Poli- Dan Oligosakarida Ulva Sp. Pecahan Daripada Pengekstrakan Berbantukan Enzim Memodulasi Metabolisme Matriks Ekstraselular

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Ulva sp. diketahui sebagai sumber sebatian bioaktif seperti van, tetapi aktiviti biologinya pada matriks ekstraselular fibroblast kulit manusia (ECM) kurang dilaporkan. Dalam kerja ini, peraturan ECM telah disiasat buat kali pertama pada kedua-dua tahap proteomik dan transkriptom dalam fibroblas kulit manusia normal, selepas 48 jam inkubasi dengan pecahan poli dan oligosakarida dari Ulva sp. diperolehi selepas pengekstrakan dan penyahpolimeran berbantukan enzim. Peningkatan percambahan sel (sehingga tambah 68 peratus ) tanpa menunjukkan sebarang kesan sitotoksik pada fibroblas ditunjukkan pada 50 dan 1000ug/mL oleh kedua-dua pecahan. Pada tahap proteomik, pecahan polisakarida pada 1000 ug/mL meningkatkan paling banyak sintesis glikosaminoglikan (GAGs, sehingga tambah 57 peratus ), jumlah kolagen, terutamanya jenis I (sehingga tambah 217 peratus ) dan Ⅲ, serta sintesis dan aktiviti MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1, sehingga tambah 309 peratus ). Sebaliknya, pecahan oligosakarida tidak mempunyai kesan ke atas sintesis GAG tetapi menunjukkan persamaan untuk kolagen dan peraturan MMP-1.puritans vitamin cPada tahap transkriptom, penurunan ungkapan COL1A1 dan COL1A2 serta peningkatan ungkapan COL3A1 dan MMP-1 mengesahkan modulasi metabolisme ECM oleh kedua-dua pecahan. Penyelidikan kami menekankan bahawa poli- dan oligosakarida Ulva sp. pecahan mempamerkan aktiviti biologi yang menarik dan menyokong potensi penggunaannya dalam bidang pembaharuan kulit untuk aplikasi dermo-kosmetik anti-penuaan.

sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Kata kunci:kolagen; matriks ekstraselular; fibroblas kulit manusia; matriks metalloproteinase; rumpai laut; Ulva sp.

1. Pengenalan

Pasang surut hijau berskala besar yang disebabkan oleh Uloa sp. telah berulang di Brittany (Perancis) disebabkan oleh eutrofikasi marin. Terdampar rumpai laut hijau mempunyai kesan buruk ekologi yang mendalam termasuk perubahan struktur ekosistem, pengurangan biodiversiti asli, dan kerugian ekonomi [1,2]. Kecuali untuk kegunaan sebagai pengubahsuaian tanah, makanan haiwan, atau degradasi mudah melalui pereputan atau pembakaran daripada peristiwa terkandas, sangat sedikit yang diketahui tentang penguapan Uloa sp. dalam kesihatan manusia [1]. Walau bagaimanapun, Ulloa sp. merupakan sumber sebatian penting seperti ulvan. Evans, polisakarida dinding sel sulfat larut air, terutamanya terdiri daripada rhamnose, asid uronik, dan xylose, boleh mewakili sehingga 36 peratus berat kering Ulloa [3]. Dua unit disakarida berulang utama ulvan ialah asid aldobiuronik (asid ulvanobiuronik), jenis A: -D-asid glukuronik (1,4)-dipautkan kepada -L-rhamnose 3-sulfat, dan jenis B: -L- asid iduronik (1,4)-dipautkan kepada -L-rhamnose 3-sulfat. Disakarida kecil aldoses, yang dirujuk sebagai ulvanobioses (jenis U) juga boleh didapati dalam ulvan[3.4].Pengestrakan ulvan dari segi hasil dan kualiti kuantitatif boleh berbeza dengan ketara mengikut kaedah pengekstrakan dan pembahagian yang digunakan pada biojisim. Ulvan biasanya diekstrak dalam larutan akueus pada suhu tinggi (80-90 darjah ) yang dirujuk sebagai proses pemerahan. Walau bagaimanapun, Evans boleh dipulihkan dengan teknologi hijau baru bernama Enzyme-Assisted Extraction (EAE)[5].EAE membenarkan pengekstrakan sebatian yang menarik tanpa menggunakan keadaan denaturasi seperti pelarut atau suhu pengekstrakan yang tinggi, dan ia mempamerkan pelbagai kelebihan seperti kecekapan pemangkin yang tinggi, kekhususan tinggi, keadaan tindak balas ringan, dan pemeliharaan aktiviti biologi sebatian. EAE juga meningkatkan hasil dan mengurangkan kos dan penggunaan tenaga jika dibandingkan dengan proses pemerahan klasik [6-9]. Selepas pengekstrakan akueus daripada pemerasan atau proses baru seperti EAE, pengayaan ulvan selalunya dilakukan dengan prosedur pemendakan etanol [3]. Ulvan telah menunjukkan secara in vitro dan in vivo beberapa aktiviti biologi seperti imunomodulasi, antioksidan, antikanser, antikoagulan, antihiperlipidemik atau antivirus [3,5,10-14].sistancheCiri struktur Evans (darjah sulfation, corak sulfation, komposisi monosakarida, kaitan glikosidik, tahap percabangan, serta berat molekul) memberi kesan kepada aktiviti biologinya [3]

