Nikotin Paternal Meningkatkan Ingatan Ketakutan, Mengurangkan Pentadbiran Nikotin, Dan Mengubah Fungsi Genetik Dan Neural Hippocampal dalam Keturunan
Mar 21, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1
1Jabatan Kesihatan Biobehavioral, Penn State University, University Park, Pennsylvania
2Jabatan Farmakologi, Sekolah Perubatan Vanderbilt, Nashville, Tennessee
3Kolej Farmasi, Universiti Kentucky, Lexington, Kentucky
4Jabatan Neurobiologi dan Tingkah Laku, Universiti California Irvine, Irvine, California
5Bioinformatik, Biokimia dan Biologi Molekul, Universiti Negeri Penn, Taman Universiti, PA
6Jabatan Psikologi, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania
Abstrak
Penggunaan nikotin kekal berleluasa dengan produk tembakau dan e-rokok yang digunakan di seluruh dunia. Walau bagaimanapun, peningkatan bukti pewarisan epigenetik transgenerasi menunjukkan bahawa penggunaan nikotin boleh mengubah tingkah laku dan neurobiologi dalam generasi berikutnya. Kami menguji kesan pendedahan nikotin paternal kronik dalam tikus C57BL6/J pada penyaman ketakutan dalam keturunan F1 dan F2, serta kepupusan ketakutan terkondisi dan pemulihan spontan, pentadbiran sendiri nikotin, fungsi kolinergik hippocampal, ekspresi RNA, dan metilasi DNA dalam F1 zuriat. Pendedahan nikotin bapa dikaitkan dengan penyesuaian ketakutan kontekstual dan isyarat yang dipertingkatkan dan pemulihan spontan kenangan ketakutan yang terpadam. Selanjutnya, tetulang nikotin telah dikurangkan dalam tikus yang mempunyai nikotin, seperti yang dinilai dalam paradigma pentadbiran sendiri. Fenotip tingkah laku ini digabungkan dengan tindak balas yang diubah kepada nikotin, pengikatan reseptor asetilkolin nikotinik hippocampal yang dikawal, mengurangkan arus kolinergik hippocampal yang ditimbulkan, dan mengubah metilasi dan ekspresi gen hippocampal yang berkaitan dengan perkembangan saraf dan keplastikan. Analisis ekspresi gen mencadangkan kesan multigenerasi pada rangkaian gen yang lebih luas yang berpotensi terlibat dalam neuroplastisitas dan gangguan mental. Perubahan dalam pelaziman ketakutan juga mencadangkan fenotip yang serupa dengan gangguan kecemasan yang serupa dengan tekanan selepas trauma.
KATA KUNCI: kolinergik, hippocampus, pembelajaran, multigenerasi, nikotin, transgenerasi
1. PENGENALAN
Bukti terkumpul menunjukkan bahawa kesan pendedahan kepada dadah penyalahgunaan melangkaui individu untuk mempengaruhi fenotip fisiologi dan tingkah laku dalam anak yang tidak terdedah.1-3 Pencirian kesan nikotin merentas generasi adalah kritikal memandangkan kelaziman penggunaan produk tembakau4 dan peningkatan dramatik penggunaan e-rokok.5 Melalui kesannya ke atas sistem kolinergik otak, pendedahan nikotin menghasilkan perubahan ketara dalam fungsi otak yang mungkin mendasari ketagihan nikotin dan menyumbang kepada peningkatan risiko gangguan psikiatri, termasuk kemurungan6 dan kebimbangan.7 Pengubahsuaian epigenetik hiliran pengaktifan kolinergik mungkin membenarkan kesan berterusan pada fungsi selular dan litar.8,9 Sehingga baru-baru ini, adalah dipercayai bahawa pengubahsuaian epigenetik ini telah dipadamkan apabila penubuhan garisan germa dan dengan itu diasingkan daripada generasi berikutnya. Walau bagaimanapun, pengubahsuaian epigenetik, termasuk metilasi DNA, pengubahsuaian pascatranslasi histon, dan RNA bukan pengekodan, yang diperoleh dalam satu generasi boleh diwarisi pada generasi seterusnya.10,11 Pengubahsuaian epigenetik ini boleh menjadi pengantara kesan Multigenerasi dan transgenerasi pendedahan nikotin ibu bapa terhadap tingkah laku dan neurobiologi anak. .
Kajian tikus dari pelbagai makmal bebas telah mula mengenal pasti akibat multigenerasi dan transgenerasi pendedahan nikotin ibu bapa. Kerja ini setakat ini telah mengenal pasti kesan pendedahan nikotin ibu bapa terhadap fenotip seperti kemurungan dan kebimbangan,1 fleksibiliti kognitif,2 tingkah laku seperti gangguan hiperaktif kekurangan perhatian (ADHD),3 dan ekspresi gen.1,2 Akibat pelbagai generasi dan transgenerasi pendedahan nikotin boleh menjejaskan endofenotip yang terlibat dalam ketagihan nikotin dan kesihatan mental. Sebagai contoh, kami telah menunjukkan bahawa pendedahan nikotin memodulasi pelaziman ketakutan kontekstual, model pembelajaran ketakutan yang bergantung kepada hippocampus yang berkaitan dengan kerentanan kepada gangguan kesihatan mental seperti gangguan tekanan selepas trauma (PTSD) dan ketagihan.12-14 Nikotin kesan pada pembelajaran ketakutan kontekstual dimodulasi oleh hippocampus.15,16 Kami telah mendapati bahawa pendedahan nikotin akut meningkatkan pembelajaran ketakutan yang bergantung kepada hippocampus,15,17 menjejaskan kepupusan ketakutan kontekstual,18,19 dan menambah pemulihan spontan ketakutan kontekstual berikutan kepupusan.18 Walau bagaimanapun, kesan Multigenerasi dan transgenerasi pendedahan nikotin paternal pada fenotip ini belum dikaji. Tambahan pula, tiada kajian terdahulu telah mencirikan kesan pelbagai generasi nikotin terhadap fungsi kolinergik. Warisan multigenerasi merujuk kepada fenotip yang timbul dalam generasi serta-merta berikutan individu yang terdedah, manakala warisan transgenerasi terdiri daripada pewarisan maklumat epigenetik yang dimediasi garis kuman antara generasi tanpa ketiadaan pengaruh persekitaran langsung yang membawa kepada variasi fenotip.11 Di sini, kami meneliti kedua-dua generasi berbilang generasi. dan kesan transgenerasi pendedahan nikotin bapa terhadap pembelajaran ketakutan kontekstual dan isyarat dalam generasi F1 dan F2 serta pada pentadbiran diri nikotin, pengikatan reseptor asetilkolin nikotinik hippocampal (nAChR), fungsi kolinergik hippocampal, ekspresi gen hippocampal, dan metilasi DNA hippocampal dalam generasi F1. Kami membuat hipotesis bahawa pendedahan nikotin paternal akan memberi kesan kepada penyaman ketakutan, ekspresi gen hippocampal, dan berfungsi dalam keturunan dan cucu.
kesan ekstrak cistanche
2 KAEDAH DAN BAHAN
2.1 Mata Pelajaran
Subjek adalah tikus C57BL / 6J lelaki dan perempuan (8-20 minggu, Makmal Jackson, Bar Harbor, ME). Kecuali tempat tinggal untuk pembiakan harem, semua haiwan ditempatkan secara berkumpulan dengan kitaran terang/gelap 12 jam dan akses ad libitum kepada makanan dan air. Semasa pengambilan sendiri, subjek dihadkan makanan kepada 85 peratus hingga 90 peratus daripada berat badan mereka yang diberi makan secara percuma, dan air diberikan secara ad libitum. Semua ujian tingkah laku berlaku antara 9:00 PG dan 6:00 PTG. Semua prosedur telah dijalankan mengikut Panduan NIH untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal dan diluluskan oleh jawatankuasa IACUC Universiti Negeri Penn, Temple University atau Universiti California Irvine.
2.2 Pendedahan nikotin paternal
Lelaki (8 minggu) menerima 0.9 peratus garam steril atau garam hidrogen tartrat nikotin (12.6 mg/kg/hari, berat asas bebas—Fisher Scientific, Waltham, MA atau MP Biomedical, Santa Ana, CA) terlarut dalam 0.9 peratus salin steril, dihantar secara subkutan melalui pam mini osmotik (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) selama 28 hari. Dos ini menghasilkan paras nikotin dan kotin dalam plasma setanding dengan yang dilihat pada perokok manusia sederhana.20,21
2.3 Penjanaan tikus F1 dan F2
Separuh hayat nikotin dalam tikus adalah lebih kurang 6 minit.22 Telah ditunjukkan sebelum ini bahawa kesan pengeluaran nikotin hilang sebanyak 4 hari selepas penyingkiran nikotin.23-25 Oleh itu, kelewatan 4 hari antara rawatan nikotin dan pembiakan dilaksanakan untuk memastikan penghapusan nikotin secara sistemik sebelum pembiakan. Tikus jantan dimasukkan ke dalam sangkar dengan dua ekor betina C57BL/6 J naif (8-20 minggu) selama 2 minggu untuk menjana anak F1. Tikus F2 dijana dengan mengawan tikus F1 jantan naif dengan betina naif.
