AKT Diaktifkan Prasyarat Mengawal Toleransi Neuron Terhadap Iskemia Melalui Laluan MDM2–p53Ⅱ

3. Perbincangan

Keputusan kami mendedahkan bahawa pengaktifan IPC-pengantara laluan isyarat PI3K / AKT mencetuskan IT neuron dengan mengawal kompleks MDM2-p53 dalam neuron kortikal primer. Kami mula-mula mengesahkan kecekapan prasyarat dari segi neuroprotection [33,39-41] menggunakan model eksperimen IPC yang disahkan.

Klik untuk cistanche tubulosa kesan sampingan untuk Neuron

Kami mendapati bahawa IPC percubaan yang disebabkan oleh kekurangan oksigen dan glukosa (OGD) yang singkat (20 minit) diikuti dengan 2 jam reoksigenasi menghasilkan perlindungan saraf, seperti yang ditunjukkan oleh pencegahan kedua-dua apoptosis neuron dan pengaktifan caspase-3 yang disebabkan oleh berpanjangan. OGD (90 min) diikuti dengan 4 jam reoksigenasi (OGD/R). Kami menunjukkan bahawa IPC mengurangkan pengaktifan caspase-3 dalam neuron kortikal, yang berkorelasi dengan kurang apoptosis selepas penghinaan iskemia yang seterusnya dan lebih teruk.

Keseimbangan antara isyarat pro dan antiapoptosis adalah asas untuk memastikan survival neuron selepas iskemia [3,33,38,42-44]. Walaupun kaitan peristiwa sedemikian telah ditunjukkan dalam kedua-dua model strok hemoragik dan iskemia in vivo [43,45], mekanisme yang mengawal laluan isyarat ini belum difahami sepenuhnya dalam konteks toleransi iskemia. Peranan AKT antiapoptotik dan laluan berkaitannya telah dikaji secara meluas dalam sel-sel kanser [46,47] dan tisu otak [38,48]; walau bagaimanapun, setakat ini, peranan laluan isyarat AKT/MDM2– p53 dalam toleransi neuron pengantara IPC terhadap kecederaan iskemia masih sukar difahami.

Di sini, kami mendapati bahawa pengaktifan laluan isyarat PI3K/AKT yang disebabkan oleh IPC menggalakkan fosforilasi MDM2 pada Ser166, yang mencetuskan translokasi nuklear dan penstabilan proteinnya, menghalang p53-apoptosis teraruh melalui pengaktifan caspase-3 selepas iskemia. Pengaktifan AKT melalui fosforilasi menggalakkan survival neuron [24,49] dan boleh menyumbang kepada induksi IT [25,50]. Keputusan kami menunjukkan bahawa kelimpahan relatif protein AKT tidak berubah di bawah rangsangan iskemia atau prasyarat. Menariknya, kami mendapati bahawa fosforilasi awal PI3K-pengantara AKT di Ser473 menghalang penstabilan p53 yang disebabkan oleh iskemia dalam neuron prasyarat.

Kesannya bukan disebabkan oleh pengubahsuaian dalam tahap mRNA p53 [33,34,44] tetapi penurunan tahap protein p53 disebabkan oleh IPC sebelum OGD / R. Oleh kerana MDM2 adalah pengawal selia utama penstabilan p53 dan juga merupakan sasaran langsung AKT, keputusan kami menunjukkan peranan laluan isyarat AKT / MDM2-p53 dalam toleransi neuron terhadap iskemia. MRNA MDM2 meningkat dengan cepat selepas OGD [34], tetapi aktiviti MDM2 dikawal terutamanya oleh pengubahsuaian pasca translasi, terutamanya fosforilasi [51]. Dalam persetujuan yang baik dengan ini, kami mendapati bahawa sebaik sahaja diaktifkan oleh fosforilasi selepas IPC, AKT, seterusnya, memfosforilasi MDM2 pada residu Ser166, yang terletak berhampiran isyarat penyetempatan nuklear [52], dan kesan ini dikekalkan selepas kecederaan OGD / R.

