Korelasi Positif Antara Meratakan Tiub Buah Pinggang Dan Kecederaan Tiub Buah Pinggang / Fibrosis Interstisial dalam Model Penyakit Buah Pinggang Murine
Mar 17, 2022
ABSTRAK.Bilangan pesakit dengan kronik penyakit buah pinggang(CKD) berkembang secara berterusan di peringkat global. Untuk mengkaji patogenesis dan mekanisme, banyak model haiwan telah dibangunkan, termasuk model spontan, genetik, dan disebabkan. Walaupun setiap jenis CKD menunjukkan perubahan tisu khusus penyakit pada peringkat awal, gangguan tiub dan fibrosis interstisial secara histologi berlaku semasa perkembangan ke peringkat akhirKegagalan buah pinggang. Oleh itu, kuantifikasi gangguan tiub dan fibrosis interstisial dalam penyelidikan CKD menggunakan model haiwan adalah penting untuk mengukur tahap keterukan CKD dan, dengan itu, keberkesanan agen terapeutik. Beberapa strategi telah digunakan untuk mengukur fibrosis interstisial. Antara faktor pemarkahan,Buah pinggangmeratakan tiub boleh dinilai secara kuantitatif dengan mudah dan murah. Walau bagaimanapun, nilai diagnostikBuah pinggangPenilaian meratakan tiub belum disiasat sebelum ini. Oleh itu, dalam kajian ini, kami menyiasat korelasi antaraBuah pinggangfibrosis meratakan tiub dan interstisial atauBuah pinggangpenanda kecederaan tiub. Kami melihat korelasi yang kuat antara tahap kecederaan tiub / fibrosis interstisial danBuah pinggangmeratakan tiub dalam tiga jenis tetikusPenyakit buah pinggangModel. Ini berfaedah kerana teknologi yang berkembang pesat seperti kecerdasan buatan dan pemprosesan imej boleh digunakan dengan mudah; oleh itu, diagnosis yang lebih tepat, objektif, dan kuantitatif harus dilakukan pada masa akan datang.
Kata kunci:fibrosis interstisial, penyakit buah pinggang, meratakan tiub buah pinggang, kecederaan tiub buah pinggang; Kegagalan buah pinggang
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Pesakit dengan kronikpenyakit buah pinggang(CKD) menunjukkan gejala proteinuria atau penurunan yang berpanjangan (lebih daripada tiga bulan) dalam kadar penapisan glomerular [15]. Penyakit ini dikategorikan dalam kumpulan pesakit berisiko tinggi dengan peringkat akhirKegagalan buah pinggang.Bilangan pesakit dengan CKD terus meningkat di seluruh dunia. Apabila CKD berkembang, ia membawa kepada peringkat akhirKegagalan buah pinggang, yang memerlukan rawatan dialitik yang menelan kos yang besar, yang membawa kepada peningkatan perbelanjaan perubatan [14]. Oleh itu, pembangunan penanda baru untuk memantau permulaan dan perkembangan CKD dan penubuhan kaedah rawatan baru sangat diperlukan. Penyebab biasa CKD termasuk diabetes, tekanan darah tinggi, penyakit glomerular, dan faktor risiko CKD yang lain. Walaupun setiap jenis CKD menunjukkan perubahan tisu khusus penyakit pada peringkat awal, gangguan tiub dan fibrosis interstisial secara histologi berlaku semasa perkembangan ke peringkat akhirKegagalan buah pinggang.Buah pinggangfibrosis adalah perubahan tisu yang terutamanya dikaitkan dengan gangguan tiub yang berkaitan dengan CKD dan fibrosis interstisial dan dianggap sebagai sasaran rawatan yang ketara untuk mencegah perkembangan ke peringkat akhirKegagalan buah pinggang[25]. Oleh itu, kuantifikasi