Bahagian2: Kesan Renovaskular Nitrat Tak Organik Berikutan Iskemia-reperfusi Buah Pinggang

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

3. Keputusan

3.1.Suplemen nitrat meningkatkan penanda bioaktiviti NO dan melemahkan disfungsi buah pinggang berikutan IR

Tahap nitrat dan nitrit telah meningkat dan cGMP cenderung meningkat pada tikus selepas rawatan nitrat (Rajah 1A-C). Disfungsi buah pinggang, seperti yang dicerminkan oleh perubahan dalam BUN dan GFR, juga diperbaiki oleh nitrat (Rajah 1D dan E).

3.2. Nitrat melemahkan tindak balas tekanan darah dan tahap Ang II buah pinggang selepas IR

Selepas dua minggu reperfusi, tekanan darah meningkat sedikit dalam kumpulan IR berbanding dengan kawalan yang dikendalikan secara palsu. Rawatan dengan nitrat menghalang peningkatan tekanan darah ini (Rajah 2A-C). Untuk menyiasat pautan kepada perubahan dalam sistem renin-angiotensin kami mengukur tahap Ang II dalam plasma dantisu buah pinggang. Data kami menunjukkan bahawa Ang II dalam plasma adalah serupa di kalangan kumpulan, meningkat dalam buah pinggang iskemia, tetapi tidak berubah dengan ketara dalam buah pinggang bukan iskemia (Rajah 2D-F). Nitrat menghalang peningkatan Ang Ⅱ dalam tisu buah pinggang berikutan IR, yang mungkin menyumbang kepada kesannya terhadap tekanan darah.

Klik untuk mengetahui maklumat lanjut. tentang faedah cistanche

3.3. Nitrat memperbaiki perubahan histopatologi buah pinggang, keradangan, dan apoptosis selepas IR

Seterusnya, kami menganalisis perubahan histopatologi buah pinggang selepas IR dengan menggunakan pewarnaan H&E dan PAS. Kumpulan IR menunjukkan kerosakan glomerular yang mendalam digabungkan dengan nekrosis tiub berbanding dengan kawalan dikendalikan palsu (Rajah 3A-F dan Jadual 1). Tikus IR yang dirawat dengan nitrat mempunyai perubahan histopatologi yang kurang ketara, seperti yang terbukti daripada pembentukan tuangan yang kurang, nekrosis, pecah ektasia. membran bawah tanah tiub, dan lebih banyak penjanaan semula tiub dan tubul nekrotik dalam penjanaan semula (Rajah 3A-F dan Jadual 1). Selain itu, imunostaining F4/80 menunjukkan penyusupan besar makrofaj dalam buah pinggang iskemia berikutan IR, yang dihalang oleh rawatan nitrat (Rajah 4A dan B). Pewarnaan TUNEL, untuk mengesan apoptosis, telah meningkat dengan ketara selepas kecederaan IR, yang sekali lagi dikurangkan dengan ketara oleh nitrat (Rajah 4C dan D)[6].

3.4 Nitrat meningkatkan kecederaan mitokondria selepas IR buah pinggang melalui mekanisme yang memulihkan pemulihan tahap protein TFAM

Keabnormalan dan disfungsi mitokondria buah pinggang, ditambah dengan pengeluaran ROS yang berlebihan, terlibat dalam patogenesis dos buah pinggang. termasuk AN [27.28]. Data kami menunjukkan bahawa faktor transkripsi mitokondria A (TFAM). yang merupakan pengawal selia utama ekspresi gen mitokondria [29], telah berkurangan dengan ketara dalam buah pinggang IR (Hg.5A-C). Rawatan nitrat tidak dikaitkan dengan sebarang perubahan ketara dalam TFAM dalam buah pinggang IR tetapi meningkatkan ekspresinya dalam buah pinggang bukan iskemik berikutan IR (Rajah 5A-C).