Keputusan kami menunjukkan bahawa fosforilasi MDM2 di Ser166 mencukupi untuk memberikan kesan neuroprotektif yang dimediasi IPC melalui ketidakstabilan p53. Oleh itu, di sini, kami mengenal pasti pengaktifan laluan AKT / MDM2-p53 yang bergantung pada masa selepas kecederaan iskemia dan, sesungguhnya, kami menunjukkan bahawa AKT yang diaktifkan IPC mencetuskan translokasi nuklear MDM2 ektopik, serta penstabilan protein endogen.

Selain itu, AKT kekal aktif dalam nukleus, di mana PI3K juga boleh berhijrah sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif dan kemudian menyumbang kepada fosforilasi AKT [53]. Perencatan fosforilasi PI3K-mediated AKT atau AKT knockdown menggalakkan pengekalan protein MDM2 dalam sitoplasma, dan ia menghalang fosforilasi Ser166 MDM2, serta neuroprotection yang dimediasi IPC terhadap apoptosis neuron yang disebabkan oleh iskemia. Sebaliknya, kami menunjukkan bahawa AKT aktif mengikat protein MDM2 nuklear.

Akibatnya, AKT aktif menggalakkan kedua-dua fosforilasi MDM2 dan penstabilan nuklearnya, yang menyumbang kepada neuroprotection pengantara IPC. Keputusan kami mendedahkan bahawa perlindungan saraf yang digalakkan IPC bergantung kepada pengaktifan AKT yang dimediasi PI3K, yang memfosforilasi MDM2 di Ser166, mempromosikan pengumpulan nuklear MDM2 selepas penghinaan iskemia.

Oleh itu, perencatan PI3K / AKT oleh wortmannin atau pengurangan AKT oleh siRNA memansuhkan neuroprotection yang digalakkan IPC, yang membawa kepada penstabilan p53 dan apoptosis neuron berikutnya selepas iskemia. Oleh itu, keputusan kami membantu untuk menjelaskan peranan penting pengaktifan yang bergantung kepada IPC bagi laluan AKT-MDM2 dalam survival neuron terhadap kecederaan iskemia.

Protein p53 terlibat dalam kawalan kematian / kelangsungan hidup neuron yang menentukan prognosis dalam pesakit strok [34,42,54], serta dalam pesakit TIA [3]. Penstabilan P53 menjejaskan perlindungan saraf prakondisi-pengantara kepada kecederaan iskemia / reperfusi [33]. Interaksi MDM2-p53, oleh itu, akan menjadi kritikal untuk survival neuron dalam konteks ini [34] dan untuk toleransi pengantara IPC terhadap kecederaan iskemia [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G dalam promoter MDM2 menentukan ekspresi MDM2 dan, seterusnya, memodulasi pemulihan pesakit yang mengalami strok [34].

Di samping itu, kami mendapati bahawa gen Tp53 SNP (rs1042522) memodulasi penstabilan p53 mitokondria dan toleransi neuron terhadap iskemia sambil meramalkan pemulihan fungsi pesakit yang mengalami TIA sebelum strok [3]. Oleh itu, kawalan laluan apoptosis p53 adalah penting untuk memastikan kesan neuroprotektif IPC.

Keputusan ini memberikan pendekatan translasi kepada kajian yang boleh dilaksanakan pada masa hadapan untuk manfaat pesakit, dan mereka menimbulkan laluan isyarat PI3K/AKT-MDM2-p53 sebagai sasaran penting untuk strategi IT yang digalakkan prakondisi dalam strok iskemia. Ringkasnya, kami menunjukkan bahawa laluan isyarat PI3K / AKT yang dipertingkatkan IPC menggalakkan fosforilasi MDM2 di Ser166, yang membawa kepada translokasi nuklear MDM2 dan penstabilannya, yang mencetuskan IT neuron dengan mempromosikan ketidakstabilan p53 dan ketidakaktifan seterusnya kematian apoptosis yang disebabkan oleh penghinaan iskemia.