gangguan tiub dan fibrosis interstisial dalam penyelidikan CKD menggunakan model haiwan adalah penting untuk mengukur tahap keterukan CKD dan, dengan itu, keberkesanan agen terapeutik. Beberapa strategi telah digunakan untuk mengukur fibrosis interstisial, termasuk pewarnaan merah Sirius atau pewarnaan trikrom Masson untuk mengukur kawasan fibrilasi, pemarkahan gangguan tiub untuk analisis morfologiBuah pinggangtubules, dan pelbagai penanda kecederaan, seperti α-SMA, lipocalin yang berkaitan dengan neutrophil gelatinase (NGAL), L-FABP, dan Kim-1 [6, 7, 9, 10, 16, 23]. Skor gangguan tiub termasuk meratakan, pengembangan, kemerosotan, atrofi, dan kehilangan sempadan berusBuah pinggangtubules [27]. Antara faktor pemarkahan ini,Buah pinggangmeratakan tiub (penurunan ketinggian) boleh dinilai secara kuantitatif dengan mudah dan murah [1-3, 19, 20]. Walau bagaimanapun, nilai diagnostik penilaian meratakan tiub buah pinggang tidak disiasat sebelum ini. Oleh itu, kami menganalisis korelasi antara tahap fibrosis interstisial danBuah pinggangmeratakan tiub dalampenyakit buah pinggang.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
BAHAN DAN KAEDAH
Kenyataan etikaSemua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Presiden Universiti Kitasato, berikutan pertimbangan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Kitasato (ID Kelulusan: No. 19-153,19-154, 19-155). Tikus FVB/NJcl lelaki (FVB) dan BALB/cAJcl (BALB/c) diperolehi daripada CLEA (Tokyo, Jepun). Semua tikus dikekalkan di bawah keadaan bebas patogen tertentu. Mereka diberi akses kepada libitum iklan makanan dan air steril sebelum dan semasa eksperimen.HaiwanModel Tns2nph: Tetikus mutan FVB-Tns2nph (FVB-nph) digunakan sebagai model CKD seperti yang diterangkan dalam [22]. Model Ischemia-reperfusion (IR): Model IR dicipta telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [18]. Tikus berusia lapan minggu (Male FVB) telah dibius oleh penyedutan isoflurane dan buah pinggang kiri yang dikeluarkan, kemudian lapisan otot dan facia ditutup dengan menggunakan jahitan yang boleh diserap. Selepas sepuluh hari pemulihan, tikus telah dibius oleh suntikan intraperitoneal gabungan ubat anestesia seperti yang diterangkan sebelum ini [11], merekaBuah pinggangarteri dan urat dikekalkan dalam keadaan iskemik dengan pengapit arteri (TKS-1-40, BEAR Medic, Ibaraki, Jepun) selama 30 dan 60 minit, masing-masing, kemudian lapisan otot dan facia ditutup dengan menggunakan jahitan yang boleh diserap. Di samping itu, tikus kawalan yang menjalani pembedahan palsu tertakluk kepada pembedahan terbuka tanpa pengapit. Selepas itu, semua tikus telah dibunuh oleh penyedutan overdosis isoflurane (Escain, Pfizer Japan Inc., Tokyo, Jepun) untuk melakukan pengumpulan sampel. TheBuah pinggangtelah dikeluarkan 24 jam selepas replikasi iskemia. Adriamycin (ADR) - model nefropati yang disebabkan oleh Adriamycin: model nefropati: BALB / c tikus berusia lapan minggu ditadbir sama ada ADR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Jepun) (10 mg / kg) atau larutan garam (kumpulan kenderaan) melalui urat ekor untuk menilai merekagangguan buah pingganghistologically pada 14 hari selepas pentadbiran.
HistologiBuah pinggang tikus telah diperbaiki dengan 4% paraformaldehid (PFA) pada 4°C semalaman.Buah pinggangblok dihiris pada 2 μm (untuk pewarnaan Asid Berkala (PAS) dan 4 μm (untuk pewarnaan Merah Picro-Sirius). BagiBuah pinggangpengukuran ketinggian tiub, bahagian korteksBuah pinggangseksyen difoto secara rawak dalam empat pandangan berbeza (×100). Dua penyelidik bebas secara membuta tuli mengukurBuah pinggangketinggian tiub dalam semua pandangan untuk mengira ketinggian min setiap subjek. Bagi subjek dengan ketinggian tiub yang tidak rata, pengukuran dua hingga lima lokasi dipilih setiap tubule untuk mendapatkan nilai min (Rajah 1A). Kira-kira 700 ukuran ketinggian tiub diperolehi setiap subjek menggunakan prosedur yang disebutkan di atas untuk mengira nilai min bagi setiap subjek. Untuk pewarnaan Sirius Red, slaid telah dinyahparaffinized dan berwarna 1 jam dengan Sirius merah dalam asid picric berair tepu dan dibasuh dengan 0.5% asid asetik. Untuk menjaringkan kawasan fibrilasi menggunakan pewarnaan merah Sirius, kawasan sasaran difoto secara rawak dalam lapan pandangan (×100), dan kawasan positif diukur menggunakan ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) untuk mengira kadar penghunian mereka berkenaan dengan jumlah kawasan. Glomeruli yang diwarnai dengan Sirius merah dan saluran darah dikecualikan daripada pengiraan.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN JANGKITAN BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Mengotorkan ImmunokimiaBahagian buah pinggang (5 μm) telah dinyahparaffinisasi dan tertakluk kepada pengambilan semula antigen dalam penampan sitrat, pada 121°C selama 15 minit.Buah pinggangbahagian ditutup dengan 0.3% hidrogen peroksida / methanol selama 20 minit, dan kemudian diinkubasi semalaman pada 4 ° C dengan antibodi anti-NGAL (Abcam, Cambridge, UK). Bahagian dibasuh dengan TBS dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (Histofine SimpleStain MAX PO (Rabbit), Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Jepun) selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas mencuci dengan TBS, bahagian-bahagian itu diinkubasi dengan 3,3′-diaminobenzidine (DAB) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Jepun) dan hematoxylin pada suhu bilik. Untuk menjaringkan gangguan tiub melalui pewarnaan imunokimia menggunakan antibodi anti-NGAL, sampel tisu difoto secara rawak dalam lapan pandangan (×100), dan kawasan pewarnaan DAB diukur menggunakan ImageJ untuk mengira kadar penghunian mereka berkenaan dengan jumlah kawasan.
StatistikData telah dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai. Ujian t pelajar digunakan untuk menguji perbezaan yang signifikan antara dua kumpulan, dan ujian berbilang kumpulan Bonferroni digunakan untuk menguji beberapa kumpulan. Nilai P<0.05 was="" statistically="" significant.="" bonferroni’s="" multigroup="" test="" was="" carried="" out="" using="" graphpad="" prism="" 5="" software="" (mdf,="" tokyo,="">
KEPUTUSAN Seperti yang dinyatakan di atas, kuantifikasi kawasan fibrotik interstisial menggunakan pewarnaan merah Sirius harus menjadi kaedah penilaian standard untuk gangguan tiub pada pesakit denganpenyakit buah pinggangatau dalampenyakit buah pinggangModel. Oleh itu, untuk mengukur gangguan tiub dan fibrosis interstisial menggunakan model CKD murine haiwan, kami menggunakan tetikus mutan FVB-Tns2nph (FVB-nph), yang merupakan model haiwan CKD yang mempamerkan banyak gejala CKD manusia yang berkembang secara beransur-ansur dalam tempoh yang panjang, termasuk permulaan genetik glomerulosklerosis sejak lahir, fibrillisasi tubulointerstitium,Buah pingganganemia, danKegagalan buah pinggang[17, 21, 22]. Tetikus FVB-nph menghasilkan semula gejala biasa yang diperhatikan dalam perkembangan CKD manusia. Dalam kajian ini, kami memperkenalkan mutasi nph ke dalam garis FVB yang terdedah kepada nefropati. Kumpulan FVB-nph menunjukkan lebih banyak meratakan tiub daripada kumpulan WT, berdasarkan kemerosotan fibrilasi interstitium diBuah pinggangtubules (Gamb. 1B–D). Analisis regresi linear menunjukkan korelasi bertentangan yang ketara antara ketinggian tiub dan tahap fibrosis interstisial (R2=0.7086: P=0.0023) (Gamb. 1E).