3.5. Rawatan nitrat melemahkan pengecutan Ang II yang disebabkan oleh arteri interlobar dan arteri aferen berikutan R buah pinggang

Seterusnya, kami menggunakan teknik miografi untuk menilai kesan IR pada fungsi vaskular dalam saluran intrarenal besar buah pinggang kiri selepas reperfusi. Penguncupan kepada phenylephrine tidak jauh berbeza antara kumpulan eksperimen (Rajah 6A). Walau bagaimanapun, penguncupan akibat Ang I meningkat dengan ketara dalam buah pinggang IR (Hg.6B), yang dihalang oleh rawatan nitrat. Dalam arteriol aferen yang terpencil dan perfused (Rajah 6C), sensitiviti dan tindak balas kontraktil maksimum kepada Ang II juga meningkat dalam buah pinggang IR, yang sebahagian besarnya dihalang oleh rawatan nitrat(1. 6D)

3.6. Apoptosis sel yang diinsuranskan oleh Fipoxia-Treoxygenation dan keabnormalan mi chandl dalam sel endothelial glomerular dipulihkan dengan

Dalam kajian mekanistik vaskular lanjut. bertujuan untuk meniru model in vivo IR, kami menggunakan GEC. Dalam kajian sel ini kami menggunakan nitrit dan bukannya nitrat untuk memintas, langkah pertama dalam laluan nitrat-nitrit-NOyang memerlukan bakteria komensal dalam vivo. Hipoksia diikuti dengan reoksigenasi dalam GEC mengurangkan daya maju sel/peningkatan kematian (Fg.7A dan B).

Ini dikaitkan dengan peningkatan tahap caspase terbelah-3, pengurangan kompleks mitokondria IⅡ dan ekspresi TFAM(Rajah.7C-G), dan pengeluaran ROS mitokondria, seperti yang ditunjukkan oleh MitoSox(Rajah 7H). Kesemua keabnormalan yang berkaitan dengan hipoksia dan reoksigenasi ini telah diperbaiki dengan rawatan serentak dengan nitrit.

Data in vivo kami menunjukkan bahawa kecederaan vaskular yang disebabkan oleh IR dan disfungsi digabungkan dengan peningkatan tahap dan kepekaan Ang II buah pinggang (Rajah 2E dan 6B dan D). Dengan kehadiran Ang I, hipoksia-reoksigenasi mengurangkan daya maju sel dan meningkatkan lagi mitokondria. Pengeluaran ROS (Rajah S1 dan Rajah.8), yang sekali lagi dikurangkan dengan rawatan nitrit.

3.7. Kesan perlindungan nitrit berikutan hipoksia-reoksigenasi dalam sel endothelial glomerular dihapuskan dengan perencatan xanthine oxidoreductase

XOR dianggap sebagai salah satu enzim utama yang terlibat dalam pengurangan nitrit kepada NO dan spesies nitrogen oksida bioaktif lain. Di sini kami menunjukkan bahawa, dengan kehadiran febuxostat perencat XOR terpilih, kesan berfaedah nitrit pada daya maju sel, ekspresi TFAM, dan ROS mitokondria (Rajah.9A-D) berikutan hipoksia-reoksigenasi yang digabungkan dengan Ang I dalam GEC telah dimansuhkan. Data tentang daya maju sel jika tiada Ang II dalam kumpulan kenderaan ditunjukkan dalam Rajah S2.

4. Perbincangan

Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa rawatan nitrat tak organik sejurus sebelumiskemia buah pinggangmengurangkan kerosakan glomerular dan tubular dengan ketara serta kehilangan fungsi buah pinggang selepas 2 minggu reperfusi. Kesan positif nitrat ini dikaitkan dengan tindak balas keradangan dan angiotensin II yang lembap, ditambah pula dengan modulasi mitokondria.tekanan oksidatifdan daya maju sel.