Penuaan kulit ialah proses yang kompleks dengan dua proses pelengkap: intrinsik (genetik, metabolisme selular, dll.) dan ekstrinsik (pendedahan UV, pencemaran, merokok tembakau, dll.)[15-17]

Cistanche boleh anti-penuaan

Penggunaan bioaktif rumpai laut sebagai sumber produk bernilai tambah tinggi untuk industri dermo-kosmetik baru muncul. Di antara sebatian bioaktif ini, ulvan mempunyai potensi yang tinggi. Malah, permintaan pengguna terhadap produk semula jadi semakin meningkat sejak beberapa tahun lalu, yang menjadikan produk marin dan terutamanya rumpai laut sebagai sumber bahan semula jadi yang menarik yang menyasarkan kecantikan dan kesihatan kulit [18-22]. Kulit, sasaran produk kosmetik, diperbuat daripada tiga lapisan bertindih utama yang berbeza: epidermis, dermis, dan hipodermis.apa itu cistancheDermis menyokong epidermis dan menampung sel kulit penting yang dikenali sebagai fibroblas. Fibroblas, sel utama dermis papillary yang ditemui betul-betul di bawah epidermis, pada asasnya mensintesis dan menyusun matriks ekstraselular (ECM). ECM terdiri daripada pelbagai makromolekul termasuk kolagen (70 peratus daripada berat kering) terutamanya jenis I dan III, elastin (2-4 peratus ), glikoprotein (fibronektin, laminin, dll), glikosaminoglikan (GAG) sama ada sulfat (heparan). sulfat, dermatan sulfat, keratan sulfat, kondroitin sulfat) dan bukan bersulfat (asid hyaluronik), proteoglikan, dan komponen degradasi seperti MMP (Matrix Metalloproteinases)[23,24]. Kolagen jenisI mewakili sehingga 80 peratus daripada jumlah kolagen [25] dan merupakan salah satu juzuk utama dermis kulit ECM; ia terlibat dalam keanjalan kulit, fleksibiliti, dan ketegangan. Kolagen jenis I ialah heterotrimer, protein triple helix, terdiri daripada dua rantai cl dan satu rantai c2 masing-masing dikodkan oleh gen COL1Al dan COL1A2 [26]. Kolagen fibrillar jenis I dan II mewakili lebih 90 peratus daripada jumlah kolagen dan berkait rapat dalam kulit [27,28]. Kolagen jenis II lebih lazim pada kulit muda daripada kulit tua dan terutamanya terlibat dalam penyembuhan luka [29,30]. Untuk mewujudkan rangkaian molekul untuk pemasangan ECM, GAG dikaitkan dengan protein dan membentuk proteoglikan (cth, decorin atau versican) yang berinteraksi dengan kolagen jenis I [31] Dalam ECM, MMP, yang merupakan enzim laluan katabolik ECM, dikaitkan, dalam bentuk terpendam atau aktif, kepada perencat tisu metalloproteinase mereka yang dikenali sebagai TIMP, yang mengawal aktiviti mereka [32]. MMP-1(collagenase-1) ialah enzim utama yang bertanggungjawab untuk degradasi kolagen jenis I dan TIMP-1 ialah perencatnya masing-masing [334]. Fibroblas adalah pengawal selia utama homeostasis ECM. Keseimbangan dan gandingan sintesis antara komponen ECM kulit yang terlibat dalam anabolisme, seperti kolagen jenisI dan II, GAG atau TIMP, dan dalam katabolisme seperti MMP, membolehkan pembaharuan dan pembentukan semula berterusan ECM ini[25].Dalam penuaan kulit , akibat utama ialah ketidakseimbangan peraturan ECM dengan pengurangan percambahan fibroblas, modulasi tahap komponen ECM dengan penurunan penting sintesis kolagen jenis I, rembesan GAG dan sintesis TIMP-1 dan peningkatan dalam Tahap MMP-1 [24,35].