2.4 Pengkondisian ketakutan
Prosedur penyaman ketakutan dan kepupusan telah diterangkan secara terperinci sebelum ini.19 Secara ringkas, tikus telah dilatih dan diuji dalam ruang pelemahan hingar (18.8 × 2{12}} × 18.3 cm, hingar latar 65 dB; MED Associates, St. Albans, VT). Tikus F1 dan F2 dikondisikan dengan ketakutan dengan dua rangsangan terkondisi (CS, 3{17}} s, 85‐dB white noise)–stimulus tanpa syarat (AS, 2 s, 0.57‐mA renjatan kaki) yang dipisahkan selama 120 saat. Untuk mengkaji kesan akut nikotin pada penyaman ketakutan dalam tikus F1 dan F2, anak menerima nikotin akut (0.09 mg/kg, berat asas bebas NIC, ip; garam hidrogen tartrat nikotin, Fisher Scientific) atau salin (SAL) 2 hingga 4 minit sebelum itu. kepada sesi latihan dan ujian. Dua puluh empat jam selepas latihan, tikus dikembalikan ke konteks latihan selama 5 minit untuk menilai pembekuan kontekstual. Selepas ujian kontekstual, tikus diletakkan di dalam bilik yang berbeza untuk menilai pembelajaran ketakutan isyarat. Penguji buta terhadap keadaan yang dinilai pembekuan, ditakrifkan sebagai ketiadaan pergerakan sukarela selain daripada pernafasan, melalui kaedah pensampelan masa yang tidak berat sebelah.19 Untuk mengkaji potensi kesan siling semasa ujian isyarat, kohort berasingan tikus F1 menerima latihan yang sama dengan hanya satu CS‐US berpasangan, dan kepupusan ketakutan kontekstual dan pemulihan spontan juga diperiksa. Kepupusan ketakutan berlaku selama lima sesi berturut-turut bermula sehari selepas ujian ketakutan kontekstual dan isyarat. Selepas sesi kepupusan terakhir, tikus dibiarkan tanpa gangguan di dalam sangkar rumah mereka selama 7 hari dan kemudian diuji semula dalam konteks latihan untuk pemulihan spontan. Untuk menentukan sama ada sebarang perbezaan yang diperhatikan dalam pelaziman ketakutan adalah disebabkan oleh perbezaan sensitiviti kejutan, kebimbangan, atau defisit pembelajaran yang lebih luas, haiwan NIC- dan SAL-Sired lelaki dan perempuan telah diuji tambahan di medan terbuka, sensitiviti kejutan, labirin tinggi ditambah ( EPM), dan paradigma pengecaman objek baru (lihat Maklumat Sokongan untuk kaedah dan keputusan penuh).
2.5 Makanan dan pemberian sendiri nikotin intravena
A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 pelet setiap sesi merentasi tiga sesi berikutnya), subjek adalah vena jugular yang dikateter di bawah isoflurane (1 peratus ‐3 peratus) / bius wap oksigen, seperti yang diterangkan sebelum ini.26 Tikus dibenarkan lebih daripada atau sama dengan 72 jam untuk pulih daripada pembedahan sebelum akses untuk membalas semula untuk ganjaran makanan. Penubuhan semula tindak balas makanan memastikan bahawa tikus telah pulih dengan secukupnya selepas pembedahan intravena dan mempamerkan tindak balas operan normal berikutan kelewatan dalam akses ke ruang operan. Tikus-tikus tersebut kemudiannya dibenarkan untuk mendapatkan pemberian sendiri nikotin intravena (IV) semasa sesi harian 1 jam, 6 hingga 7 hari seminggu (garam hidrogen tartrat nikotin dilarutkan dalam 0.9 peratus garam steril, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infusi, berat asas bebas; MP Biomedical, Santa Ana, CA). Nikotin IV dihantar oleh pam picagari Razel (Med Associates). Setiap sesi mempunyai dua tuas boleh ditarik balik (satu aktif, satu tidak aktif). Pelengkapan kriteria tindak balas pada tuil aktif menghasilkan penghantaran infusi nikotin IV (0.{{20}}3 ml isipadu infusi; jadual FR5TO20 saat). Respons pada tuil tidak aktif telah direkodkan tetapi tidak mempunyai akibat yang dijadualkan. Selepas lapan sesi pemerolehan pada 0.03 mg/kg/infusi, dos infusi bertukar kepada 0.1 mg/kg/infusi untuk enam sesi. Bagi setiap dos, purata pengambilan tiga sesi terakhir digunakan untuk analisis statistik. Kateter dibilas setiap hari dengan garam steril fisiologi (0.9 peratus b/v) yang mengandungi heparin (100 unit USP/ml). Patensi kateter telah disahkan dengan Brevital (natrium methohexital, Eli Lilly, Indianapolis, IN) selepas fasa pentadbiran sendiri nikotin. Untuk menilai tingkah laku yang berkaitan dengan kambuh semula, tikus telah diuji untuk inkubasi keinginan selepas sesi sejurus selepas 0.1 mg/kg/dos infusi pemberian sendiri nikotin IV; dalam prosedur ini, tikus dibenarkan bertindak balas pada tuil aktif tetapi tidak menerima infusi nikotin. Pada sesi inkubasi asas pertama (hari 1), tikus diletakkan di dalam ruang operan di bawah jadual FR5TO20 saat dengan pengaktifan cahaya isyarat kontinjen. Selepas itu, tikus ditempatkan di dalam sangkar rumah selama 20 hari. Pada hari ke-21 pantang, tikus telah diperiksa untuk pengeraman keinginan, dengan cahaya isyarat tuil aktif dihantar di bawah jadual FR5TO20 saat. Kajian telah dijalankan oleh penguji yang buta kepada keadaan kumpulan, dan tindak balas tingkah laku direkodkan secara automatik oleh perisian MedAssociates.
2.6 Pengikatan reseptor asetilkolin nikotinik
Ujian pengikatan radioligand16 dilakukan menggunakan hippocampi dari tikus NIC-Sired (5 M dan 10F) 8 minggu dan SAL-Sired (9 M dan 6F) F1. Sampel dihomogenkan menggunakan penimbal lisis (5 mM Tris campur 5 mM EDTA campur 5 mM EGTA), disentrifugasi pada 100 000 g selama 30 minit pada 4 darjah, digantung semula dalam penimbal lisis dan diempar semula. Pelet digantung semula dalam Tris/10 peratus penimbal sukrosa dan diinkubasi dengan [3 H] Epibatidine ([3 H]EB) (~2 nM berdasarkan27,28) (aktiviti khusus 54.1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) selama 1 jam pada suhu bilik. [3 H]EB dipilih untuk pengikatan nAChR, kerana keputusan sebelumnya menunjukkan bahawa nAChR heteromerik hippocampal 4 2 mengantara kesan nikotin pada penyaman ketakutan.17 Pengikatan tidak spesifik dinilai dengan kehadiran 300 μM nikotin (garam hidrogen tartrat nikotin dilarutkan dalam Tris Buffer, kepekatan asas bebas). [3 H]NAChR terikat EB telah ditapis (penuai sel 24-telaga, Brandel Co, Gaithersburg, MD), dan kaunter kilauan cecair (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) diukur radioaktiviti penapis. Pengikatan khusus yang dinyatakan sebagai tisu fmol/mg dikira sebagai perbezaan antara pengikatan jumlah dan tidak spesifik.16
2.7 Rakaman kolinergik amperometrik in vivo
Kohort berasingan tikus NIC-Sired dan SAL-Sired F1 yang berusia 10} 1 hingga 20 minggu telah digunakan untuk menilai perubahan dalam penghantaran kolinergik hippocampal menggunakan amperometri. Mikroelektrod berasaskan seramik (Pusat Teknologi Mikroelektrod, Lexington, KY), dengan 4 (15 × 333 μm) tapak rakaman platinum yang disusun secara berpasangan (atas dan bawah), disalut dengan choline oxidase (Nombor EC 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), seperti yang dilaporkan sebelum ini.29 Elektrod telah dielektropolimerkan dengan meta‐phenylenediamine (m‐PD; Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO) untuk meningkatkan selektiviti bagi mengesan arus kolin. Mikroelektrod dengan kepekaan lebih besar daripada atau sama dengan 3pA/μM dan had pengesanan kurang daripada atau sama dengan 400 nM untuk kolin digunakan untuk menyediakan indeks sensitif pelepasan Acetylcholine (ACh).30 Haiwan telah dibius dengan urethane (1.2‐1.5). g/kg, ip), dan mikroelektrod bersalut enzim secara stereotaksis diturunkan ke dorsal (A/P ‐1.7 mm, M/L ± 1.5 mm, D/V ‐2.3 mm) atau ventral (A/P −3.1 mm, M /L ± 3.0 mm, D/V −4.3 mm) hippocampus. Hippocampus ventral dan dorsal dinilai secara berasingan, kerana ia menyumbang secara berbeza kepada penyesuaian ketakutan kontekstual: hippocampus ventral (vHPC) mempunyai peranan yang lebih menonjol dalam persatuan dan ekspresi ketakutan, manakala hippocampus dorsal (DHCP) adalah kritikal untuk ingatan kontekstual.31 Ag/ Elektrod rujukan AgCl telah diimplan ke dalam korteks rostral kontralateral.
Rakaman amperometrik telah dijalankan pada 2 Hz dengan menggunakan potensi tetap tambah 0.7 V, dan data telah didigitalkan (FAST‐16 potentiostat, Quainton, Nicholasville, KY). Arus latar belakang distabilkan selama 60 minit, kemudian ubat-ubatan digunakan ke dalam hippocampus menggunakan kapilari kaca (diameter hujung: 15 μm) yang dilekatkan pada elektrod. Pelepasan ACh yang ditimbulkan penyahkutuban diukur dengan menggunakan sama ada denyutan singkat kalium (KCl 70 mM; 100 NL) atau NIC (1 mM freebase, nikotin tartrat; 100 NL) pada 2 hingga 10 psi setiap 2 minit. Rakaman telah diimbangi untuk kawasan hippocampal (dorsal atau ventral) dan dadah (kalium atau NIC). Amplitud isyarat kolin diukur dengan perubahan arus pada saluran bersalut enzim daripada arus asas dan ditukar kepada μM setara kolin berdasarkan penentukuran in vitro. Rujukan kendiri telah diterima pakai untuk menghapuskan artifak dengan menolak arus daripada saluran sentinel.29 Peletakan mikroelektrod telah disahkan oleh pewarnaan Nissl pada bahagian koronal hippocampal (Rajah S1). Purata dua tindak balas setiap manipulasi dadah setiap haiwan digunakan untuk analisis statistik.