Ini adalah penerangan pertama tentang cara meningkatkan laluan nitrat-nitrit-NO sebelum kejadian iskemia boleh melindungi buah pinggang daripada disfungsi dan kecederaan buah pinggang dan endothelial yang berkaitan dengan reperfusi berikutnya.

Penjanaan NO yang diperolehi NOS adalah penting untuk banyak kardiovaskular danfungsi buah pinggang, termasuk modulasi tekanan darah dan autoregulasi buah pinggang serta pengendalian elektrolit tiub [30-32]. Walau bagaimanapun, dalam keadaan dengan ketegangan oksigen yang rendah dan pH yang rendah, sistem enzimatik ini terjejas yang membawa kepada kekurangan NO atau bahkan melepaskan NOS, yang meningkatkan pengeluaran spesies oksigen reaktif [6,30]. Laluan alternatif nitrat-nitrit-NO adalah bebas daripada sistem NOS dan boleh dirangsang melalui diet harian kita. Yang penting, kecekapan laluan nitrat-nitrit-NO sangat dipertingkatkan dalam keadaan iskemia atau hipoksia apabila sistem NOS terjejas [9,33]. Kajian eksperimen dan klinikal telah menunjukkan kesan kardiovaskular yang menggalakkan daripada suplemen nitrat, termasuk fungsi endothelial yang lebih baik dan pengurangan tekanan darah dalam individu normotensif dan hipertensi [1]. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa mikrovaskulatur buah pinggang sangat responsif kepada vasodilatasi pengantara nitrit [23], terutamanya semasa keadaan oksigen berasid dan rendah yang meniru persekitaran iskemia in vivo [20]. Diambil bersama, penemuan ini mencadangkan bahawa rawatan nitrat mungkin dikaitkan dengan perlindungan organ berikutan IR.

Kajian terdahulu menggunakan campur tangan nitrit telah menghasilkan keputusan yang agak bercanggah mengenai nilai terapeutiknya dalam model tikus kecederaan IR [16,17,34,35]. Triptatara et al. menunjukkan bahawa pentadbiran topikal buah pinggang akut nitrit (30 nmol)melindungi buah pinggang tikus daripada 60 min iskemia dua hala dan kecederaan akibat reperfusi 6j dan disfungsi dalam vivo, sekurang-kurangnya sebahagiannya, melalui XOR- pengeluaran NO bergantung [16]. Menggunakan pendekatan transgenik tetikus, penemuan oleh Milsom et al. mencadangkan bahawa eNOS adalah pemain penting, dengan menyumbang kepada pengurangan nitrit semasa IR, dengan itu mengantara perlindungan [35]. Dalam persetujuan, Cantor dan rakan sekerja menunjukkan bahawa pentadbiran sistemik akut nitrit (0.172 diikuti dengan 0.057 mg/j/kg) telah meningkatkan dengan ketara reoksigenasi dan reperfusi buah pinggang berikutan iskemia unilateral (45 min) dan 60 minit reperfusi pada tikus [ 34]. Sebaliknya, Basireddy et al.tidak memerhatikan sebarang kesan perlindungan daripada pentadbiran sistemik akut nitrit (0.12-12 nmol/g/kg) dalam tikus yang mengalami nefrektomi unilateral diikuti oleh 45 minit iskemia buah pinggang yang tinggal dan 24-48 h reperfusi [17]. Penjelasan yang mungkin untuk percanggahan ini mungkin pendekatan eksperimen yang berbeza (iaitu model IR, tempoh tempoh IR), rejim dos, laluan pentadbiran dan perbezaan spesies. Pada masa ini, terdapat kurang pengetahuan mengenai nilai terapeutik menggunakan nitrat bukan organik dan bukannya nitrit. Nitrat boleh ditadbir dengan selamat dalam dos yang lebih tinggi daripada nitrit dan mempunyai separuh hayat yang lebih lama (6 jam berbanding 30 min), yang membolehkan pembentukan berterusan nitrit, NO dan nitrogen oksida bioaktif lain dalam tempoh yang lebih lama. Dalam konteks ini, nitrat mungkin dianggap sebagai prodrug untuk penjanaan nitrit yang lebih berterusan.

