ABSTRAK

latar belakang:Bis resorcinol telah diasingkan sebagai konstituen utama batang terminal Heliciopsis (Proteaceae). Baru-baru ini, resorcinol digunakan sebagai agen pemutih aktif dalam pelbagai produk kosmetik. Oleh kerana peniruan struktur resorcinol, manfaat bis resorcinol sebagai antagonis enzim penuaan telah ditunjukkan dalam kajian ini.

Menurut kajian yang berkaitan, cistanche adalah herba biasa yang dikenali sebagai "herba ajaib yang memanjangkan hayat". Komponen utamanya ialah cistanoside, yang mempunyai pelbagai kesan seperti antioksidan, anti-radang, dan promosi fungsi imun. Mekanisme antara cistanche dan pemutihan kulit terletak pada kesan antioksidan glikosida cistanche. Melanin dalam kulit manusia dihasilkan oleh pengoksidaan tirosin yang dimangkin oleh tyrosinase, dan tindak balas pengoksidaan memerlukan penyertaan oksigen, jadi radikal bebas oksigen dalam badan menjadi faktor penting yang mempengaruhi pengeluaran melanin. Cistanche mengandungi cistanoside, yang merupakan antioksidan dan boleh mengurangkan penjanaan radikal bebas dalam badan, sekali gus menghalang pengeluaran melanin.

Klik pada Cistanche Tubulosa untuk Pemutihan

Untuk maklumat lanjut:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Kaedah:Bis resorcinol telah ditulenkan daripada ekstrak etanol mentah batang terminal H. melalui pengekstrakan pelarut dan kromatografi persediaan, masing-masing. Aktiviti perencatan pada kolagenase, elastase, dan tyrosinase kompaun telah disiasat dengan menggunakan teknik spektroskopi yang berbeza. Docking molekul telah dijalankan untuk meramalkan kemungkinan interaksi bahan di sekeliling tapak aktif enzim.

Keputusan:Nilai IC50 pada kolagenase bis resorcinol dan asid kafeik ialah 156.7 ± 0.7 dan 308.9 ± 1.6 µmol L−1. Untuk aktiviti elastase, IC50 sebanyak 33.2 ± 0.5 dan 34.3 ± 0.3 µmol L−1 masing-masing ditentukan untuk bis resorcinol dan asid ursolik. Bis resorcinol telah menghalang tyrosinase dengan mempamerkan IC50 22.8 μmol L−1, dan 78.4 μmol L−1 hadir untuk -arbutin. Bis resorcinol terikat kepada kolagenase, elastase, dan tyrosinase dengan tenaga pengikat masing-masing −5.89, −5.69, dan −6.57 kcal mol−1. Tenaga pengikat ini berada dalam julat yang sama seperti perencat yang diuji. Kumpulan fenol aromatik dalam struktur bertanggungjawab untuk prinsip serta menyokong interaksi mengikat dengan enzim. Pengikatan hidrogen disebabkan oleh kumpulan hidroksil dan daya tarikan yang berkaitan dengan π daripada cincin aromatik memberikan kepelbagaian pengikatan kepada bis resorcinol.

Kesimpulan:Bis resorcinol yang disucikan daripada terminal H. mungkin berguna untuk dimasukkan ke dalam produk kosmetik sebagai antagonis enzim penuaan.

Mata pelajaran Biokimia, Bioinformatik, Biologi Sel, Dermatologi, Perlombongan Data dan Pembelajaran Mesin

Kata kunciTerminal heliciopsis, Bisresorcinol, Collagenase, Elastase, Tyrosinase, Sifat anti-penuaan, Docking molekul, Perencatan enzim