Rajah 1. (A) Pengukuran ketinggian sel epitel tiub. Bar merah menunjukkan ketinggian tubule. (B) Imej perwakilan yang mengotorkan Asid Berkala (PAS) dan imej Sirius Bernoda merah dari bahagian buah pinggang FVB-Tns2WT (FVB-WT) (panel kiri) dan tetikus mutan FVB-Tns2nph (FVB-nph) (panel kanan). Panel atas mewakili imej bernoda PAS, dan panel bawah mewakili imej Sirius Berwarna Merah. Bar skala: 50 μm. (C) Graf membandingkan ketinggian tiub FVB-WT dan FVB-nph. (D) Graf membandingkan kawasan Fibrosis berbanding jumlah kawasan. Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai; Nilai P dikira oleh ujian t Pelajar. (E) Plot serak dengan regresi linear menunjukkan analisis korelasi antara ketinggian ketinggian tubules dan tahap skor fibrosis. Garis regresi linear menunjukkan korelasi songsang antara ketinggian tiub dan kawasan fibrosis. Pekali korelasi nilai R dan P ditunjukkan. Bulatan hitam menunjukkan kumpulan FVB-WT (n = 5), dan kotak hitam menunjukkan kumpulan FVB-nph (n = 5). **P<0.01,><>
Kecederaan tiub buah pinggang dan ketinggian tiub diukur menggunakan akutkecederaan buah pinggang(AKI) model-iaitu, model IR [5, 12, 18]. Walaupun fibrosis interstisial tidak boleh diperhatikan dalam kebanyakan kes AKI, termasukBuah pinggangGangguan iskemik, ekspresi NGAL meningkat dalam sel tiub buah pinggang [7]. Di samping itu, NGAL diketahui terlibat dalam pembangunan AKI kepada CKD dan telah dicadangkan sebagai faktor penting dalam kedua-duanya. Oleh itu, kami menunjukkan bahawa ungkapan NGAL berkorelasi denganBuah pinggangketinggian tiub menggunakan model IR. Telah dilaporkan bahawa masa iskemia sering ditetapkan pada 20 hingga 60 minit dan kecederaan tiub bertambah buruk dengan peningkatan masa iskemia [4, 5, 12, 18]. Dalam kajian ini, tikus tertakluk kepada iskemia selama 30 minit sebagai kecederaan tiub yang lemah dan 60 minit sebagai kecederaan tiub yang kuat. Peningkatan ekspresi NGAL dan meratakan tiub diperhatikan dalam kumpulan 30 dan 60 min. Peningkatan ekspresi NGAL dan meratakan tubules lebih ketara dalam kumpulan 60 minit kerana ia telah mengalami lebih banyak kecederaan (Rajah. 2A–C). Penurunan ketinggian tiub dan peningkatan dalam ungkapan NGAL ditunjukkan berdasarkan peningkatan dalam tempoh keadaan iskemik (Rajah 2A-C). Analisis regresi linear keputusan juga menunjukkan korelasi negatif antaraBuah pinggangketinggian tiub dan ungkapan NGAL (R2=0.6266, P=0.011) (Gamb. 2D).
Model nefropati ADR sering digunakan dalampenyakit buah pinggangpenyelidikan kerana ia menghasilkan kecederaan glomerular dan gangguan tiub kecil dengan tahap kebolehulangan yang tinggi menggunakan satu dos ADR [13]. Model tetikus nefropati ADR digunakan dalam kajian ini untuk menilaiBuah pinggangkecederaan tiub dan ketinggian. Model tikus nefropati yang disebabkan oleh ADR sering digunakan untuk menerangkan mekanisme glomerulosklerosis fokal (FSGS) dan CKD. Satu dos ADR boleh menyebabkan kehilangan podosit, proteinuria berterusan, dan FSGS. Di antara strain tetikus yang berbeza, BALB / c sensitif terhadap ADR, sedangkan C57BL / 6 (B6) tahan. Oleh itu, kami menggunakan BALB / c dalam percubaan ADR ini. Dalam nefropati ADR,Buah pinggangfibrosis interstisial, yang merupakan penemuan khas CKD, adalah
Rajah 2. (A) Imej perwakilan imej yang mengotorkan dan mengotorkan asid berkala (PAS) dan imej bernoda imunkimia dengan anti-neutrophil gelatinase yang dikaitkan dengan lipocalin (NGAL) antibodi sham (panel kiri), 30 min (panel tengah), dan 60 minit (panel kanan) bahagian buah pinggang. Panel atas mewakili imej bernoda PAS dan panel bawah mewakili imej bernoda imunokimia dengan antibodi anti-NGAL. Bar skala: 50 μm. (B) Graf membandingkan ketinggian tiub sham, 30 min, dan 60 min. (C) Graf membandingkan kawasan positif NGAL berbanding jumlah kawasan sham, 30 min dan 60 min. Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai; Nilai P dikira oleh ujian berbilang kumpulan Bonferroni. (D) Plot serak dengan regresi linear menunjukkan analisis korelasi antara ketinggian ketinggian tubules dan kawasan ngAL-positif. Garis regresi linear menunjukkan korelasi songsang antara ketinggian tiub dan kawasan positif NGAL. Pekali korelasi nilai R dan P ditunjukkan. Lingkaran hitam menunjukkan kumpulan palsu (n = 3), kotak hitam menunjukkan kumpulan 30 min (n = 3), dan segitiga hitam menunjukkan kumpulan 60 min (n = 3). *P<0.05,><>
menonjol pada 4 minggu selepas pentadbiran ADR, manakala keadaan perantaraan antara AKI dan CKD diperhatikan kurang daripada 4 minggu [24]. Dalam kajian ini, kami menilai meratakan tiub pada tikus 2 minggu selepas rawatan ADR, keadaan pertengahan. TahapBuah pinggangkecederaan tiub dinilai dengan mengukur ekspresi NGAL, yang meningkat dalam sel-sel tiub buah pinggang yang rosak [6]. Ketinggian tiub buah pinggang diukur, dan pewarnaan imunokimia menggunakan antibodi anti-NGAL dilakukan pada tisu buah pinggang ADR dan kumpulan kenderaan. Tiada imej positif pewarnaan merah Sirius dikesan (data tidak ditunjukkan). Meratakan tiub telah dipertingkatkan oleh pentadbiran ADR, dan peningkatan yang ketara dalam ungkapan NGAL telah ditunjukkan (Rajah 3A–C). Di samping itu, analisis regresi linear ketinggian tiub dan tahap ekspresi NGAL menunjukkan korelasi yang bertentangan (R2 = 0.522, P = 0.043) (Rajah.3D).