Keputusan kami menyerlahkan potensi manfaat pengaktifan awal AKT dalam toleransi neuron pengantara IPC, yang mengawal laluan apoptosis MDM2-p53 di bawah kecederaan iskemia. Penemuan ini menyerlahkan peluang untuk memahami mekanisme yang mengawal selia laluan isyarat AKT-MDM2-p53 neuron untuk membangunkan strategi neuroprotektif baru untuk gangguan berkaitan IT.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Budaya Utama Neuron Kortikal

Kultur neuron disediakan daripada korteks embrio tikus (14.5E) C57Bl/6J atau p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory). Neuron telah disemai pada 1.8 × 105 sel/cm2 dalam medium Neurobasal ditambah dengan 2 peratus B27 dan 2 mM glutamin (Invitrogen, Madrid, Sepanyol) dan diinkubasi pada 37 ◦C dalam 5 peratus CO{18}}lembap yang mengandungi atmosfera [ 55].

4.2. Model Kekurangan Glukosa Oksigen dan Prasyarat

Selepas 9–1{{1{19}}}} hari in vitro (DIV), neuron terdedah kepada kekurangan oksigen dan glukosa (OGD) dengan mengeram sel pada suhu 37 ◦C selama 90 min dalam inkubator dilengkapi dengan kunci udara dan terus digas dengan 95 peratus N2/5 peratus CO2. Medium inkubasi (larutan Hanks terbuffer tanpa glukosa: 5.26 mM KCl, 0.43 mM KH2PO4, 132.4 mM NaCl, 4.09 mM NaHCO3, 0.33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2, dan 20 mM 7 HEPES gas sebelumnya adalah 9 peratus pH N7.4. /5 peratus CO2 selama 30 min. Di bawah keadaan ini, kepekatan oksigen dalam medium inkubasi adalah 6.7 ± 0.5 µM seperti yang diukur dengan elektrod oksigen jenis Clark [56,57].

Apabila ditunjukkan, neuron terdedah kepada prakondisi iskemia (IPC; OGD pendek selama 20 minit diikuti dengan 2 jam reoksigenasi) sebelum iskemia berpanjangan berikutnya (OGD, 90 min) dan 4 jam reoksigenasi (IPC ditambah OGD/R) (Rajah S1B ). Secara selari, neuron diinkubasi dalam normoxia (Nx) pada 37 ◦C dalam suasana lembap sebanyak 95 peratus udara/5 peratus CO2 atau prakondisi iskemia (IPC). Apabila ditunjukkan, neuron diinkubasi 30 minit sebelum IPC dalam larutan Hanks buffered (pH 7.4), jika tiada atau kehadiran wortmannin (100 nmol/L), seperti yang diterangkan sebelum ini [19].

4.3. Transfeksi Sel

Sel Neuron (8 DIV) atau HEK-293T telah ditransfeksi dengan vektor plasmid yang menyatakan Mdm2 berteg YFP daripada penganjur manusia MDM2. MDM2p/Mdm2-YFP ialah hadiah daripada Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plasmid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Apabila diperlukan, vektor kosong (pYFP) digunakan sebagai kawalan dalam keadaan yang sama. Transfeksi plasmid dilakukan menggunakan Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), mengikut arahan pengilang. Sel telah ditransfeksi dengan 1.5 µg/µL vektor plasmid dan digunakan selepas 24 jam.

Ketukan AKT dalam 6 neuron DIV dicapai dengan pemindahan dengan ribonukleotida bertali dua (siRNA) kecil yang mengganggu. Urutan yang disasarkan adalah seperti berikut: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (tikus, s62216, sepadan dengan nukleotida 1006–1025, nombor kesertaan GenBank NM_009652) [5_009652) Sebagai kawalan negatif, kami menggunakan Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Semua siRNA dibeli daripada Ambion®, Invitrogen®, dan Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Jerman). Mengikut tahap ketukan protein, kecekapan pemindahan siRNA dianggarkan 70-80 peratus pada 3 hari selepas pemindahan. Untuk eksperimen menyenyapkan, neuron telah ditransfeksi dengan siRNA (10 nM) menggunakan Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), mengikut arahan pengeluar. Neuron diinkubasi lagi dalam medium Neurobasal selama 72 jam sebelum digunakan.