2.8 Analisis statistik
Perbandingan statistik dilakukan menggunakan SPSS (IBM, Armonk, NY) atau GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Outlier ditentukan oleh nilai 2 sisihan piawai di atas min. Jika outlier dikesan, maklumat tersebut disertakan dalam bahagian hasil. Kriteria untuk kepentingan telah ditetapkan pada=.05. Analisis statistik pada mulanya dilakukan termasuk jantina sebagai faktor untuk semua eksperimen yang menguji kedua-dua anak lelaki dan perempuan. Analisis telah runtuh merentasi jantina apabila interaksi tiga hala atau dua hala dengan seks tidak dikesan (P >.05). Data dianalisis dengan ujian-t, 1-hala, atau 2-hala ANOVA, mengikut kesesuaian. Kesan utama atau interaksi yang ketara diikuti oleh perbandingan post hoc LSD. Langkah-langkah berulang ANOVA diikuti oleh perbandingan post hoc Bonferroni dengan pembetulan untuk pelbagai perbandingan. Jika varians tidak sama dikesan, ujian-t Welch untuk varians tidak sama digunakan dan darjah kebebasan dibundarkan ke bawah.
2.9 Pengasingan RNA/DNA
Tikus F1 dewasa (8 minggu; n=3 M dan 3 F setiap kumpulan) telah dieutanasi melalui dislokasi serviks. Hippocampi dibedah dengan pantas kepada bahagian ventral dan dorsal (dalam nisbah 1:1), dikumpulkan dari sisi kiri dan kanan, dan kilat beku di atas ais kering. DNA dan RNA telah diasingkan bersama dan disucikan menggunakan Kit Mini DNA/RNA AllPrep (Qiagen, Valencia, CA). Kepekatan dan kualiti RNA dan DNA dinilai menggunakan NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) dan Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Untuk pengekstrakan RNA, Nombor Integriti RNA (RIN) minimum ialah 8.5.
2.10 Analisis transkriptom melalui
Perpustakaan penjujukan RNA telah disediakan oleh Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) untuk 150 bp bacaan satu hujung menggunakan Kit Persediaan Perpustakaan mRNA Terkandas Illumina TruSeq (Illumina, San Diego, CA) dan disusun pada Illumina HiSeq 2500 dalam mod larian pantas (tiga larian berturut-turut dengan kira-kira 10 juta bacaan bagi setiap sampel). Fail FASTQ telah disemak kualiti melalui FASTQC dan mempunyai min setiap bacaan markah kualiti Phred lebih daripada 30 (iaitu, ralat penjujukan kurang daripada 0.1 peratus). Fail FASTQ telah diselaraskan dengan genom rujukan tetikus (mm10; UCSC Genome Browser) menggunakan TopHat (v2.1.0)32 pada Galaxy Project33. Cufflinks dan Cuffmerge (v2.2.1.0)34 digunakan untuk memasang transkrip daripada bacaan dipetakan dan menggabungkan fail transkrip untuk pemasangan transkriptom terakhir. Nilai P terlaras kadar penemuan palsu (FDR) telah dikira untuk ekspresi gen pembezaan daripada sampel NIC-Sired dan SAL-Sired menggunakan Cuffdiff (v2.2.1.3),34 dengan potongan FDR standard 0.05.35 Transkriptom set data telah disimpan kepada Omnibus Ekspresi Gen.
2.11 Analisis pengayaan
Gen yang dinyatakan secara berbeza dianalisis menggunakan analisis laluan kepintaran (IPA, dijalankan pada Disember 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 untuk mendedahkan potensi pengayaan rangkaian biologi bersekutu. Parameter jalankan menetapkan maksimum 35 molekul setiap rangkaian gen dan analisis terhad kepada tisu CNS mamalia atau garisan sel. Kepentingan statistik untuk pengayaan ditentukan menggunakan ujian tepat Fisher ekor kanan yang diperbetulkan untuk ujian berbilang.
2.12 Penjujukan bisulfit yang disasarkan
DNA yang diasingkan bersama dengan RNA (lihat Bahagian 2.9) digunakan untuk analisis metilasi DNA. RNA-seq mengenal pasti 952 dan 162 gen yang dinyatakan secara berbeza dalam vHPC dan DHCP, masing-masing. 1010 gen unik daripada senarai gabungan ini telah dipilih untuk pengayaan dalam bisulfit‐seq menggunakan Sistem Pengayaan Epi SeqCap tersuai (Roche, Pleasanton, CA, Amerika Syarikat; Jadual S1).38 Bisulfit yang disasarkan penjujukan telah dilakukan di Penn State Huck Institutes of the Life Sciences Genomic Core Facility. Perpustakaan telah dibina menggunakan kit KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Perpustakaan yang ditukar natrium bisulfit telah dikuatkan dan diperkayakan PCR untuk kawasan genomik terpilih menggunakan set probe tangkapan tersuai (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). DNA yang ditangkap telah dijujukan pada Illumina HiSeq 2500 menggunakan bacaan akhir berpasangan 100 nt. Fail FASTQ telah disemak kualiti melalui FASTQC. Urutan penyesuai Illumina telah dikeluarkan dan tapak berkualiti rendah dipangkas menggunakan Trimmomatic.39 Pemangkasan asas berkualiti rendah dilakukan dengan pendekatan tingkap gelongsor, pemangkasan apabila kualiti purata dalam empat tetingkap pasangan asas jatuh di bawah ambang 20, dengan panjang bacaan minimum 35. Selepas pemangkasan, fail FASTQ memiliki min setiap bacaan markah kualiti Phred lebih daripada 30 (iaitu, ralat penjujukan kurang daripada 0.1 peratus). Bacaan yang dipangkas dipetakan pada genom rujukan tetikus (mm10) menggunakan Bowtie240 yang dilaksanakan dalam Bismark.41 Ekstrak metil_dalam Bismark digunakan untuk mengekstrak maklumat metilasi CpG dan untuk membuat laporan metilasi. MethylKit42 digunakan untuk analisis kawasan metilasi berbeza (DMRs). Status metilasi diringkaskan pada tingkap tidak bertindih sebanyak 500 pasangan asas dan analisis metilasi pembezaan telah dilakukan, dengan FDR piawai 0.05.35 Set Data telah didepositkan ke Omnibus Ungkapan Gen.
Faedah ekstrak cistanche
3 KEPUTUSAN
3.1 Nikotin paternal meningkatkan penyesuaian ketakutan kontekstual dan membalikkan peningkatan nikotin akut terhadap penyesuaian ketakutan kontekstual dalam tikus generasi F1 dan F2
Tikus jantan dan betina NIC‐Sired dan SAL‐Sired F1 dikondisikan selepas pentadbiran SAL atau NIC akut (0.09 mg/kg ip, Rajah 1A). Analisis lengkap pembekuan garis dasar, pra-CS dan CS disertakan dalam Maklumat Sokongan. ANOVA 3 hala pembekuan kontekstual dengan rawatan sire, rawatan dadah akut dan jantina sebagai faktor mendedahkan sire × interaksi rawatan dadah akut yang ketara (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" oleh="" kerana="" tiada="" interaksi="" yang="" ketara="" antara="" jantina="" dan="" bapa="" atau="" rawatan="" dadah="" akut,="" anova="" 2="" hala="" yang="" runtuh="" merentas="" jantina="" telah="" dilakukan="" dan="" mendedahkan="" rawatan="" tuan="" ×="" interaksi="" rawatan="" dadah="" akut="" yang="" signifikan="" (f(1,40)="20.96" ,="" p=""><.001). perbandingan="" post="" hoc="" menunjukkan="" bahawa="" tikus="" nic-sired="" f1="" yang="" dirawat="" dengan="" garam="" menunjukkan="" penyaman="" ketakutan="" kontekstual="" yang="" dipertingkatkan="" berbanding="" dengan="" tikus="" sal-sired="" f1="" yang="" dirawat="" dengan="" garam="" (t20="2.73," p=""><.05). selaras="" dengan="" penemuan="" sebelumnya,="" 43="" nic="" akut="" pada="" 0.09="" mg/kg="" menghasilkan="" penyaman="" ketakutan="" kontekstual="" yang="" dipertingkatkan="" dalam="" tikus="" sal‐sired="" (t22="2.99," p=""><.01). walau="" bagaimanapun,="" nic="" akut="" pada="" 0.09="" mg/kg="" menjejaskan="" penyaman="" ketakutan="" kontekstual="" dalam="" tikus="" bersiri="" nic="" (t18="3.36," p=""><.01). secara="" keseluruhan,="" tahap="" pembekuan="" konteks="" dalam="" tikus="" nic-sired="" nic="" adalah="" setanding="" dengan="" yang="" diperhatikan="" dalam="" tikus="" sal-sired="" sal="" pada="" kedua-dua="" 0.09="" mg/kg="" (p=""> .05).
Selain itu, haiwan NIC- dan SAL-Sired lelaki dan perempuan telah diuji dalam kepekaan kejutan (Rajah S2), labirin ditambah tinggi (EPM, Rajah S3), medan terbuka, dan paradigma pengecaman objek baru (Rajah S4, lihat Maklumat Sokongan untuk kaedah penuh dan keputusan). Dengan pengecualian wanita NIC-Sired dalam EPM (yang menunjukkan peningkatan tingkah laku seperti kebimbangan) dan haiwan NIC-Sired dalam kepekaan kejutan (yang menunjukkan penurunan kereaktifan vokal kepada kejutan, yang tidak akan mengelirukan ketakutan yang dipertingkatkan fenotip multigenerasi), tiada perbezaan telah dikesan antara tikus NIC- dan SAL-Sired.