Buat masa ini, hanya beberapa kajian telah menyiasat kesan Ulva sp. pecahan pada metabolisme sel kulit fibroblas pada kedua-dua tahap proteomik dan transkriptom[36-39]dan, sehingga kini, tiada kajian lengkap pada tahap proteomik dan transkriptomi dijalankan ke atas pecahan poli-dan oligosakarida Ulua yang diperoleh daripada proses EAE.Cistanche anti penuaanDalam perspektif ini, kajian ini menyiasat, secara in vitro, kesan pecahan poli dan oligosakarida daripada Ulva sp. diperoleh daripada teknologi hijau baru EAE pada metabolisme fibroblas dermal manusia. Kesannya terhadap percambahan dan daya maju fibroblas dan pada kedua-dua anabolisme dan katabolisme ECM pada tahap proteomik dan transkriptom telah dikaji untuk menyerlahkan potensi mereka dalam penjagaan kulit (cth, anti-penuaan).

2. Keputusan

2.1.Pecahan Poli-dan Oligosakarida Ulva sp.

daripada EAE Pamerkan Komposisi Biokimia Berbeza dan Taburan Berat Molekul

Mekanisme penghasilan pecahan poli dan oligosakarida diperincikan dalam bahagian Bahan dan Kaedah: "4.2 Pengeluaran dan Pencirian Fraksi Poli-dan Oligosakarida". Analisis pencirian biokimia terperinci sebelum ini (karbohidrat, asid uronik, kumpulan sulfat dan protein) dan molekul taburan berat pecahan poli-dan oligosakarida daripada Ulloa sp. diperolehi daripada EAE telah dilakukan [36]. Data digabungkan dalam Jadual 1.

Secara ringkasnya, pecahan polisakarida ulvan mentah (UE) dan ulvan dialisis (DS-UE) terdiri daripada ulvan berat molekul tinggi (van mentah) dengan 23.5-37.4 peratus karbohidrat,18.5-37. 0 peratus asid uronik,29.9-49.1 peratus kumpulan sulfat, dan 10.5-12.8 peratus protein. Komposisi karbohidrat terutamanya rhamnose(50 peratus) dan asid glukuronik (11 peratus). Pecahan DS-UE jauh lebih kaya dalam ulvan daripada pecahan UE. Pecahan oligosakarida, van ternyahpolimer daripada HSO2 (DEP-HD PP-UE) dan van ternyahpolimer daripada resin Amberlite (DEP-AD PP-UE), terdiri daripada van berat molekul rendah dengan 24.4-30.4 peratus karbohidrat ( rhamnose 44.9-55.4 peratus dan asid glukuronik 7.5-11.0 peratus ), 21.6-30.8 peratus asid uronik dan 12.8-16.8 peratus protein.

Walau bagaimanapun, proses penyahpolimeran membawa kepada kehilangan separa sulfat (tidak dikesan dalam DEP-ADPP-dan hanya 6.6 peratus dalam DEP-HD PP-UE). Taburan berat molekul (Mw) pecahan oligosakarida menunjukkan purata Mw rendah 8kDa untuk DEP-HD PP-UE dan lebih rendah untuk DEP-AD PP-U dengan 1.5 kDa.

2.2.Pecahan Poli-dan Oligosakarida Ulva sp. Merangsang Aktiviti Metabolik Tetapi Tidak Menjejaskan Daya Daya Fibroblas

Aktiviti metabolik fibroblas kulit manusia normal (NHDF), 48h-terdedah kepada pecahan poli-dan oligosakarida Ulloa（50 dan 100 ug/mL selama 48 jam）, telah dinilai oleh WST-1 (Rajah 1). Dalam eksperimen ini (n=9), pecahan Ullva daripada EAE meningkatkan percambahan fibroblas sehingga tambah 68 peratus berbanding kawalan.cistanche beefíciosPeningkatan ketara dalam aktiviti metabolik (m.s<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Untuk menentukan sama ada kesan ini dikaitkan dengan tiada ketoksikan sel, daya maju sel yang dirawat ekstrak Ulou dinilai dengan pengukuran pelepasan LDH (lactate dehydrogenase) menggunakan ujian CytoTox96 darjah selepas 48 jam pengeraman (n=3)(Rajah 2). Ujian sitotoksisiti menunjukkan bahawa semua pecahan tidak menunjukkan sitotoksisiti yang ketara berbanding kawalan.