4.4. Pengesanan Sitometri Aliran Kematian Sel Apoptotik

Neuron ditanggalkan dengan teliti daripada plat menggunakan garam tetrasodium EDTA 1 mM dalam PBS (pH 7.4) dan diwarnai dengan annexin V/APC dan 7-AAD, dilakukan betul-betul seperti yang diterangkan sebelum ini [55].

4.5. Caspase-3 Activity Assay

Aktiviti Caspase-3 dinilai dalam lisat sel [33] dan mengikut arahan pengilang menggunakan kit Fluorimetric Assay CASP3F daripada SIGMA dan dibaca pada pelepasan pada panjang gelombang 405 nm. Kaedah ini adalah berdasarkan pembebasan bahagian 7-amino4-metil kumarin (AMC) pendarfluor. Kepekatan AMC dikira menggunakan piawaian AMC.

4.6. Immunoblots dan Ujian Co-Imunoprecipitation

Neuron telah dilisekan dalam penimbal yang mengandungi 1 peratus SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12.5 mM Na2HPO4 dan 1 peratus Triton X-100 (NP40: 1 peratus NP40, EDTA diK tambah 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM, dan 10 peratus gliserol) ditambah dengan perencat fosfatase (1 mM Na3VO4 dan 50 mM NaF) dan perencat protease (100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 µg/mL anti-papain, 50 µpstatg, 50 µpstatg µg/mL amastatin, 50 µg/mL leupeptin, 50 µg/mL bestatin, dan 50 µg/mL perencat trypsin kacang soya), disimpan di atas ais selama 30 minit dan direbus selama 5 minit. Aliquots ekstrak terlised telah tertakluk kepada gel poliakrilamida SDS (MiniProtean®, Bio-Rad) dan dipadamkan dengan antibodi semalaman pada suhu 4◦C. Antibodi yang digunakan ialah anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-cleaved caspase-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; juga mengesan YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Jerman) dan antiGAPDH (Ambion, Cambridge, UK) semalaman pada 4 ◦C. Selepas inkubasi dengan IgG anti-arnab (Pierce, Thermo Scientific) kambing peroksidase-konjugasi lobak pedas atau IgG anti-tikus kambing (Bio-Rad), membran segera diinkubasi dengan chemiluminescence SuperSignal West Dura (Pierce) yang dipertingkatkan selama 5 minit sebelum terdedah kepada Kodak Filem XAR-5 selama 1 hingga 5 minit dan autoradiogram telah diimbas. Keamatan jalur dikira menggunakan perisian ImageJ 1.48v, seperti yang diterangkan sebelum ini [60].

Untuk ujian co-imunoprecipitation, neuron dilisiskan dalam penimbal ais sejuk yang mengandungi 50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 peratus NP-40) ​​ditambah dengan perencat fosfatase yang diterangkan di atas. Selepas membersihkan serpihan dengan sentrifugasi, lisat neuron (100 mg) diinkubasi dengan 1 mg antibodi selama 24 jam pada 4 ◦C diikuti dengan penambahan 10 mL protein A-agarose (GE Healthcare Life Sciences) selama 2 jam pada 4 ◦C. Immunoprecipitates telah dibasuh secara meluas dengan penimbal lisis dan diselesaikan oleh SDS-PAGE dan imunoblot dengan antibodi yang ditunjukkan [61]. Kelimpahan protein relatif ditunjukkan dalam Rajah S1. Tompok penuh dan imbasan gel disertakan dalam Rajah S3.

4.7. Imunositokimia dan Analisis Imej

Neuron ditanam pada penutup kaca dan dibetulkan dengan 4 peratus (w/v, dalam PBS) paraformaldehid selama 30 minit dan diimunostained dengan arnab anti-phosphoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), tetikus anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti-MAP2 tetikus (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], anti-p53 tetikus (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) dan anti-GFP (1:1000; ab290; juga disahkan untuk mengesan YFP). Imunolabeling dikesan menggunakan antibodi sekunder anti-arnab IgG–Cy3 atau anti-tikus IgG–Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Nukleus telah diwarnai dengan 40,6-diamidino-2 phenylindole (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Coverslip dicuci, dipasang dalam reagen antiludar cahaya SlowFade (Invitrogen) pada slaid kaca, dan diperiksa menggunakan mikroskop (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, USA) dilengkapi dengan objektif 40×, penerang gentian pra-pusat Nikon Intensilight C-HGFI, dan kamera digital peranti berganding cas hitam putih Hamamatsu ORCAER atau mikroskop confocal laser pengimbasan ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Jepun) dengan tiga laser 405, 491, dan 561 nm, dilengkapi dengan objektif rendaman minyak PL Apo 40×, 63× dan 100× untuk pengimejan resolusi tinggi dan kamera digital peranti Evolve Photometrics.