RAJAH 1 Nikotin paternal meningkatkan pelaziman ketakutan kontekstual dan melemahkan peningkatan nikotin akut bagi pelaziman ketakutan. Pembekuan kontekstual adalah lebih tinggi dengan ketara dalam NIC‐Sired campur SAL berbanding dengan kawalan SAL‐Sired tambah SAL. Nikotin akut pada 0.09 mg/kg mempertingkatkan penyaman ketakutan kontekstual dalam SAL‐Sired tetapi dengan ketara mengurangkan penyaman ketakutan kontekstual dalam haiwan NIC‐Sired (n=10‐12 setiap kumpulan). B, Pembekuan kontekstual adalah lebih tinggi dengan ketara dalam NIC-gransire campur SAL berbanding dengan kawalan SAL-gransire campur SAL (n=9-11 setiap kumpulan). Bar ralat menunjukkan ralat piawai bagi min (SEM), *P <>
Untuk menentukan sama ada penyaman ketakutan kontekstual terjejas berterusan ke generasi seterusnya (F2), NIC-grandsire dan SAL-grandsire jantan dan tikus F2 betina telah dibiakkan daripada tikus jantan F1 naif. Analisis lengkap pembekuan garis dasar, pra-CS dan CS disertakan dalam Maklumat Sokongan. ANOVA 3 hala pembekuan kontekstual dilakukan dengan rawatan grandsire, rawatan dadah akut, dan jantina sebagai faktor bebas (Rajah 1B). Oleh kerana tiada interaksi yang ketara antara jantina dan bapa atau rawatan dadah akut, ANOVA 2 hala yang runtuh merentas jantina telah dilakukan. Kesan utama yang ketara bagi sire (F(1,37)=9.88, P < .01)="" ditemui,="" dan="" perbandingan="" post="" hoc="" menunjukkan="" bahawa="" tikus="" nic‐grandsire="" mempamerkan="" penyesuaian="" ketakutan="" kontekstual="" yang="" ditambah="" berbanding="" dengan="" tikus="" sal‐="" grandsire="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" di="" samping="" itu,="" tikus="" sal-grandsire="" yang="" diberikan="" nic="" akut="" telah="" meningkatkan="" penyesuaian="" ketakutan="" kontekstual="" (t19="2.41," p="0.026)" tetapi="" nic="" akut="" tidak="" meningkatkan="" penyesuaian="" ketakutan="" kontekstual="" dalam="" tikus="">
RAJAH 2 Nikotin bapa meningkatkan penyesuaian ketakutan isyarat dan pemulihan spontan ingatan ketakutan. Untuk mengkaji potensi kesan siling semasa ujian cued, kohort berasingan tikus F1 menerima latihan yang sama dengan hanya satu pasangan CS‐US. Kedua-dua penyesuaian ketakutan kontekstual dan cued telah ditambah dalam tikus NIC-Sired berbanding dengan tikus SAL-Sired yang dilatih dengan 1 pasangan CS-US (n=8-10 setiap kumpulan). B, Pendedahan nikotin bapa tidak menjejaskan kepupusan ketakutan kontekstual tetapi meningkatkan pemulihan spontan ingatan ketakutan 7 hari selepas sesi kepupusan terakhir (n=8‐10 setiap kumpulan). Bar ralat menunjukkan ralat piawai bagi min (SEM), *P <>
3.2 Nikotin bapa meningkatkan penyaman ketakutan isyarat dalam tikus generasi F1
Untuk memeriksa sama ada kesan siling menghalang pengesanan perbezaan kumpulan untuk penyaman ketakutan isyarat (lihat Maklumat Sokongan), kumpulan tikus F1 yang berasingan telah dilatih dengan satu pasangan CS-US. Dalam kohort ini, peningkatan pelaziman ketakutan kontekstual (t7=3.21, P <.05) serta="" pelaziman="" ketakutan="" isyarat="" ditemui="" dalam="" tikus="" nic‐sired="" (t6="2.41," p=""><. 05;="" rajah="">
3.3 Nikotin bapa meningkatkan pemulihan spontan ingatan ketakutan kontekstual dalam tikus generasi F1
Kohort tikus F1 yang menerima satu pasangan CS-US kemudiannya diuji untuk kepupusan dan pemulihan spontan memori ketakutan kontekstual. Tikus F1 NIC‐Sired menunjukkan kepupusan ketakutan biasa tetapi menunjukkan pemulihan spontan memori ketakutan kontekstual yang dipertingkatkan berbanding tikus SAL‐Sired (t7=3.38, P < 0.05;="" rajah="">
3.4 Nikotin bapa mengurangkan pengambilan diri nikotin
Sebelum latihan untuk pentadbiran diri nikotin, subjek dianalisis untuk keupayaan mereka mempelajari tugas operan untuk mendapatkan ganjaran makanan, dan tiada perbezaan diperhatikan (Maklumat sokongan, Rajah S5). Untuk menguji kesan potensi pendedahan nikotin sire pada tetulang nikotin dalam keturunan F1, pemerolehan pemberian sendiri nikotin IV (0.03 mg/kg/infusi) dinilai dalam ANOVA reka bentuk campuran 2 hala, yang dikenal pasti. kesan utama sesi (F(7,119)=13.60, P < .001)="" dan="" sesi="" ×="" interaksi="" rawatan="" sire="" (f(7,119)="5.00," p="">< .001).="" walau="" bagaimanapun,="" ujian="" post="" hoc="" tidak="" mendedahkan="" sebarang="" perbezaan="" yang="" signifikan="" secara="" statistik="" antara="" kumpulan="" pada="" setiap="" lapan="" sesi="" pemerolehan="" (rajah="" 3a).="" bilangan="" tekanan="" tuil="" aktif="" dan="" tidak="" aktif="" kemudiannya="" dianalisis="" untuk="" menentukan="" sama="" ada="" kumpulan="" mengekalkan="" keutamaan="" merentas-sesi="" untuk="" tuil="" aktif="" semasa="" pemerolehan="" (rajah="" 3b),="" yang="" mengenal="" pasti="" kesan="" utama="" sesi="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p=""><.001) dan="" sesi="" ×="" interaksi="" rawatan="" sire="" (f(21,238)="11.40," p=""><.001). analisis="" post="" hoc="" mendedahkan="" bahawa="" kumpulan="" berbeza="" pada="" hari="" pertama="" pentadbiran="" sendiri="" nikotin.="" kumpulan="" nic-sired="" mempamerkan="" tekanan="" tuil="" aktif="" yang="" lebih="" besar="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" sal-sired.="" kesan="" ini="" mungkin="" sama="" ada="" mewakili="" tahap="" tingkah="" laku="" mencari="" dadah="" yang="" lebih="" tinggi="" pada="" hari="" pertama="" pendedahan,="" ketabahan="" bertindak="" balas="" untuk="" ganjaran="" makanan="" dan/atau="" penurunan="" fleksibiliti="" kognitif="" dalam="" peralihan="" tindak="" balas="" daripada="" makanan="" kepada="" dadah.="" walau="" bagaimanapun,="" perbezaan="" ini="" tidak="" berterusan="" sepanjang="" sesi="" selanjutnya.="" tikus="" sal-sired="" mempamerkan="" keutamaan="" statistik="" yang="" konsisten="" untuk="" tuil="" aktif="" berbanding="" tuil="" tidak="" aktif="" mereka="" (post="" hoc="" p=""><.01), tetapi="" tikus="" nic-sired="" tidak="" menunjukkan="" keutamaan="" yang="" dikekalkan="" ini="" untuk="" sesi="" 3="" hingga="">
RAJAH 3 Nikotin bapa mengurangkan pengambilan diri nikotin. Seekor tikus jantan NIC‐ dan SAL‐Sired (n=9‐10 setiap kumpulan) tidak berbeza dalam jumlah bilangan infusi yang diperolehi untuk setiap sesi semasa tempoh pemerolehan pada 0 .03 mg/kg/dos infusi. B, Semasa pemerolehan, bilangan tekanan tuil aktif dan tidak aktif berbeza dengan ketara pada sesi pertama, dengan nikotin tikus NIC-Sired menunjukkan lebih banyak tekanan tuil aktif berbanding tikus SAL-Sired. Walau bagaimanapun, merentasi sesi berikutnya, tikus NIC-Sired berkurangan bertindak balas, menyebabkan tiada perbezaan yang ketara antara bilangan tekanan tuil aktif dan tidak aktif merentas sesi 3 hingga 8. Sebaliknya, haiwan SAL-Sired mempamerkan keutamaan statistik yang konsisten untuk tuil aktif atas tuil tidak aktif mereka. C, Purata bilangan infus nikotin dalam tiga sesi pemerolehan terakhir tidak berbeza dengan ketara antara tikus NIC- dan SAL-Sired. D, Pada dos sederhana 0.1 mg/kg/infusi, tikus NIC-Sired mentadbir sendiri bilangan infusi nikotin yang jauh lebih rendah. E, Inkubasi penilaian mengidam mendedahkan peningkatan ketara dalam bertindak balas pada tuas aktif sebelum ini selepas 21 hari berpantang sahaja untuk tikus SAL‐Sired. Bar ralat menunjukkan ralat piawai bagi min (SEM), *P <>
Untuk mengkaji lebih lanjut perbezaan kumpulan yang berpotensi semasa mengawal kebolehubahan semasa fasa awal pemerolehan, bilangan min infusi nikotin telah diperiksa untuk tiga sesi terakhir, masa di mana subjek menunjukkan tindak balas yang lebih konsisten untuk nikotin (Rajah 3C). Kumpulan tersebut tidak berbeza dengan ketara dalam purata bilangan infusi nikotin (P > .05). Selepas itu, tikus telah dialihkan kepada dos nikotin 0.1 mg/kg/infusi, yang sebelum ini ditunjukkan lebih disukai dalam tikus dewasa C57BL6/J.44 Pada dos ini, tikus NIC-Sired mentadbir sendiri bilangan infusi yang lebih rendah (t{ {7}}.20, P <.05; rajah="" 3d).="" untuk="" pengeraman="" tingkah="" laku="" mengidam,="" yang="" dianggap="" sebagai="" ukuran="" peningkatan="" pencarian="" dadah="" semasa="" pantang,="" anova="" reka="" bentuk="" campuran="" 2="" hala="" dengan="" sesi="" dan="" rawatan="" bapa="" mengenal="" pasti="" kesan="" utama="" sesi="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p=""><.001). walaupun="" haiwan="" sal-sired="" mempamerkan="" kesan="" inkubasi="" dengan="" tindak="" balas="" yang="" lebih="" besar="" pada="" hari="" ke-21="" pantang="" berbanding="" dengan="" hari="" 1,="" tikus="" nic-sired="" tidak="" menunjukkan="" peningkatan="" dalam="" tingkah="" laku="" mencari="" nikotin="" (p=""><>
3.5 Pendedahan nikotin paternal mengubah pengikatan dan fungsi kolinergik hippocampal
Pengikatan nAChR heteromerik hippocampal afiniti tinggi telah dikawal selia dalam tikus NIC‐Sired F1 (t28=2.14, P <.05; sal‐sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic‐sired="1.34" ±="" 0.044).="" satu="" subjek="" (nic-sired)="" telah="" dialih="" keluar="" kerana="" nilai="" mengikat="" adalah="" dua="" sisihan="" piawai="" di="" atas="">
Rakaman amperometrik arus ACh yang ditimbulkan kalium dan nikotin telah dinilai dalam F1 dHPC dan vHPC. Disebabkan saiz sampel yang tidak sekata bagi setiap jantina, jantina tidak dimasukkan sebagai faktor awal dalam analisis ini. Isyarat kolinergik yang ditimbulkan oleh penyahkutuban KCl tidak berbeza antara tikus SAL- dan NIC-Sired dalam dHPC (P > .05; Rajah 4A); walau bagaimanapun, aplikasi nikotin tempatan menghasilkan pengurangan ketara dalam amplitud isyarat kolinergik dalam tikus NIC‐Sired (t8=2.33, P <.05; rajah="" 4c).="" dalam="" vhpc,="" pelepasan="" ach="" dikurangkan="" dalam="" tikus="" nic‐sired="" berikutan="" penggunaan="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; rajah="" 4b)="" atau="" nikotin="" (t8="2.98," p=""><.05 ;="" rajah="">
RAJAH 4 Nikotin bapa mengurangkan isyarat kolinergik dalam hippocampus. Isyarat kolin populasi dHPC yang ditimbulkan oleh depolarisasi terminal yang disebabkan oleh KCl. Tiada perbezaan ketara dikesan antara haiwan NIC‐ dan SAL‐Sired (n=5 setiap kumpulan). B, isyarat kolin populasi vHPC yang ditimbulkan oleh depolarisasi terminal yang disebabkan oleh KCl telah dikurangkan dalam tikus NIC-Sired. C, Isyarat kolin dHPC populasi yang ditimbulkan nikotin telah dikurangkan dalam tikus NIC-Sired. D, Isyarat kolin vHPC populasi yang ditimbulkan nikotin telah dikurangkan dalam tikus NIC-Sired. Tiada kesan seks pada isyarat kolinergik diperhatikan. Bar ralat menunjukkan ralat piawai bagi min (SEM), *P <>
3.6 Pendedahan nikotin bapa secara berbeza mengubah ekspresi gen hippocampal dorsal dan ventral
Analisis transkriptom hippocampal F1 melalui penjujukan RNA mendedahkan 952 gen yang dinyatakan secara berbeza dalam vHPC (FDR=0.05; Jadual S2). Daripada gen ini, 612 telah dikurangkan dan 340 telah dikawal dalam tikus NIC-Sired. Dalam dHPC, hanya 162 gen yang dinyatakan secara berbeza dalam tikus NIC-Sired berbanding dengan tikus SAL-Sired (FDR=0.05). Daripada 162 gen ini, 86 telah dikurangkan dan 76 telah dikawal. Seratus tiga gen dengan ekspresi gen yang diubah bertindih antara vHPC dan dHPC.
3.7 Pendedahan nikotin paternal mengubah laluan transkrip yang terlibat dalam pembangunan sistem saraf
Dalam vHPC, analisis IPA mengenal pasti rangkaian teratas "Penyakit Neurologi, Kecederaan Organisma dan Keabnormalan, Kematian Sel dan Kemandirian" (skor=41, Jadual S3) dan rangkaian teratas kedua "Pembangunan dan Fungsi Sistem Saraf, Morfologi Tisu, Neurologi Penyakit" (skor=23). Lima kategori Fungsi Molekul dan Selular teratas ialah: "Morfologi sel" (88 molekul), "Perhimpunan dan Organisasi Selular" (79 molekul), "Pembangunan Selular" (96 molekul), "Fungsi dan Penyelenggaraan Selular" (79 molekul), dan "Pertumbuhan Selular dan Percambahan" (87 molekul). Perkembangan dan Fungsi Sistem Fisiologi teratas ialah "Pembangunan dan Fungsi Sistem Saraf" (175 molekul), dan beberapa Fungsi Penyakit dan Gangguan teratas termasuk "Penyakit Neurologi" (kedua, 191 molekul) dan "Gangguan Psikologi" (keempat, 90 molekul ) (Jadual S4).
Sebagai pelengkap kepada keputusan IPA, analisis pengayaan menggunakan Enrichr memberikan bukti lanjut untuk perubahan dalam pertumbuhan dan perkembangan selular dalam vHPC, dengan istilah biologi GO teratas termasuk "penyambungan RNA," "tindak balas terhadap protein terungkap," dan "peraturan pertumbuhan sel" dan " penstabilan protein" (Jadual S5). Sejajar dengan itu, "kompleks spliceosomal" dikenal pasti sebagai istilah selular GO teratas. Analisis laluan KEGG melalui Enrichr juga menunjukkan fungsi spliceosome dan isyarat MAPK sebagai laluan yang berpotensi terjejas.
Walaupun senarai gen yang dinyatakan secara berbeza dalam dHPC lebih pendek berbanding dengan vHPC, laluan dan istilah yang diperkaya dHPC yang serupa telah dikenal pasti (Jadual S3 dan S4). Analisis IPA mengenal pasti rangkaian teratas "Tingkah Laku, Penyakit Neurologi, Kecederaan Organisme dan Keabnormalan" (skor=24) dan rangkaian teratas kedua "Penyakit Neurologi, Kecederaan Organisme dan Keabnormalan serta Gangguan Psikologi (skor=20) .
Lima kategori Fungsi Molekul dan Selular teratas dalam dHPC ialah "Pembangunan Selular" (29 molekul), "Pertumbuhan dan Percambahan Selular" (29 molekul), "Morfologi Sel" (27 molekul), "Perhimpunan dan Organisasi Sel" (23 molekul) , dan "Fungsi dan Penyelenggaraan Selular" (25 molekul). "Pembangunan dan Fungsi Sistem Saraf" sekali lagi dikenal pasti sebagai istilah yang diperkaya di bawah Pengembangan Sistem Fisiologi dan klasifikasi Fungsi (kedua, 44 molekul). Istilah yang diperkaya teratas di bawah klasifikasi Fungsi Penyakit dan Gangguan termasuk "Penyakit Neurologi" (molekul pertama, 51), dan "Gangguan Psikologi" (kelima, 31 molekul). Analisis pengayaan menggunakan Enrichr mengenal pasti pelbagai istilah biologi GO yang berbeza untuk dHPC berbanding dengan vHPC, termasuk "peraturan kematian neuron" dan "perkembangan otak" (Jadual S5), yang merupakan pelengkap kepada fungsi molekul dan selular IPA "Kematian dan Kemandirian Sel."
Untuk meneroka lebih lanjut peranan fungsi transkrip yang dinyatakan secara berbeza yang bertindih antara dHPC dan vHPC, gen yang dinyatakan secara berbeza yang biasa untuk kedua-dua wilayah (103 jumlah) telah dinilai. Transkrip yang dinyatakan secara berbeza yang bertindih antara kedua-dua wilayah semuanya dikurangkan atau dikawal selia dalam arah yang sama, mencadangkan perubahan biasa dalam laluan transkrip merentasi kawasan otak dalam tikus NIC-sired. Lima kategori Fungsi Molekul dan Selular teratas yang dikenal pasti oleh IPA ialah "Kematian dan Kemandirian Sel" (17 molekul), "Pergerakan Selular" (10 molekul), "Isyarat dan Interaksi Sel-ke-Sel" (17 molekul), "Pertumbuhan Selular dan Percambahan" (18 molekul), dan "Morfologi Sel" (17 molekul) (Jadual S4)
Gen yang dinyatakan secara berbeza yang unik kepada dHPC dan vHPC kemudiannya dianalisis secara berasingan dalam IPA untuk menguji penyesuaian neurobiologi yang berbeza antara kedua-dua wilayah (Jadual S6). Tiada laluan kanonik diperkaya yang bertindih antara analisis dHPC unik vHPC yang unik. Laluan kanonik yang diperkaya teratas yang unik kepada vHPC (jumlah 44) termasuk "Isyarat Kalsium" dan "Isyarat reseptor Glucocorticoid," manakala laluan kanonik dHPC teratas (lapan jumlah) termasuk "Metabolisme Hormon Tiroid" dan "Isyarat Apoptosis Pengantaraan Asid Retinoik." Penyakit dan fungsi yang diperkaya yang unik kepada vHPC (jumlah 295) termasuk "Pembentukan Tanduk [Hippocampus] Ammon" dan "Kuantiti Tonjolan Selular" manakala istilah penyakit dan fungsi yang diperkaya dHPC secara unik (111 jumlah) termasuk "Keradangan bahan putih" dan "Demyelinasi ."
3.8 Pendedahan nikotin paternal mengubah metilasi DNA hippocampal
Analisis metilasi DNA yang disasarkan telah dilakukan untuk menentukan sama ada metilasi DNA yang diubah dalam kawasan pengawalseliaan yang sepadan menyumbang kepada ekspresi gen pembezaan dalam keturunan NIC-Sired F1. Sasaran termasuk 1114 gen yang dinyatakan secara berbeza yang dikenal pasti dalam sama ada dHPC atau vHPC. Dalam vHPC, 11 kawasan metilasi berbeza (DMR) telah dikesan, dengan lapan menunjukkan peningkatan metilasi dan tiga menunjukkan penurunan metilasi (Jadual 1). Daripada 11 DMR, 10 terletak di kawasan yang berkaitan dengan gen yang mempamerkan ekspresi yang diubah dalam vHPC. Dalam dHPC, 30 DMR dikesan, dengan 15 menunjukkan peningkatan metilasi dan 15 menunjukkan penurunan metilasi. Daripada 30 DMR, 29 terletak di kawasan yang berkaitan dengan gen yang mempamerkan ekspresi yang diubah dalam dHPC.
Benkhasiat cistanche echinacoside
4. PERBINCANGAN
Peningkatan pemahaman tentang proses epigenetik bersama-sama dengan data terkini, termasuk penemuan semasa, telah mencabar pemahaman tradisional tentang warisan. Faktor di luar genotip sahaja boleh menentukan fenotip dalam generasi berikutnya, dan pendedahan dalam generasi mungkin tidak diasingkan daripada keturunan. Kajian ini mencadangkan bahawa kesan kesihatan yang memudaratkan pendedahan nikotin mungkin mengatasi pendedahan individu dan menjejaskan generasi berikutnya. Kami mengenal pasti kesan Multigenerasi dan transgenerasi pendedahan nikotin paternal prakonsepsi dalam tikus C57BL/6J pada penyaman ketakutan Pavlovian, menghasilkan ingatan ketakutan yang lebih kuat dalam keturunan F1 dan F2. Pendedahan nikotin daripada bapa juga mengakibatkan penurunan pentadbiran sendiri nikotin dan tingkah laku berkaitan kambuh semula yang dilemahkan, mencadangkan tindak balas yang lebih agresif terhadap nikotin. Untuk menyokong perbezaan tingkah laku ini, perubahan multigenerasi dalam fungsi kolinergik hippocampal dan proses epigenetik diperhatikan. Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan perubahan dalam fungsi sistem saraf dalam keturunan tikus yang terdedah kepada nikotin yang mengakibatkan fenotip tingkah laku yang diubah.
Keturunan F1 dan F2 tikus jantan yang terdedah kepada nikotin mempamerkan penyesuaian ketakutan kontekstual dan isyarat yang dipertingkatkan. Walaupun tiada perbezaan dalam kepupusan ketakutan kontekstual antara tikus NIC- dan SAL-Sired F1, tikus NIC-Sired menunjukkan pemulihan spontan yang dipertingkatkan bagi ingatan ketakutan kontekstual. Yang penting, tiada perbezaan dalam sensitiviti kejutan antara tikus NIC- dan SAL-Sired yang boleh menyumbang kepada penyaman ketakutan yang meningkat ditemui. Pengkondisian ketakutan yang dipertingkatkan mungkin mencadangkan peningkatan umum proses pembelajaran berbanding dengan modulasi proses yang lebih khusus kepada ketakutan untuk belajar. Walau bagaimanapun, tiada perubahan dalam pengecaman objek novel, latihan makanan operan, atau pergerakan medan terbuka diperhatikan dalam tikus NIC-Sired, walaupun kesan khusus jantina dari peningkatan masa lengan terbuka EPM dalam tikus betina NIC-Sired telah dikenalpasti. Walaupun ini tidak menolak kemungkinan pengubahsuaian kepada sistem pembelajaran atau proses kognitif lain, penemuan ini bersama-sama mencadangkan bahawa pembelajaran ketakutan mungkin lebih sensitif kepada kesan multigenerasi dan transgenerasi pendedahan nikotin bapa. Selain itu, penemuan ini mencadangkan fungsi kolinergik yang diubah dalam haiwan NIC-Sired. Nikotin memodulasi pelaziman ketakutan kontekstual. Manakala nikotin akut meningkatkan penyaman ketakutan kontekstual,15,45 penarikan diri daripada nikotin kronik mengganggu penyaman ketakutan kontekstual.16,21 Dalam kajian ini, nikotin akut meningkatkan penyaman ketakutan kontekstual dalam tikus F1 dan F2 daripada tikus yang dirawat dengan garam. Sebaliknya, pengkondisian ketakutan kontekstual akut yang mengganggu nikotin dalam tikus NIC-Sired dan tidak mempunyai kesan pada tikus NIC-grandsire, yang mungkin menunjukkan fungsi kolinergik yang diubah dalam hippocampus.
Kesan pendedahan nikotin paternal pada pentadbiran sendiri nikotin berikutnya dalam generasi F1 juga menunjukkan gangguan fungsi kolinergik. Semasa pemerolehan pemberian sendiri nikotin IV pada dos yang lebih rendah, kumpulan tidak berbeza dalam bilangan infusi nikotin, walaupun peningkatan dalam bilangan penekan tuil aktif didapati dalam kumpulan NIC-Sired. Ini menunjukkan bahawa tikus NIC-Sired mungkin telah mempamerkan ketabahan dalam bertindak balas untuk ganjaran makanan dan / atau menurunkan fleksibiliti kognitif dalam peralihan bertindak balas daripada makanan kepada dadah. Walau bagaimanapun, adalah juga berfaedah untuk diperhatikan bahawa kumpulan tidak berbeza pada hari 1 pengeraman keinginan, yang mewakili sesi kepupusan (cth, tiada infusi nikotin semasa sesi), dan oleh itu, kesan ini nampaknya telah hadir apabila penguat ditukar tetapi tidak jika tiada penguat semasa sesi kepupusan. Tikus NIC-Sired juga mempamerkan penurunan pentadbiran diri nikotin pada dos sederhana, yang sejajar dengan kerja baru-baru ini mengenal pasti penurunan dalam alkohol, kokain, dan pentadbiran opioid yang berkaitan dengan alkohol ibu bapa, kokain, dan pendedahan morfin (contohnya Vassoler et al, 46 sebagai disemak dalam Goldberg dan Gould47). Pengurangan yang diperhatikan dalam pentadbiran sendiri nikotin mungkin dikaitkan dengan sama ada penurunan sensitiviti terhadap kesan ganjaran nikotin dan/atau peningkatan sensitiviti kepada kesan aversif nikotin. Sesungguhnya, kumpulan berbeza pada dos nikotin sederhana tetapi bukan dos nikotin yang lebih rendah, yang menyokong tanggapan peningkatan tindak balas aversif dengan dos yang lebih tinggi. Menariknya, kami juga mendapati kekurangan inkubasi keinginan pada hari ke-21 dalam tikus NIC-Sired berikutan pentadbiran sendiri pada dos sederhana, menunjukkan bahawa penurunan tingkah laku mencari nikotin boleh dikaitkan dengan ingatan yang berkaitan dengan keengganan untuk nikotin. Walaupun pelbagai substrat saraf mungkin mendasari kesan ini pada pengambilan nikotin dan tindak balas berkaitan kambuh semula, satu kajian baru-baru ini mendapati bahawa penurunan metiltransferase DNA di rantau CA1 hippocampal mengurangkan pentadbiran sendiri morfin.48 Penemuan ini, bersama-sama dengan fungsi yang diketahui fungsi hippocampal kolinergik dalam proses pembelajaran dan ingatan, seterusnya menyokong tanggapan pemprosesan pengantaraan nikotin yang terganggu dalam hippocampus tikus NIC-Sired.
Sepanjang garis ini, tikus NIC-Sired mempamerkan peningkatan pengikatan nAChR pertalian tinggi hippocampal. Kami juga mendapati pengurangan dalam pelepasan ACh yang ditimbulkan kalium dalam vHPC serta pelepasan ACh yang ditimbulkan nikotin dalam kedua-dua dHPC dan vHPC haiwan NIC-Sired. Perubahan dalam pelepasan ACh yang ditimbulkan penyahkutuban mencerminkan fungsi kolinergik yang diubah di hiliran pengikatan reseptor, manakala perubahan dalam pelepasan ACh yang ditimbulkan nikotin mencerminkan fungsi nAChR yang diubah. Data ini adalah selaras dengan penemuan sebelumnya tentang pengikatan nAChR pertalian tinggi terkawal berikutan penurunan fungsi nAChR.49 Oleh kerana kedua-dua pelepasan ACh yang ditimbulkan kalium dan yang ditimbulkan nikotin telah diubah dalam vHPC tikus NIC-Sired, vHPC mungkin lebih sensitif terhadap kesan multigenerasi pendedahan nikotin paternal. DHPC diketahui memodulasi pelaziman ketakutan kontekstual.31,50 Perencatan vHPC mengganggu kedua-dua keadaan ketakutan isyarat dan kontekstual dalam51,52 dan lesi kolinergik vHPC menjejaskan penyesuaian ketakutan isyarat.53
Herba cistanche
Kami juga telah menunjukkan bahawa penyerapan nikotin terus ke dalam dHPC meningkatkan penyesuaian ketakutan kontekstual manakala penyerapan ke dalam vHPC mengganggu penyesuaian ketakutan kontekstual.15 vHPC juga boleh memodulasi pemulihan spontan ingatan ketakutan kontekstual, kerana penyahaktifan litar vHPC-prelimbic mengurangkan pemulihan spontan ingatan ketakutan kontekstual. 54 Walaupun kawasan otak lain yang terlibat dalam pengkondisian ketakutan, seperti amygdala, 55 juga mungkin dipengaruhi oleh pendedahan nikotin paternal, penemuan ini bersama-sama dengan data sekarang menunjukkan bahawa perubahan dalam fungsi vHPC mungkin bertanggungjawab untuk mengubah keadaan ketakutan dalam tikus NIC-Sired. . Kami membuat hipotesis bahawa kesan multigenerasi pendedahan nikotin paternal mungkin berkaitan dengan perubahan dalam efektor transkrip yang bertindak di hulu sistem saraf ini. Penjujukan transkripsi genom dalam vHPC dan dHPC tikus generasi F1 mengenal pasti 1114 gen yang dinyatakan secara berbeza antara tikus NIC- dan SAL-Sired. Perbezaan ini adalah lebih besar dalam vHPC (952) berbanding dHPC (162), sejajar dengan perubahan yang lebih besar dalam vHPC berbanding dengan fungsi kolinergik dHPC dan perubahan kepada kedua-dua konteks dan penyesuaian ketakutan isyarat. Analisis laluan seterusnya mencadangkan perubahan luas kepada laluan transkrip yang dikaitkan dengan isyarat glukokortikoid dan perkembangan / keplastikan saraf di kedua-dua kawasan hippocampal.