2.3.Pecahan Poli-dan Oligosakarida Ulva sp. Merangsang Metabolisme Matriks Ekstraselular dalam Fibroblas

Kesan pecahan poli-dan oligosakarida Ulloa pada sintesis glikosaminoglikan fibroblas dan tidak bersulfat (GAG) dinilai dengan pewarnaan biru Alcian selepas 48 jam pengeraman (n=4)(Rajah 3). Peningkatan sintesis yang ketara hanya diperhatikan untuk UE dan DS-UE pada 100 ug/mL memandangkan kedua-dua sulfat (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Adalah menarik untuk diperhatikan bahawa DS-UE, pecahan ulvan terkaya, paling banyak meningkatkan sintesis GAG. Pada 50 ug/mL, UE dan DS-UE menaikkan sintesis GAG tidak bersulfat tetapi tidak ketara (masing-masing ditambah 14.2 peratus dan ditambah 22.7 peratus). Fraksi oligosakarida DEP-AD PP-UE pada 1000 ug/mL menurunkan sedikit sintesis GAG tidak bersulfat tetapi tidak ketara (-3 peratus ), dan DEP-HD PP-UE dipertingkatkan sedikit tetapi tidak ketara sintesis GAG pada 100 ug/ mL (tambah 4.1 peratus untuk sulfat dan ditambah 10.9 peratus untuk tidak bersulfat).

Jumlah sintesis kolagen (Rajah 4) telah dinilai oleh ujian Sirius Merah selepas pendedahan fibroblas 48 jam kepada pecahan poli- dan oligosakarida Ulloa（n=7 pada 100 ug/mL dan n=6 pada 50 ug/mL） .

Semua pecahan menunjukkan peningkatan yang bergantung kepada kepekatan dalam sintesis kolagen. Penurunan sintesis kolagen marginal dan tidak ketara dicatatkan untuk semua pecahan pada 50 ug/mL berbanding kawalan. Sebaliknya, pada 1000 ug/mL, semua pecahan meningkatkan jumlah sintesis kolagen dan dengan cara yang ketara untuk UE( tambah 22 peratus ,p<><0.01),and dep-hd=""><>

Poli- dan oligosakarida Kesan pecahan EAE yang diperolehi pada sintesis kolagen jenis I (n=6) dan sintesis MMP-1(n=4) telah dinilai dengan ujian ELISA (Rajah 5).

Semua pecahan mempertingkatkan sintesis kolagen jenis I dan sintesis MP-1 tetapi tidak selalunya ketara. Peningkatan sintesis kolagen jenis I adalah bergantung kepada kepekatan. Fraksi polisakarida, UE dan DS-UE, pada 1000 ug/mL, didapati ketara （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Kesan pecahan poli-dan oligosakarida Ulloa pada 100 ug/mL, selepas pendedahan fibroblas 48 jam, pada sintesis kolagen jenis I(n=5) dan jenis Ⅲ(n=4), pada pengeluaran MMP-1(n=6)dan TIMP-1(n=5) ​​telah dinilai oleh analisis Western blot (WB) dengan kaedah normalisasi menggunakan kaedah jumlah protein lorong ( Rajah 6).

Dalam Rajah 6a,e, dan WB masing-masing menyerlahkan peningkatan dalam kolagen jenis I matang （≈130kDa） dan kolagen jenis III matang （≈190 kDa）sintesis untuk semua pecahan. Kuantifikasi protein dalam Rajah 6c kolagen jenis I dan Rajah 6g kolagen jenis III menunjukkan peningkatan NS (tidak ketara secara statistik) bagi sintesisnya dengan kehadiran kedua-dua poli dan oligosakarida Ulloa sp. pecahan. Sementara itu, WB dalam Rajah 6b,d membenarkan kami mengukur （hlm<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

Aktiviti kolagenase MMP-1 ditentukan oleh ujian zimografi dengan kehadiran pecahan Ulloa poli- dan oligosakarida pada 100 ug/mL （Rajah 7a）, dikira dan dibandingkan dengan kawalan (Rajah 7b), selepas pendedahan fibroblas selama 48 jam (n). =4).

Keputusan menunjukkan bahawa kedua-dua poli-dan oligosakarida Ulva sp. pecahan tidak meningkat dengan ketara aktiviti MMP-1 fibroblas.

2.4.Pecahan Poli-dan Oligosakarida Ulva sp. Memodulasi Secara Berbeza Ungkapan Gen ECM bagi Fibroblas

Kesan pecahan terbitan poli- dan oligosakarida Ulloa EAE telah dikaji pada tahap keadaan mantap mRNA beberapa komponen matriks ekstraselular (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 dan TIMP-1)(n =4)(Rajah 8).

Kami mendapati bahawa semua pecahan pada 1000 ug/mL berkurangan dengan ketara (m.s<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Jadual 2 menunjukkan hasil gabungan pada tahap keadaan mantap mRNA gen selepas pendedahan fibroblast kepada pecahan pada 1000 ug/mL.

Jadual 2 menunjukkan bahawa UE menurun dengan ketara (m.s<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Artikel ini Dadah Mac. 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs