakala aktiviti gamma pantas nampaknya dijana terutamanya dalam korteks entorhinal medial dan merambat ke stratum lacunose-molekul, walaupun asal dan sifat sebenar aktiviti berayun ini kekal. untuk dijelaskan sepenuhnya (Csicsvari et al., 2003; Colgin et al., 2009; Zemankovics et al., 2{{1 06}}13; Laszto´ czi dan Klausberger, 2014, 2016). Ayunan gamma yang perlahan dan cepat juga boleh direkodkan daripada lapisan piramid CA1 (Butler et al., 2016), di mana gandingan mereka kepada theta mencerminkan integrasi maklumat novel dengan yang diperoleh daripada stor memori jangka panjang semasa pembelajaran (Fell dan Axmacher, 2011; Yaffe et al., 2014). Untuk menentukan sama ada aktiviti LFP hippocampal yang disebabkan oleh pengaktifan semula berbeza antara haiwan yang hanya mendapatkan tindak balas pengelakan (kumpulan kawalan) dan haiwan yang juga menyatukan semula tindak balas itu (kumpulan TB), kami merekodkan LFP dalam lapisan sel piramid CA1 dorsal dan menganalisis perubahan dalam ayunan. corak semasa pengaktifan semula memori SD-IA dengan mengukur kuasa relatif jalur theta dan gamma. Kami mendapati bahawa amplitud ayunan gamma perlahan meningkat dalam kedua-dua kumpulan kawalan dan TB semasa pengaktifan semula (Rajah 5C; kumpulan kawalan: t(5) 2.605, p 0.0480; kumpulan TB: t(5) 5.182, p 0.0035 dalam{{35 }}sampel ujian-t dengan min teori 1; kumpulan kawalan vs kumpulan TB: t(10) 1.858, p 0.0928 dalam ujian-t tidak berpasangan), dalam persetujuan dengan laporan yang mencadangkan bahawa gamma perlahan terlibat dalam pengambilan semula ingatan (Colgin, 2015) . Haiwan TB, tetapi bukan haiwan kawalan, juga menunjukkan peningkatan dalam theta dan kuasa gamma pantas (Rajah 5C; kumpulan TB: t(5) 8.754, p 0.0003 untuk jalur theta; t(5) 3.601, p 0.0155 untuk jalur gamma pantas dalam 1-ujian-t sampel dengan min teori 1; kumpulan kawalan lwn kumpulan TB: t(10) 2.524, p 0.0302 untuk jalur theta; t(10) 2.527, p 0.0300 untuk jalur gamma pantas dalam ujian-t tidak berpasangan ). Menggunakan MI (Canolty et al., 2006; Tort et al., 2010), kami mendapati bahawa amplitud gamma yang perlahan dan cepat digabungkan dengan theta semasa pengaktifan semula memori SD-IA dan modulasi ini lebih kuat pada haiwan TB berbanding haiwan kawalan. (Rajah 5F; kumpulan kawalan lwn kumpulan TB: t(10) 3.639, p 0.0045 untuk gamma perlahan theta; t(10) 3.963, p 0.0027 untuk gamma pantas theta dalam ujian-t tidak berpasangan). Untuk menyiasat sama ada perbezaan dalam kekuatan gandingan ini sememangnya mencerminkan pemproses memori aktif hanyalah hasil daripada pengenalan fasa yang lebih baik kerana peningkatan kuasa theta dalam haiwan TB (Canolty et al., 2006; Tort et al., 2008), kami mengikat respons LFP direkodkan semasa 40-s-long sesi pengaktifan semula SD-IA ke dalam 1-s-selang panjang dan menyamakan kuasa theta antara kawalan dan haiwan TB (Rajah 5G, kiri: kumpulan kawalan vs kumpulan TB: t( 10) 0.1640, p 0.8730 dalam ujian-t tidak berpasangan) untuk mengira semula MI dengan hanya mengambil kira zaman dengan nilai kuasa theta di atas atau di bawah persentil ke-50, masing-masing. Kami mendapati bahawa, walaupun dalam keadaan yang ketat ini, MI adalah lebih tinggi dalam TB berbanding haiwan kawalan (Rajah 5G, kanan: kumpulan kawalan vs kumpulan TB: t(10) 3.006, p 0.0132 untuk gamma theta-perlahan; t(10) 5.409, p 0.0003 untuk gamma pantas theta dalam ujian-t tidak berpasangan).

Analisis taburan amplitud ternormal gamma ke atas fasa theta menunjukkan bahawa dalam haiwan TB, tetapi bukan dalam haiwan kawalan, kuasa maksimum komponen gamma perlahan dan cepat berlaku berhampiran puncak kitaran theta semasa pengaktifan semula ingatan (Rajah 5H, kiri). Kami juga menentukan taburan fasa theta bagi peristiwa gamma perlahan dan cepat, yang ditakrifkan sebagai tempoh apabila kuasa subjalur frekuensi gamma yang dipilih melebihi 2 SD kuasa min, dan mendapati bahawa dalam haiwan TB peristiwa gamma perlahan dan cepat berlaku pada fasa yang berbeza kitaran theta, dengan episod gamma perlahan tertumpu pada bahagian menaik lewat dan peristiwa gamma pantas pada fasa menurun awal gelombang theta (Rajah 5H, kanan: 347.18 darjah 5.33 untuk peristiwa gamma perlahan dan 36.34 darjah 13.{{15} }3 untuk peristiwa gamma pantas, sisihan sudut fasa min; F(2,10) 7.11, p 0.048 dalam ujian sampel berpasangan Hotelling untuk min sudut yang sama; taburan fasa tidak seragam p 0.001 dalam Rayleigh ujian; 0 darjah ditakrifkan sebagai puncak kitaran theta).

Modulasi pembezaan jalur gamma perlahan dan cepat yang diperhatikan dalam haiwan TB semasa pengaktifan semula ingatan adalah bebas daripada bilangan peristiwa gamma (Rajah 5I; peristiwa gamma perlahan: t(10) 2.194, p 0 .0529, kumpulan kawalan lwn kumpulan TB; peristiwa gamma pantas: t(10) 1.470, p 0.1724, kumpulan kawalan lwn kumpulan TB; ujian t tidak berpasangan).

Perbincangan

Pembelajaran nonaversif sebelumnya adalah syarat sempadan untuk mengelak penyatuan ingatan

Penyatuan semula bukanlah akibat yang perlu daripada pengaktifan semula ingatan, tetapi terdapat keadaan eksperimen yang mengekang proses ini. Beberapa keadaan sempadan ini telah pun diterangkan, walaupun terdapat laporan yang bercanggah tentang setiap satu daripada mereka, yang tidak menghairankan memandangkan bilangan pembolehubah tingkah laku dan interaksi fisiologi yang boleh menjejaskan pengaktifan dan pengambilan semula ingatan (Nader dan Hardt, 2009). Walau bagaimanapun, penemuan bahawa perencatan sintesis protein hippocampal selepas pengaktifan semula ketakutan-elak tidak mengakibatkan amnesia yang berterusan telah sangat konsisten dari masa ke masa (Taubenfeld et al., 2001; Cammarota et al., 2004; Power et al., 2006; Arguello et al., 2013), menyokong idea bahawa hippocampus tidak terlibat dalam penyatuan semula ingatan mengelakkan ketakutan. Bercanggah dengan pandangan ini, eksperimen kami menunjukkan bahawa hippocampus memang mengambil bahagian dalam penyatuan semula ingatan pengelakan, tetapi hanya apabila haiwan itu berulang kali terdedah kepada persekitaran latihan sebelum memperoleh jejak ingatan pengelakan. Penegasan ini adalah berdasarkan keputusan yang menunjukkan bahawa pentadbiran intra-CA1 AMA atau ANI sejurus selepas pengaktifan semula menyebabkan amnesia bergantung masa untuk ingatan SD-IA dalam haiwan yang terdedah (kumpulan TB), tetapi tidak dalam kawalan tikus yang tidak terdedah (kumpulan kawalan) atau tikus pra. -terdedah kepada arena OF yang tidak berkaitan dengan SD-IA TB (kumpulan OF). Selain itu, kesan amnesik AMA dan ANI tidak berlaku apabila pengekalan dinilai 3 jam selepas pengaktifan semula dan ditiru dengan menyekat ekspresi penanda penyatuan semula Zif268 dalam hippocampus. Tidak mungkin perencatan terpendam boleh menyumbang kepada keputusan kami kerana telah dilaporkan berulang kali bahawa pra-pendedahan kepada konteks latihan meningkat dan bukannya mengurangkan ketakutan kekuatan ingatan (Pisano et al., 2012), yang seterusnya akan menjadikan ingatan tahan terhadap penyatuan semula (Suzuki et al., 2004; Wang et al., 2009). Walau apa pun, prapendedahan kepada radas SD-IA tidak mengubah kekuatan atau kegigihan memori SD-IA, dan kesan AMA dan ANI pada penyatuan semula adalah bebas daripada kekuatan tindak balas pengelakan, yang bersama-sama dengan fakta bahawa prapendedahan berulang menjadikan jejak mudah terdedah dan bukannya tahan terhadap manipulasi hippocampal, membolehkan kita membuang juga sebarang kemungkinan pengaruh kesan pemudahcara prapendedahan yang serupa dengan yang diterangkan untuk pembentukan ingatan penyesuaian ketakutan kontekstual (Fenselow, 1990; Barrientos et al., 2002).