PENGENALAN

A bis resorcinol, (8′Z)-3,5-dihidroksi-1-[16′-(3″, 5″-dihidroksi fenil)-8′-heksadesen{{ 11}}′-yl] benzena, telah diasingkan sebagai juzuk yang banyak daripada batang terminal Heliciopsis (Kurz) Sleumer, yang merupakan tumbuhan keluarga Proteaceae dan telah digunakan oleh etnik di Vietnam untuk kesan hepatoprotektif. Sehingga kini, faedah perubatan sebatian ini sebagai agen anti-radang, perencatan pengeluaran malondialdehid (MDA) dan perlindungan hepatoproteksi telah dijelaskan secara in vitro dan in vivo (Giang et al., 2019). Ia adalah jelas bahawa molekul bis resorcinol mengandungi dua molekul resorcinol (EC No 203-585-2), terikat bersama dengan meta-C7H14C=CC7H14 pautan (Rajah 1A). Resorcinol baru-baru ini digunakan dalam bentuk serum pekat muka untuk terapi putih. Berdasarkan Jawatankuasa Saintifik mengenai Keselamatan Pengguna, Brussels, Belgium (SCCS 1270/09, Suruhanjaya Eropah, Jawatankuasa Saintifik mengenai Keselamatan Pengguna, 2010), resorcinol telah dikawal selia sebagai oksidan dalam produk yang bertujuan untuk mewarnakan bulu mata pada julat kepekatan sehingga 1.25 peratus , atau dalam losyen rambut dan syampu pada julat kepekatan sehingga 0.5 peratus . Oleh itu, aplikasi kosmetik resorcinol adalah pelbagai. Untuk agen pemutihan, perencatan sintesis melanin oleh melanosit yang berada dalam lapisan sel basal epidermis telah diandaikan. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) ialah enzim utama untuk memangkinkan melanogenesis di mana L-tirosin digunakan sebagai substrat. Walaupun melanin membantu melindungi kulit daripada kerosakan akibat sinaran UV, pengeluaran melanin yang berlebihan boleh menyebabkan hiperpigmentasi, jeragat dan bintik-bintik penuaan. Sebagai tambahan kepada resorcinol, pelbagai sebatian sintetik dan semula jadi dengan struktur kimia yang berbeza telah ditunjukkan untuk mempamerkan aktiviti anti-tirosinase (Dobos et al., 2015).

Sinaran UV adalah faktor luaran utama yang menyebabkan penuaan kulit. Sebaliknya, kulit boleh menua dari semasa ke semasa oleh spesies oksigen reaktif (ROS) dan lipid peroksida yang dihasilkan secara dalaman selepas pendedahan UV. Produk sekunder daripada metabolisme lipid peroksida boleh merosakkan elastin dan gentian kolagen matriks ekstraselular (ECM). Oleh itu, pendedahan kepada sinaran UV boleh mengakibatkan dehidrasi, kehilangan keanjalan, serta kedutan pada kulit. Untuk pengetahuan kami, ECM diubahsuai secara berkala untuk mengekalkan struktur tisu normal seiring dengan protein tisu yang telah tamat tempoh didegradasi dengan betul oleh metalloproteinase matriks, seperti kolagenase, dan protease serin seperti elastase (Thring, Hili & Naughton, 2009). Di samping itu, kedua-dua kuantiti dan aktiviti enzim penuaan telah ditingkatkan oleh tekanan oksidatif, yang membawa kepada degradasi ECM yang meluas dan penuaan progresif (Sherratt et al., 2019). Oleh itu, sebatian yang boleh membentuk kompleks dengan ion logam dijangka akan menghalang kolagenase, elastase, dan tyrosinase dengan sewajarnya (Selvaraj et al., 2014). Projek ini bertujuan untuk menentukan kesan biologi bis resorcinol pada tyrosinase, kolagenase, dan elastase in vitro, dan teknik dok telah dijalankan untuk menjelaskan interaksi mereka pada tahap molekul. Ia diharapkan dapat melambatkan proses penuaan dan memperbaiki penampilan kulit dengan bis resorcinol.

BAHAN & KAEDAH

Bahan kimia dan instrumen

Pemurnian kompaun, pengenalpastian dan pengesahan

Ekstrak mentah dalam etanol batang terminal H. banyak diperolehi daripada Profesor PM Giang, Fakulti Kimia, Universiti Kebangsaan Vietnam, Hanoi, Vietnam dengan nombor spesimen baucar HNIP-18473. Kemudian, ia dibahagikan dalam metanol/n-heksana sebanyak tiga kali berulang. Lapisan metanol telah disejat sehingga hampir kering dan kemudiannya dibahagikan dalam etil asetat/1-butana. Lapisan etil asetat telah diwap sehingga isipadunya berkurangan sebanyak 80 peratus . Cecair likat yang terhasil kemudiannya ditulenkan pada lajur gel silika menggunakan elusi kecerunan kloroform/metanol seperti berikut: 100 peratus kloroform, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2, dan 2:1 kloroform/metanol, dan 100 peratus metanol, masing-masing. Eluen daripada pelarut campuran 5:1 telah dikumpulkan dan disejatkan kepada satu perempat isipadu, diikuti dengan pengasingan pada lajur ODS menggunakan elusi kecerunan metanol dan aseton. Kompaun yang dikehendaki, iaitu bis resorcinol (Rajah 1), diperoleh daripada eluen yang mengandungi 70 peratus aseton dan disahkan oleh spektroskopi MS, NMR, dan IR berkenaan data perpustakaan instrumental. Kromatografi lapisan nipis digunakan untuk menganggarkan ketulenannya.