PERBINCANGAN
Hubungan yang kuat antara meratakan tiub buah pinggang dan fibrosing interstisial dalam model CKD yang teruk dan antara meratakan tiub dan gangguan tiub dalam model ADR dan IR, telah ditunjukkan dalam kajian ini. Terdapat pelbagai mekanisme di mana lesi glomerular merebak ke fibrosis interstisial melalui gangguan tiub. Satu kajian melaporkan bahawaBuah pinggangkerosakan tubule (meratakan) mendorong fibrosing interstisial, pengeluaran matriks ekstraselular (ECM), dan penyusupan sel keradangan. Korelasi yang kuat antaraBuah pinggangmeratakan tiub dan fibrilasi tiub tiub buah pinggang yang diperhatikan dalam kajian ini mungkin sepadan dengan persatuan kausal yang dilaporkan sebelum ini; Iaitu.Buah pinggangkerosakan tiub menyebabkan fibrosing, pengeluaran ECM, dan penyusupan sel. Satu lagi kajian juga menunjukkan korelasi antara ekspresi NGAL yang dipertingkatkan dan atrofi tiub buah pinggang (item skor kecederaan gangguan buah pinggang yang lain), dengan hasil yang serupa dengan skor meratakan tiub buah pinggang yang diperolehi dalam kajian ini [26]. Dalam kajian ini, hanya lelaki
Rajah 3. (A) Imej perwakilan yang mengotorkan asid berkala (PAS) dan imej bernoda imunkimia dengan bahagian buah pinggang lipocalin yang berkaitan dengan anti-neutrophil gelatinase (NGAL) kenderaan (panel kiri) dan adriamycin (ADR) (panel kanan). Panel atas mewakili imej bernoda PAS dan panel bawah mewakili imej bernoda imunokimia dengan antibodi anti-NGAL. Bar skala: 50 μm. (B) Graf membandingkan ketinggian tiub kenderaan dan ADR. (C) Graf membandingkan kawasan positif NGAL berbanding jumlah kawasan. Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai; Nilai P dikira oleh ujian berbilang kumpulan Bonferroni. (D) Plot serak dengan regresi linear menunjukkan analisis korelasi antara ketinggian tubules dan kawasan ngAL-positif. Garis regresi linear menunjukkan korelasi songsang antara ketinggian tiub dan kawasan positif NGAL. Pekali korelasi nilai R dan P ditunjukkan. Lingkaran hitam menunjukkan kumpulan kenderaan (n = 3), dan kotak hitam menunjukkan kumpulan ADR (n = 5). *P<0.05,><>
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN SAKIT BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
tikus digunakan, tetapi meratakan tubules dalam nefropati boleh diperhatikan dalam kedua-dua jantina. Walau bagaimanapun, tikus betina telah dilaporkan tahan terhadap IR dan model nefropati lain, jadi penggunaan tikus lelaki atau perempuan harus dipertimbangkan bergantung pada model nefropati yang digunakan [8]. Ia juga sukar untuk menilai meratakan tiub dalam medulla, kerana tubules dalam medulla pada masa tidak cedera mempunyai sel tiub nipis, walaupun ketinggian tubules dalam korteks dinilai. Oleh itu, kaedah mudah untuk menilai kecederaan tiub dalam medulla perlu dibangunkan pada masa akan datang (data tidak ditunjukkan). Pakar seperti ahli patologi atau doktor secara amnya melakukan penilaian tahap atrofi, pengembangan, atau mutasi tiub buah pinggang untuk menjaringkan histologi tubules buah pinggang; Walau bagaimanapun, pengukuran ketinggian tiub buah pinggang untuk menjaringkan tahap meratakan boleh dilakukan dengan lebih mudah berbanding dengan kaedah lain. Ini juga berfaedah kerana teknologi yang maju dengan cepat seperti kecerdasan buatan dan pemprosesan imej boleh digunakan dengan mudah; oleh itu, diagnosis yang lebih tepat, objektif, dan kuantitatif harus dilakukan pada masa akan datang. Untuk mengesahkan sama ada meratakan tiub buah pinggang boleh menjadi fenomena yang diperhatikan secara universal sebagai indeks keganasan CKD merentasi spesies yang berbeza, siasatan lanjut menggunakan model CKD tikus lain, haiwan pendamping seperti anjing dan kucing, atau sampel yang dikumpulkan daripada manusia perlu dijalankan.