Hippocampus menyokong skema bersekutu yang menyusun pengetahuan yang diperoleh sebelum ini dan mengira isyarat tidak sepadan (Vinogradova, 2001; Lisman dan Grace, 2005; Schiller et al., 2015). Oleh itu, telah dicadangkan bahawa hippocampus secara khusus terlibat dalam penyatuan semula ingatan apabila pengaktifan semula berlaku serentak dengan kebaharuan atau pengesanan ralat ramalan (Morris et al., 2006; Rossato et al., 2007; Ferna'ndez et al., 2016). Walau bagaimanapun, dalam eksperimen kami, haiwan kawalan mahupun TB tidak membuat sebarang kesilapan atau mempelajari sebarang maklumat baharu semasa sesi pengaktifan semula, tetapi mereka pasti mempunyai jangkaan yang berbeza tentang kemungkinan hasil sesi ini. Bagi haiwan kawalan, satu-satunya akibat yang boleh diramalkan daripada berundur dari platform selamat semasa pengaktifan semula adalah kejutan kaki, manakala, untuk tikus TB, akibat tindakan ini tidak dapat diramalkan dengan jelas. Oleh itu, adalah menggoda untuk membuat spekulasi bahawa apa yang mencetuskan penglibatan hippocampus dalam penyatuan semula ingatan pengelakan yang bermotivasi ketakutan bukanlah percanggahan antara fakta dan ramalan atau persepsi kebaharuan, tetapi ketidakpastian tentang kesan selepas pengelakan yang dibawa oleh perbandingan. antara bersaing untuk representasi yang bercanggah.

Aktiviti berayun dalam hippocampus dan mengelak penyatuan semula ingatan Ayunan theta hippocampal dikaitkan dengan mendapatkan semula maklumat yang relevan pilihan semasa membuat keputusan (Womelsdorf et al., 2010) dan menyelaraskan pengaktifan semula input yang berbeza meningkatkan ketepatan perbandingan (Vinogradova, 2001). Rakaman elektrofisiologi kami menunjukkan bahawa kuasa theta CA1 meningkat dalam haiwan TB, tetapi tidak dalam haiwan kawalan, semasa pengaktifan semula ingatan, menunjukkan bahawa aktiviti theta hippocampal mungkin mencerminkan pengkomputeran maklumat yang bercanggah pada permulaan penyatuan semula. Telah dicadangkan bahawa frekuensi gamma perlahan menggalakkan perolehan semula ingatan manakala irama gamma pantas memudahkan pengekodan dan pengekodan semula maklumat kontekstual semasa (Colgin, 2016). Dalam persetujuan dengan laporan ini, kami mendapati bahawa kedua-dua haiwan kawalan dan TB menunjukkan peningkatan aktiviti gamma perlahan, manakala hanya haiwan TB yang menunjukkan perubahan dalam jalur gamma pantas semasa pengaktifan semula ingatan. Dalam amygdala, kuasa gamma pantas dikaitkan dengan isyarat keselamatan dan diketahui bahawa ekspresi keadaan aversive dan keselamatan melibatkan interaksi segerak struktur ini dengan hippocampus (Stujenske et al., 2014). Kemudian, penjelasan alternatif untuk penemuan kami ialah peningkatan aktiviti gamma cepat hippocampal yang diperhatikan dalam haiwan TB mencerminkan pengaktifan semula perwakilan bukan aversif yang dipelajari semasa prapendedahan berulang kepada peralatan latihan.