Semua tetapan mikroskop ditetapkan untuk mengumpul imej pendarfluor di bawah ketepuan dan disimpan malar untuk semua imej yang diambil dalam eksperimen. Imej telah dianalisis dengan perisian ImageJ 1.48v (Institut Kesihatan Negara). Peratusan p(Ser473)AKT plus dan p53 plus neuron dan kuantifikasi keamatan pendarfluor protein maksimum p(Ser473)AKT dan p53 ditunjukkan dalam Rajah S2A. Dalam MDM2-neuron yang ditransfeksi GFP, taburan nukleositoplasma MDM2-GFP dikira sebagai nisbah pendarfluor min nuklear kepada min pendarfluor sitoplasma MDM2 endogen, diukur dalam 24 neuron (enam neuron setiap keadaan dalam empat kultur neuron yang berbeza) (Rajah S2B) [62].

Untuk mengukur intensiti pendarfluor nuklear maksimum pewarnaan MDM2 endogen dan pSer473AKT, 40 neuron (10 neuron setiap keadaan dalam empat budaya berbeza) diukur (Rajah S2C), seperti yang diterangkan sebelum ini [44]. Dalam profil keamatan keratan rentas wakil yang ditunjukkan dalam Rajah 5B, peratusan p(Ser473)AKT dan MDM2 yang ditunjukkan di bawah setiap keadaan dikira sebagai pendarfluor min nuklear. Dalam semua kes, nukleus dikenal pasti dengan pewarnaan DAPI. Keamatan pendarfluor MDM2 nuklear maksimum dalam neuron yang dirawat dengan wortmannin atau siAkt ditunjukkan dalam Rajah S2D.

4.8. Analisis statistik

Keputusan eksperimen dinilai dengan analisis varians sehala, diikuti dengan ujian post hoc Bonferroni, digunakan untuk membandingkan nilai antara berbilang kumpulan. Keputusan dinyatakan sebagai min ± SEM. Ujian-t pelajar digunakan untuk perbandingan antara dua kumpulan nilai. Dalam semua kes, p < 0.05 dianggap penting (* p < 0.05 berbanding Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Bagaimanakah Cistanche melindungi neuron?

Terdapat beberapa bukti yang menunjukkan bahawa Cistanche boleh melindungi neuron dengan mengurangkan apoptosis (kematian sel yang diprogramkan) dan menggalakkan kemandirian neuron. Apoptosis adalah proses semula jadi yang berlaku di dalam badan untuk membuang sel yang rosak atau tidak diingini, tetapi ia boleh memudaratkan apabila ia berlaku secara berlebihan atau tidak sesuai. Cistanche didapati menghalang apoptosis dalam kajian makmal, dan kesan ini boleh membantu melindungi neuron daripada kerosakan.

Selain itu, Cistanche mengandungi beberapa sebatian bioaktif yang telah terbukti mempunyai kesan neuroprotektif. Sebagai contoh, ia mengandungi echinacoside, yang telah ditunjukkan untuk melindungi neuron daripada tekanan oksidatif dan keradangan. Ia juga mengandungi acteoside, yang telah didapati mempunyai sifat anti-radang dan antioksidan.