Ujian aktiviti biologi

Secara in vitro, eksperimen yang terdiri daripada ujian perencatan enzim pada kolagenase, elastase, dan tyrosinase untuk bis resorcinol dan perencat yang diketahui telah dijalankan seperti berikut.

Perencatan kolagenase

Ujian anti-kolagenase baru-baru ini telah diubah suai daripada yang diterangkan sebelum ini oleh Widyowati et al. (2016). Secara ringkasnya, penimbal tricine 50 mmol L−1 pH 7.5 ditambah dengan 400 mmol L−1 NaCl dan 10 mmol L−1 CaCl2 digunakan sebagai pencair penimbal. Kolagenase daripada Clostridium histolyticum (EC.3.4.24.3) telah dilarutkan dalam penimbal kepada kepekatan 1 mg L−1. Substrat enzim, MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2, telah dilarutkan sebelum ini dalam DMSO dan kemudiannya dicairkan dalam penampan kepada kepekatan 1 mmol L−1. Sampel yang dilarutkan dalam DMSO dicairkan kepada kepekatan yang berbeza dengan menggunakan penimbal. Larutan sampel 2-µl diinkubasi dengan larutan enzim 100 µl pada suhu 37 ○C selama 10 minit. Kemudian, substrat 50-µl telah ditambah dan dicampur dengan teliti. Pancaran pendarfluor (F) pada 405 nm direkodkan serta-merta dan dipantau secara berterusan selama 30 minit menggunakan panjang gelombang 320 nm untuk pengujaan. Asid kafeik digunakan sebagai kawalan kedudukan (Rajah 1). Kawalan negatif dilakukan dengan air. Perencatan peratus ( peratus ) dikira daripada persamaan di bawah:

peratus Perencatan {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

Perencatan elastase

Ujian mengikut Abhijit & Manjushree (2010) telah digunakan dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkasnya, sistem penimbal ialah 0.2 mM Tris-HCl penimbal (pH 8.0). Larutan 1 µg mL−1 elastase pankreas babi (EC.3.4.21.36) telah disediakan dalam air steril. Substrat enzim, N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA), telah dibubarkan dalam penampan kepada kepekatan 80 mmol L−1. Sampel yang dilarutkan dalam DMSO dicairkan kepada pelbagai kepekatan dengan menggunakan penimbal. Larutan sampel 100-µl dicampur dengan larutan enzim 50 µl dan diinkubasi selama 15 minit. Selepas itu 50 µl larutan enzim-substrat ditambah dan dicampur dengan teliti. OD410 diukur serta-merta (0 min) dan selepas pengeraman semalaman (o/n) pada 37 darjah dengan menggunakan pembaca plat mikro. Asid ursolik digunakan sebagai kawalan positif (Rajah 1), dan air digunakan sebagai kawalan negatif. Peratusan perencatan ( peratus ) dikira dengan persamaan berikut:

peratus Perencatan {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

Perencatan tyrosinase

Ujian perencatan tyrosinase yang digunakan telah disesuaikan daripada kaedah yang diterangkan sebelum ini (Jiratchayamaethasakul et al., 2020). Secara ringkasnya, ujian telah dijalankan dalam 0.05 mol L−1 penimbal fosfat pH 6.8. Tirosinase cendawan (EC.1.14.18.1) telah dilarutkan dalam penimbal kepada kepekatan 100 unit mL−1. L-tirosin, substrat enzim, telah disediakan pada kepekatan 0.25 mg mL−1 dalam penimbal. Sebatian ujian yang dilarutkan dalam DMSO telah dicairkan kepada kepekatan antara 0.625 dan 10 mg mL−1. Ke dalam perigi 96-plat perigi, sampel 10 µl dan 40 µl L-tirosin larutan dicampur dan diinkubasi selama 10 minit pada suhu bilik. Selepas itu 50 µl larutan enzim disuntik dan dicampur sebati. Tindak balas dihentikan selepas itu dengan mengeram pada ais selama 1 minit. OD475 diukur menggunakan pembaca plat mikro. -Arbutin dan air digunakan sebagai kawalan positif (Rajah 1) dan rakan sejawatan negatif, masing-masing. Peratusan perencatan ( peratus ) dikira dengan persamaan seperti berikut:

KAJIAN DOK MOLEKUL

Penyediaan ligan dan reseptor

Struktur tiga dimensi (3D) bis resorcinol (CID 8917124) dan sebatian rujukan, termasuk substrat dan perencat, telah dimuat turun daripada pangkalan data PubChem untuk kajian dok molekul. Struktur ligan telah disediakan dalam fail format Protein Data Bank (PDB) menggunakan Penterjemah SMILES Dalam Talian dan Penjana Fail Struktur. Struktur kristal enzim, seperti kolagenase (PDB ID 2Y6I), elastase (PDB ID 1BRU), dan tyrosinase (PDB ID 2Y9X) diperoleh daripada pangkalan data protein RCSB. Air dan molekul yang melekat telah dibedah daripada semua struktur protein terpilih. Sementara itu, atom hidrogen polar telah ditambahkan pada struktur protein terhablur oleh AutoDockTools 1.5.6. Fail protein sasaran dan sebatian terpakai lain disimpan dalam format PDBQT sebelum melakukan dok molekul.

Pemilihan sisa tapak aktif dan dok molekul

Protokol grid dan dok ramalan tapak aktif disediakan menggunakan AutoDockTools 1.5.6. Tapak grid telah ditetapkan dengan jarak 0.375 Å. Dimensi xyz ditetapkan kepada 126-135-160 Å3 untuk kolagenase, 130-120-126 Å3 untuk elastase dan 80-80-80 Å3 untuk tyrosinase. Pusat kotak grid (dengan nilai offset dalam AutoDockTools) ialah 31.869 (5.000), −19.41 (−25.{{20}}), dan 17.815 untuk kolagenase , 30.048 (−0.972), 51.253 (−2.722), 17.6 untuk elastase dan −8.407 (−1.000), −23.795 (−0.250), −0.93 (−0.250), −0.250 ) untuk tyrosinase, masing-masing. Struktur protein digunakan sebagai entiti tegar manakala sebatian ligan ditetapkan sebagai molekul fleksibel. Kajian dok dilakukan menggunakan algoritma genetik Lamarckian (GA) yang dilaksanakan oleh AutoDock4 versi 4.2. Bilangan larian GA ialah 50 dengan saiz popular 200. Tenaga pengikat (ΔGbind) dianalisis oleh ADT. Interaksi telah divisualisasikan menggunakan BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). Interaksi molekul antara sebatian dan reseptor protein dianalisis dan divisualisasikan menggunakan perisian BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). Struktur sebatian tapak pengikat protein telah divisualisasikan menggunakan pakej Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey, Dalke & Schulten, 1996).

Analisis statistik

KEPUTUSAN

Satu juzuk utama telah berjaya ditulenkan daripada batang terminal H. dengan menggunakan teknik pengekstrakan pelarut dan fasa terbalik HPLC, masing-masing. Spektrum 1 H-NMR dan 13C-NMR yang diperoleh telah dibandingkan dengan bahan rujukan melalui SciFinder (https://scififinder.cas.org/) dan didapati sepadan dengan (8′Z)-1,{ {6}}dihidroksi-5- [16′-(3″,5″-dihyroxyphenyl)-8′-heksadesen-1′-yl] benzena (Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02). Ia dikelaskan sebagai salah satu bisresorcinol. Bis resorcinol terbaru ini mempunyai formula molekul C28H40O4 dengan berat molekul 463.2819 Dalton. Hasil pengekstrakan dikira 0.086 peratus, berdasarkan berat kering batang. Ketulenannya adalah lebih daripada 98 peratus, berkenaan dengan spektrum 1 H dan 13C-NMR yang diperoleh (lihat Rajah S1 dan S2).

Analisis bioaktiviti in vitro

Kesan antagonis bisresorcinol pada enzim penuaan, seperti kolagenase, elastase, dan tyrosinase ditentukan secara in vitro dengan menggunakan kaedah spektroskopi yang berbeza. Keputusan diringkaskan dalam Jadual 1 dan Rajah 2. Untuk perencatan kolagenase, sampel ujian dalam julat 50–550 µmol L−1 disediakan menggunakan MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 sebagai enzim-substrat dan asid kafeik sebagai perencat enzim. Telah ditunjukkan bahawa bisresorcinol pada kepekatan 156.7 µmol L−1 menurunkan aktiviti enzim sebanyak 50 peratus (IC50). Sebaliknya, IC50 asid kafeik ialah 308.9 ± 13.7 µmol L−1. Oleh itu, aktiviti anti-kolagenase bisresorcinol adalah lebih kuat daripada asid kafeik.

Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501