Untuk mengenal pasti potensi penyesuaian khusus untuk vHPC, analisis laluan dilakukan hanya menggunakan transkrip khusus untuk sama ada subregion hippocampal. Tiada laluan kanonik IPA diperkaya bertindih antara vHPC dan dHPC, yang merupakan subkawasan berbeza dari segi fungsi hippocampus.31 Apabila gen yang bertindih antara dHPC dan vHPC dialih keluar, laluan kanonik diperkaya teratas yang unik untuk vHPC termasuk "Isyarat Penerima Glukokortikoid," mencadangkan , perubahan tambahan kepada fungsi glukokortikoid di rantau ini berbanding dengan dHPC. Dengan tujuan untuk mengenal pasti pengawal selia epigenetik huluan yang mungkin bertindak ke atas ekspresi gen, kami melakukan penjujukan metilasi DNA yang disasarkan menggunakan senarai terkumpul gen dHPC dan vHPC yang dinyatakan secara berbeza yang dikenal pasti daripada penjujukan RNA. Yang menghairankan, kami mendapati hanya 11 DMR dalam vHPC dan 30 DMR dalam dHPC antara haiwan NIC- dan SAL-Sired. Walaupun ini tidak dijangka memandangkan bilangan transkrip yang dinyatakan secara berbeza yang jauh lebih tinggi dalam vHPC, metilasi DNA hanyalah salah satu daripada beberapa faktor pengawalseliaan yang boleh memberi kesan kepada ekspresi gen dan metilasi DNA tidak secara konsisten diterjemahkan ke dalam ekspresi gen yang diubah.56 Daripada 11 vHPC DMR, tujuh mempamerkan corak metilasi selaras dengan arah transkripsi pembezaan (transkripsi berkurangan dengan peningkatan metilasi DNA dan peningkatan transkripsi dengan pengurangan metilasi). Gen metilasi yang berbeza dalam vHPC termasuk Fkbp5, Ksr1, dan Pnpla2. Menariknya, transkripsi Fkbp5 dan Ksr1 telah terganggu dalam satu model tetikus tingkah laku PTSD, 57 di mana tikus terdedah kepada kejutan kaki elektrik dan kemudian menyampaikan peringatan situasi. Fkbp5 mengekodkan pengawal reseptor glukokortikoid yang fungsinya telah dikaitkan dengan tindak balas tekanan berpanjangan maladaptif pada individu yang mengalami PTSD dan gangguan kecemasan yang lain.58
Khususnya, kajian manusia menunjukkan bahawa metilasi dan transkripsi Fkbp5 berkorelasi dengan keterukan gejala PTSD, sehingga peningkatan metilasi dan penurunan transkripsi meramalkan simptomologi PTSD yang lebih teruk.59,60 Ekspresi Fkbp5 memodulasi fungsi paksi HPA, yang dianggap sebagai pengantara penglibatannya dalam PTSD.59,61 Penemuan kami tentang pemulihan spontan memori ketakutan yang dipertingkatkan bersama-sama dengan disregulasi laluan transkrip yang dikaitkan dengan isyarat glukokortikoid dalam haiwan NIC-Sired mungkin menunjukkan peningkatan kerentanan kepada fenotip seperti PTSD. Dalam dHPC, corak DMR sebahagian besarnya tidak konsisten dengan arah ekspresi transkrip pembezaan yang ditemui oleh penjujukan RNA, yang menunjukkan bahawa perubahan dalam metilasi DNA vHPC yang dihasilkan oleh pendedahan nikotin paternal adalah lebih berbangkit dari segi ekspresi gen yang memberi kesan berbanding dengan dHPC. Ini adalah selaras dengan pengenalpastian kami terhadap lebih banyak transkrip yang dinyatakan secara berbeza dan perubahan yang lebih berlebihan dalam penghantaran kolinergik dalam NIC-Sired vHPC berbanding dengan dHPC. Pendekatan penjujukan sasaran kami mungkin mengehadkan keupayaan untuk mengesan peraturan transkrip yang berpotensi dengan urutan metilasi distal. Siasatan masa depan termasuk analisis metilasi DNA seluruh genom, pengubahsuaian histon, dan ekspresi RNA kecil akan memberikan tafsiran yang lebih lengkap tentang penemuan ini.
Had potensi reka bentuk pendedahan nikotin kami ialah tumpuan pada pendedahan nikotin paternal untuk menyiasat kesan pelbagai generasi dan transgenerasi pendedahan nikotin. Walaupun kajian lain menemui fenotip multi/transgenerasi berikutan pendedahan dadah paternal, termasuk kokain46 dan morfin, 62 mendapati tiada perbezaan dalam penjagaan ibu, ada kemungkinan pendedahan nikotin paternal boleh memberi kesan kepada penjagaan ibu. Kajian masa depan yang menyiasat kesan ke atas penjagaan ibu adalah wajar. Memandangkan tumpuan semasa kami adalah pada pendedahan bapa, kerja masa depan juga harus membandingkan kesan pendedahan bapa vs ibu. Secara keseluruhannya, penemuan ini memberikan pemahaman baru tentang kesan multigenerasi dan transgenerasi pendedahan nikotin, yang disokong oleh kesusasteraan yang semakin meningkat yang mencirikan kesan Multigenerasi dan transgenerasi pendedahan dadah (seperti yang disemak dalam Goldberg dan Gould47). Kajian ini adalah yang pertama untuk menguji penyesuaian ketakutan kontekstual dalam keturunan F1 dan F2 lelaki yang terdedah kepada nikotin dan mengenal pasti pembentukan ingatan ketakutan yang dipertingkatkan dan pemulihan ingatan ketakutan secara spontan. Kajian ini juga merupakan yang pertama untuk mengenal pasti perubahan pengambilan diri nikotin dan pengeraman keinginan dalam anak yang terdedah kepada nikotin F1.
Metilasi pembezaan dalam gen yang dikaitkan dengan disregulasi paksi PTSD dan HPA serta gangguan serentak dalam laluan transkrip berkaitan tekanan ditemui dalam tikus NIC-Sired. Nikotin bapa juga dikaitkan dengan penurunan fungsi kolinergik hippocampal dan peningkatan pengikatan nAChR hippocampal. Menariknya, pesakit PTSD yang tidak merokok menunjukkan pengikatan nAChR afiniti tinggi kortikal mesiotemporal yang lebih tinggi dengan ketara, dan PTSD dikaitkan dengan penyaman ketakutan yang lebih besar dan pemulihan spontan kenangan ketakutan yang terpadam.64 Bersama-sama, penemuan kami mencadangkan bahawa pendedahan nikotin mungkin mempunyai kesan berbilang generasi meningkatkan kerentanan anak kepada simptomologi seperti PTSD. Penemuan ini bersama-sama dengan penemuan baru-baru ini yang menunjukkan kesan berbilang generasi pendedahan nikotin terhadap fleksibiliti kognitif2 menunjukkan bahawa hasil kesihatan negatif pendedahan nikotin menghasilkan jaringan yang lebih luas daripada yang difikirkan sebelumnya.
Ekstrak cistanche
RUJUKAN
1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Pendedahan nikotin paternal mentakrifkan tingkah laku yang berbeza dalam generasi berikutnya melalui hipermetilasi mmu-miR- 15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.
2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. Pendedahan nikotin pada tikus jantan menghasilkan kemerosotan tingkah laku dalam beberapa generasi keturunan. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.
3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Penghantaran transgenerasi hiperaktif dalam model tetikus ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768‐2773.
4. Cummings KM, Proctor RN. Perubahan imej awam merokok di Amerika Syarikat: 1964-2014. Penanda Bio Epidemiol Kanser Sebelumnya. 2014;23(1):32-36.
5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Penggunaan rokok elektronik dalam kalangan pelajar sekolah menengah dan kaitannya dengan penggunaan rokok dan berhenti merokok, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 dan 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.
6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Kesan jangka panjang nikotin kronik pada tingkah laku emosi dan kognitif dan morfologi sel hippocampus pada tikus: perbandingan pendedahan nikotin dewasa dan remaja. Eur J Neurosci. 2016;44:2818–2828.
7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Persatuan antara merokok dan gangguan kecemasan semasa remaja dan awal dewasa. JAMA. 2000;284:2348–2351.
8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. Mekanisme epigenetik mengantara kesan nikotin perkembangan pada struktur dan tingkah laku neuron. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.
9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Kolin memperbaiki defisit pembelajaran dewasa dan membalikkan pengubahsuaian epigenetik faktor pembentukan semula kromatin yang berkaitan dengan pendedahan nikotin remaja. Neurobiol Belajar Mem. 2018;155:239–248.
10. Burung A. Persepsi epigenetik. alam semula jadi. 2007;447:396-398.
11. Skinner MK. Warisan transgenerasi epigenetik alam sekitar dan kestabilan mitosis epigenetik somatik. Epigenetik. 2011;6:838–842.
12. Davis JA, Gould TJ. Pembelajaran bersekutu, hippocampus, dan ketagihan nikotin. Penyalahgunaan Dadah Curr Rev. 2008;1:9–19.