Rujukan

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Kesan kelewatan rawatan, umur, dan keterukan strok pada kesan trombolisis intravena dengan alteplase untuk strok iskemia akut: Meta-analisis data pesakit individu daripada ujian rawak. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Serangan iskemia sementara sebelum ini mungkin mempunyai kesan neuroprotektif pada pesakit dengan strok iskemia. Gerbang. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. Toleransi Iskemia Neuronal Dikondisikan oleh Polimorfisme Tp53 Arg72Pro. Terjemahan Stroke Re. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Penyelidikan strok di persimpangan: Meminta arah otak. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. Gamma reseptor diaktifkan proliferator peroksisom mengambil bahagian dalam pemerolehan toleransi iskemia otak yang disebabkan oleh prakondisi iskemia melalui pengangkut glial glutamat 1 in vivo dan in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Memfokuskan Semula Otak: Pendekatan Baru dalam Neuroprotection terhadap Kecederaan Iskemia. Neurokim. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Kesan prasyarat iskemia pada tindak balas genom kepada iskemia serebrum: Persamaan dengan strategi neuroprotektif dalam keadaan hibernasi dan hipoksia-toleran. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Cerebral prakondisi dan toleransi iskemia. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Kebocoran, R.; Gan, Y.; Bibir.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Prasyarat menyediakan perlindungan saraf dalam model penyakit CNS: Paradigma dan kepentingan klinikal. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarker untuk Prasyarat Iskemia: Mencari Responder. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulasi Faktor Kawal Selia Masuk Kalsium (SARAF) yang dikendalikan oleh Stor Cerebral dan Orai1 Persisian Mengikuti Iskemia Serebrum Fokus dan Prasyarat dalam Tikus. Neurosains 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novel Mekanisme Selular untuk Neuroprotection dalam Prasyarat Iskemia: Pandangan dari Organel Dalam. Depan. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Toleransi iskemia akibat prakondisi: Tingkap kepada penggearan endogen untuk perlindungan serebro. Exp. Terjemahan Strok Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Mekanisme Apoptotik selepas Iskemia Serebrum. Strok 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide-3-Laluan Isyarat Survival Kinase/Akt Terlibat dalam Kemandirian Neuronal Selepas Strok. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Peraturan apoptosis dalam penumbra selepas strok iskemia: Ungkapan protein pro dan antiapoptosis. Apoptosis 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt ialah sasaran molekul untuk terapi transduksi isyarat dalam penghinaan iskemia otak. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Peranan Akt (protein kinase B) dan protein kinase C dalam kecederaan iskemia-reperfusi. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP Perencatan PTEN oleh peroxynitrite mengaktifkan laluan isyarat neuroprotektif phosphoinositide-3-kinase/Akt. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. Isyarat AKT/PKB: Menavigasi Rangkaian. Sel 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Peranan Khusus Bentuk Akt iso dalam Apoptosis dan Peraturan Pertumbuhan Akson dalam Neuron. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Isoform Akt hadir di lokasi subselular yang berbeza. Am. J. Physiol. Fisiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Prasyarat iskemia awal memerlukan pengaktifan eNOS yang dimediasi Akt dan PKA melalui fosforilasi serine1176. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Sikat, M.; Liu, C.-L.; Martone, SAYA; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Peristiwa Menggalakkan Kelangsungan Hidup dan Kematian selepas Iskemia Serebrum Sementara: Fosforilasi Akt, Pembebasan Cytochrome C, dan Pengaktifan Protease Seperti Caspase. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorullah, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Prasyarat dalam perlindungan saraf: Daripada hipoksia kepada iskemia. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB A phosphatidylinositol 3-laluan kinase/Akt menggalakkan translokasi Mdm2 daripada sitoplasma ke nukleus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforilasi HDM2 oleh Akt. Onkogen 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu mendorong p53 ubiquitination melalui fosforilasi MDM2 pengantara Akt. Nat. Biol Sel. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2 Kompleks Menyertai MDM2-Mediated p53 Degradasi. Mol. Sel 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Peraturan Berbeza Kelangsungan Hidup Kardiomiosit dan Hipertrofi oleh MDM2, E3 Ubiquitin Ligase. J. Biol. Kimia. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Prasyarat Iskemia melindungi dengan mengaktifkan kinase prosurvival pada reperfusi. Am. J. Physiol. Circ. Fisiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 down-regulation: Mekanisme molekul baru yang terlibat dalam prakondisi iskemia. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. Laluan MDM2-p53 terlibat dalam toleransi neuron akibat prasyarat kepada iskemia. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G dalam Promoter MDM2 Menentukan Hasil Fungsian Selepas Strok. Strok 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Pengenalpastian PKB/Akt Hidrofobik Motif Ser-473 Kinase sebagai Kinase Protein yang bergantung kepada DNA. J. Biol. Kimia. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Excitotoxicity dan strok: Mengenal pasti sasaran baru untuk neuroprotection. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; Pengikat, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Peranan Phosphatidylinositol-3 Laluan Kinase dalam Prasyarat NMDA: Mekanisme Berbeza untuk Kejang dan Degenerasi Neuron Hippocampal yang Disebabkan oleh Asid Quinolinic. Neurotoks. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Isoforms Melindungi Secara Berbeza daripada StrokInduced Neuronal Cedera dengan Mengawal Aktiviti mTOR. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Dos prasyarat NMDA menggalakkan perlindungan saraf dengan meningkatkan keceriaan neuron. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, Toleransi Iskemia DW dalam Kultur Sel Kortikal Murine: Peranan Kritikal untuk Reseptor NMDA. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Peranan Berbeza Subjenis Reseptor NMDA dalam Kematian Sel Neuron Iskemia dan Toleransi Iskemia. Strok 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sanchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Polimorfisme Tp53 Arg72Pro manusia menerangkan prognosis fungsi yang berbeza dalam strok. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic Astrocyte-Derived Neurotrophic Factor (MANF) Melindungi Terhadap Apoptosis Neuronal melalui Pengaktifan Laluan Isyarat Akt/MDM2/p53 dalam Model Tikus Pendarahan Intracerebral. Depan. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuklear WRAP53 menggalakkan kelangsungan hidup neuron dan pemulihan fungsi selepas strok. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; et al. Menyasarkan PFKFB3 mengurangkan kecederaan iskemia-reperfusi serebrum pada tikus. Sci. Rep. 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, PERGI; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallate mendorong apoptosis dan penangkapan kitaran sel G2 melalui laluan Akt/MDM2/p53 dalam sel A2780/CP70 kanser ovari yang tahan cisplatin. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Ye, X. LXR-623-panjang bukan pengekodan RNA LINC01125 menyekat pembiakan sel kanser payudara melalui laluan isyarat PTEN/AKT/p53. Kematian Sel Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin melemahkan defisit lokomotor dan kognitif serta kecederaan neuron hippocampal melalui laluan isyarat PI3K/Akt1/GSK-3 dalam model in vivo iskemia serebrum. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Perubahan Akt1 (PKB ) dan p70S6K dalam Iskemia Fokus Sementara. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1, dan NCX3: Dua pengesan baharu prakondisi tertunda dalam iskemia otak. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Peraturan Kestabilan MDM2 selepas Kerosakan DNA. J. Sel. Fisiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Pengenalpastian dan pencirian berbilang protein mdm-2 dan kompleks protein mdm-2-p53. Onkogen 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Enhanced Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt Signaling Mempunyai Sasaran Pleiotropik dalam Neuron Hippocampal Terdedah kepada Tekanan Oksidatif akibat Besi. J. Biol. Kimia. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Pemerdagangan p53 mitokondria-nuklear mengawal kerentanan neuron dalam strok. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC / C-Cdh1 menyelaraskan neurogenesis dan saiz kortikal semasa pembangunan. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC Peranan Reseptor NMDA dalam Pembangunan Rintangan Otak melalui Pra dan Selepas Pengkondisian. Penuaan Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Oksigen dan kekurangan glukosa mendorong disfungsi mitokondria dan tekanan oksidatif dalam neuron tetapi tidak dalam astrosit dalam budaya primer. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dinamik gelung maklum balas p53-Mdm2 dalam sel individu. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP memacu permulaan tumor payudara, perkembangan, dan metastasis pada tikus dan merupakan sasaran terapeutik yang berpotensi. J. Clin. Menyiasat. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 memfosforilasi Cdh1 dan memodulasi kestabilan cyclin B1 dalam excitotoxicity. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Peraturan Interaksi Sintase Bcl-xL-ATP oleh Mitokondria Cyclin B1-Kinase Bergantung Siklin-1 Menentukan Kemandirian Neuron. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Laluan Rock2 mengawal integriti dan ingatan dendritik. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]