Interaksi theta-gamma dikaitkan dengan keplastikan sinaptik, pengambilan semula ingatan, dan komunikasi antara kawasan otak (Lisman, 2005; Canolty dan Knight, 2010; Jutras dan Buffalo, 2010; Lesting et al., 2011). Kami mendapati bahawa fasa theta sangat memodulasi amplitud jalur gamma yang perlahan dan cepat semasa pengaktifan semula ingatan dalam TB, tetapi bukan dalam haiwan kawalan, menunjukkan bahawa kekuatan gandingan frekuensi silang ini dalam hippocampus adalah korelasi elektrofisiologi bagi penyatuan semula ingatan. Walaupun variasi yang bergantung kepada kelajuan dalam aktiviti LFP hippocampal telah dilaporkan (Whishaw dan Vanderwolf, 1973; Montgomery et al., 2009; Newman et al., 2013), tidak mungkin perbezaan dalam aktiviti motor boleh menyumbang kepada keputusan kami kerana kedua-dua kawalan dan haiwan TB tinggal di platform TB dalam keadaan pergerakan yang minimum (min halaju 1 cm/s) semasa sesi pengaktifan semula.

Kesimpulan dan kemungkinan implikasi

Intervensi klinikal yang bertujuan untuk melemahkan ingatan berterusan pengalaman traumatik boleh berdasarkan, bukan sahaja pada gangguan penyatuan semula ingatan mengelakkan tetapi juga pada peningkatan kepupusan ingatan mengelakkan (Vervliet et al., 2013; Schwabe et al., 2014). Kepupusan ialah proses di mana kebarangkalian pelepasan tindak balas yang dipelajari berkurangan apabila pengaktifan semula tidak bertetulang berulang dan melibatkan pembentukan ingatan yang menghalang yang akhirnya bersaing dengan jejak asal. Penyatuan semula dan kepupusan adalah proses yang saling eksklusif (Merlo et al., 2014) dan telah dicadangkan bahawa sama ada pengambilan semula menghasilkan pembelajaran kepupusan atau penyatuan semula ingatan bergantung kepada keadaan sempadan yang berlaku semasa sesi pengaktifan semula. Walau bagaimanapun, walaupun kepupusan dan penyatuan semula adalah eksklusif antara satu sama lain, jejak ingatan yang menghalang yang disebabkan oleh pembelajaran kepupusan adalah terdedah kepada penyatuan semula (Rossato et al., 2010). Sebagai contoh, memori kepupusan SD-IA mengalami penyatuan semula yang bergantung kepada sintesis protein dalam hippocampus selepas pengaktifan semula dan manipulasinya sama ada boleh memulihkan tindak balas pengelakan atau meningkatkan kesan ingatan kepupusan (Radiske et al., 2015; Rosas-Vidal et al., 2015). Penemuan ini, bersama-sama dengan keputusan yang dibentangkan dalam kajian ini, sangat mencadangkan bahawa hippocampus terlibat dalam penyatuan semula ingatan apabila isyarat yang bercanggah dikesan semasa sesi pengaktifan semula dan bahawa perwakilan mnemonik yang sebenarnya mengawal tingkah laku haiwan dalam sesi itu adalah yang menjadi. terdedah kepada gangguan farmakologi, seperti yang dicadangkan oleh teori penguasaan jejak (Eisenberg et al., 2003). Dalam rangka kerja ini, kami mencadangkan bahawa terapi berdasarkan gangguan penyatuan semula ingatan harus diutamakan untuk merawat trauma dan fobia yang berkaitan dengan konteks biasa, manakala campur tangan berdasarkan kemudahan kepupusan harus menjadi preskripsi pilihan apabila peristiwa traumatik berpunca daripada latar belakang yang tidak dikenali. . Akhir sekali, keputusan kami juga mencadangkan bahawa analisis gandingan amplitud fasa daripada isyarat EEG yang direkodkan semasa psikoterapi berasaskan penyatuan semula boleh berguna untuk mengesahkan kejadian sebenar proses ini dan meramalkan keberkesanan rawatan.