13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Ketagihan nikotin dan gangguan psikiatri. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171–208.
14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Disfungsi nAChR sebagai substrat biasa untuk skizofrenia dan ketagihan nikotin komorbid: trend dan perspektif semasa. Schizophr Res. 2016;171:1–15.
15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Reseptor nikotinik dalam hippocampus dorsal dan ventral secara berbeza memodulasi penyesuaian ketakutan kontekstual. Hippocampus. 2012;22:1681–1690.
16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Latar belakang genetik mempengaruhi kesan penarikan diri daripada nikotin kronik pada pembelajaran dan pengikatan reseptor asetilkolin nikotinik afiniti tinggi dalam hippocampus dorsal dan ventral. Psikofarmakologi (Berl). 2013;225(1): 201–208.
17. Davis JA, Gould TJ. Kesan DHBE dan MLA pada peningkatan yang disebabkan oleh nikotin bagi penyaman ketakutan kontekstual dalam tikus C57BL/6. Psikofarmakologi (Berl). 2006;184:345-352.
18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Tikus pra-remaja dan remaja kurang sensitif terhadap kesan nikotin akut terhadap kepupusan dan pemulihan spontan. Lembu Res Otak. 2018;138:50–55.
19. Kutlu MG, Gould TJ. Nikotin akut menangguhkan kepupusan ketakutan kontekstual pada tikus. Behav Brain Res. 2014;263:133–137.
20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P ke-3. Kimia nikotin, metabolisme, kinetik, dan biomarker. Dalam: psikofarmakologi nikotin. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009:29–60.
21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Penarikan diri daripada pentadbiran nikotin kronik menjejaskan penyaman ketakutan kontekstual dalam tikus C57BL/6. J Neurosci. 2005;25:8708–8713.
22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Kajian perbandingan tentang pelupusan nikotin dan metabolitnya dalam tiga strain tikus baka. Pelupusan Metab Dadah. 1984;12:725–731.
23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et al. Tempoh defisit berkaitan pengeluaran nikotin dalam penyesuaian ketakutan kontekstual selari dengan perubahan dalam pengawalan reseptor asetilkolin nikotinik perkaitan tinggi hippocampal. Neurofarmakologi. 2012;62:2118–2125.
24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Kemerosotan kepupusan ketakutan kontekstual oleh nikotin kronik dan penarikan diri daripada nikotin kronik dikaitkan dengan regulasi nAChR hippocampal. Neurofarmakologi. 2016;109:341–348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Pencirian pengeluaran nikotin spontan dan mendakan dalam tetikus. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526–534.
26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Isyarat subunit reseptor nikotinik alpha5 habenular mengawal pengambilan nikotin. alam semula jadi. 2011;471:597–601.
27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Analisis kuantitatif reseptor nikotinik neuron heteromerik dalam hippocampus tikus. J Neurochem. 2010;115:625–634.
28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Kesan seperti anxiolytic selari dan regulasi reseptor asetilkolin nikotinik neuron berikutan nikotin dan vareniklin kronik. Nikotin Tob Res. 2011;13:41–46.
29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontal beta2 yang mengandungi subunit dan reseptor asetilkolin nikotinik alpha7 secara berbeza mengawal isyarat glutamatergik dan kolinergik. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.
30. Parikh V, Starter M. Sistem kolinergik forebrain dan kognisi: pandangan baharu berdasarkan pengesanan pantas pancang kolin menggunakan biosensor berasaskan enzim. Dalam: Biosensor Mikroelektrod. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257–277.
31. Fanselow MS, Dong HW. Adakah hippocampus dorsal dan ventral mempunyai struktur yang berbeza secara fungsi? Neuron. 2010;65(1):7–19.
32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: penjajaran tepat transkriptom dengan kehadiran sisipan, pemadaman dan gabungan gen. Biol Genom. 2013;14(4): R36.
33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Platform Galaxy untuk analisis bioperubatan yang boleh diakses, boleh dihasilkan semula dan kolaboratif: kemas kini 2016. Asid Nukleik Res. 2016;44:W3‐w10.
34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Perhimpunan transkrip dan kuantifikasi oleh RNA‐Seq mendedahkan transkrip tanpa nota dan penukaran isoform semasa pembezaan sel. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.
35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Mengawal kadar penemuan palsu dalam penyelidikan genetik tingkah laku. Behav Brain Res. 2001; 125(1–2):279–284.
36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Pendekatan analisis sebab dalam Analisis Laluan Kepintaran. Bioinformatik. 2014;30(4): 523-530.
37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: kemas kini pelayan web analisis pengayaan set gen komprehensif 2016. Asid Nukleik Res. 2016;44(W1): W90‐W97.
38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Penjujukan bisulfit yang disasarkan menggunakan sistem pengayaan epi SeqCap. Kaedah Mol Biol. 2018;1708:383–405.
39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: perapi fleksibel untuk data jujukan Illumina. Bioinformatik. 2014;30(15):2114‐2120.
40. Langmead B, Salzberg SL. Penjajaran cepat bergap-baca dengan Bowtie 2. Kaedah Nat. 2012;9(4):357-359.
41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: penjajar fleksibel dan pemanggil metilasi untuk aplikasi Bisulfite‐Seq. Bioinformatik. 2011;27(11):1571‐1572.
42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: pakej R komprehensif untuk analisis profil metilasi DNA seluruh genom. Biol Genom. 2012;13(10): R87.
43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin meningkatkan penyesuaian ketakutan kontekstual dan memperbaiki defisit akibat etanol dalam penyesuaian ketakutan kontekstual. Kelakuan Neurosci. 2003;117(6):1276‐1282.
44. CD Fowler, Kenny PJ. Pentadbiran sendiri nikotin intravena dan pengembalian semula akibat isyarat pada tikus: kesan dos nikotin, kadar penyerapan dadah dan latihan instrumental sebelumnya. Neurofarmakologi. 2011;61(4):687‐698.
45. Gould TJ, Wehner JM. Peningkatan nikotin bagi pelaziman ketakutan kontekstual. Behav Brain Res. 1999;102(1–2):31–39.
46. Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Warisan epigenetik fenotip rintangan kokain. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.
47. Goldberg LR, Gould TJ. Kesan multigenerasi dan transgenerasi pendedahan bapa kepada dadah penyalahgunaan ke atas fungsi tingkah laku dan saraf. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453‐2466.
48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. DNMT3a dalam hippocampal CA1 adalah penting dalam pemerolehan pentadbiran diri morfin dalam tikus. Penagih Biol. 2019;▪:▪‐▪.
49. Schwartz RD, Kellar KJ. Tapak pengikat reseptor kolinergik nikotinik di otak: peraturan dalam vivo. Sains. 1983;220(4593):214‐216.
50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Lesi hippocampal menyebabkan defisit pembelajaran pada tikus baka dalam maze air Morris dan tugas ketakutan-terkondisi. Kelakuan Neurosci. 1997;111(1):104-113.
51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Hippocampus ventral dan penyaman ketakutan dalam tikus: amnesia anterograde ketakutan yang berbeza selepas penyerapan N-metil-D-aspartat atau antagonis bukan kompetitif MK-801 ke dalam hippocampus ventral. Behav Brain Res. 2001;126(1–2):159–174.
52. Maren S, Holt WG. Pengkondisian ketakutan Hippocampus dan Pavlovian pada tikus: infusi muscimol ke dalam ventral, tetapi bukan dorsal, hippocampus menjejaskan pemerolehan pembekuan bersyarat kepada rangsangan bersyarat pendengaran. Kelakuan Neurosci. 2004;118(1):97-110.
53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Gangguan septum medial dan jalur pepenjuru unjuran kolinergik Broca ke hippocampus ventral mengganggu ingatan ketakutan pendengaran. Neurobiol Belajar Mem. 2018;152:71–79.
54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Pengaktifan khusus laluan sel hippocampal ventral yang menonjol ke korteks prelimbic mengurangkan pembaharuan ketakutan. Neurobiol Belajar Mem. 2019;161:63–71.
55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Nukleus amygdaloid sisi: antara muka deria amigdala dalam pengkondisian ketakutan. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.
56. Jones PA. Fungsi metilasi DNA: pulau, tapak permulaan, badan gen dan seterusnya. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484‐492.
57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et al. Peraturan gen yang bergantung kepada wilayah dan masa dalam amygdala dan korteks cingulate anterior model tetikus seperti PTSD. Otak Mol. 2019;12(1):25.
58. Pengikat EB. Peranan FKBP5, pendamping bersama reseptor glucocorticoid dalam patogenesis dan terapi gangguan afektif dan kebimbangan. Psikoneuroendokrinologi. 2009;34(Bekalan 1): S186‐S195.
59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Penanda genetik untuk risiko PTSD dan daya tahan dalam kalangan mangsa yang terselamat daripada serangan Pusat Dagangan Dunia. Penanda Dis. 2011;30(2–3):101–110.
60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Biomarker epigenetik sebagai peramal dan korelasi penambahbaikan gejala berikutan psikoterapi dalam veteran pertempuran dengan PTSD. Psikik Depan. 2013;4:118.
61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Corak ekspresi gen yang dikaitkan dengan gangguan tekanan posttraumatic berikutan pendedahan kepada serangan Pusat Dagangan Dunia. Psikiatri Biol. 2009;66:708–711.
62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et al. Perkembangan tingkah laku seperti kebimbangan melalui isyarat IGF-2 hippocampal dalam keturunan pendedahan morfin ibu bapa: kesan persekitaran yang diperkaya. Neuropsychopharmacology. 2014;39(12):2777‐2787.
63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. Beta2 Ketersediaan reseptor asetilkolin nikotinik dalam gangguan tekanan selepas trauma. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419‐424.
64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Asas neurobiologi kegagalan untuk mengingati ingatan kepupusan dalam gangguan tekanan selepas trauma. Psikiatri Biol. 2009;66(12):1075‐1082.