Dalam kajian tetikus sebelumnya, kami menunjukkan bahawa prarawatan nitrat diet selama 2 minggu melindungi buah pinggang daripada kecederaan IR melalui mekanisme yang melibatkan modulasi fenotip sel imun dan sifat anti-oksidatif [18]. Daripada meniru senario pengambilan nitrat tinggi kronik, kajian semasa menguji kesan pentadbiran akut sebelum penghinaan iskemia. Pendekatan ini lebih menarik dari perspektif klinikal dan terapeutik, kerana ini boleh menyerupai campur tangan akut sebelum iskemia pada pesakit yang berisiko mendapat AKI. Kajian semasa kami menunjukkan bahawa rawatan nitrat akut diikuti dengan suplemen pemakanan nitrat yang berterusan selama 2 minggu dengan ketara meningkatkan paras nitrat, nitrit dan cGMP dalam edaran. Analisis morfologi menunjukkan bahawa rawatan nitrat memperbaiki kecederaan yang disebabkan oleh IR berbanding dengan kawalan IR yang tidak dirawat. Bersama-sama dengan mengurangkan kerosakan struktur buah pinggang, rawatan nitrat mengekalkan fungsi buah pinggang selepas kecederaan IR. Kerana kreatinin plasma biasanya kembali ke paras normal seminggu selepas reperfusi [36,37, kami mengukur BUN dan GFR untuk menilai fungsi buah pinggang selepas 2 minggu reperfusi. GFR dan BUN tidak berubah dengan ketara berikutan IR berbanding dengan kawalan yang dikendalikan secara palsu, yang mungkin dijelaskan oleh buah pinggang pampasan kontralateral. Walau bagaimanapun, data kami menunjukkan bahawa kedua-dua parameter ini telah diperbaiki dengan ketara oleh nitrat berbanding dengan kumpulan IR yang tidak dirawat.

Tindak balas keradangandan apoptosis sel adalah proses biologi utama semasa kecederaan IR, yang menyumbang kepada pembersihan serpihan selular dan pembaikan tisu yang mencukupi [18,24]. Walau bagaimanapun, keradangan yang berpanjangan dan tidak dapat diselesaikan boleh memburukkan lagi kecederaan tisu [7,38,39].Keradangan buah pinggang, seperti yang dikesan oleh pewarnaan F4/80 penyusupan makrofaj, telah dikurangkan dengan ketara oleh nitrat berikutan IR. Ini adalah bersetuju dengan kajian yang diterbitkan baru-baru ini oleh Yang et al. [18] dan Khambata et al. [40] Selain itu, ujian TUNEL untuk apoptosis menjelaskan bahawa kecederaan IR meningkatkan apoptosis sel dalam buah pinggang iskemia tikus, yang sebahagiannya dihalang oleh rawatan nitrat. Diambil bersama, keputusan ini jelas menunjukkan bahawa rawatan nitrat boleh menghalang keradangan buah pinggang dan apoptosis sel yang berlaku selepas IR.

Bukti terkumpul menunjukkan bahawa disfungsi mitokondria menyumbang kepada perkembangan AKI berikutan IR, dan pendekatan baharu yang memodulasi fungsi mitokondria mungkin mempunyai nilai terapeutik [41-45]. Sebagai contoh, dalam buah pinggang iskemia, mitokondria dalam sel endothelial diubah dengan ketara dari segi fungsi dan morfologi, dan menjadi sangat reaktif dan merosakkan diri mereka sendiri dan juga mitokondria di sekeliling [44]. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa nitrat pemakanan meningkatkan kecekapan mitokondria pada manusia [46]. Rangsangan laluan nitrat-nitrit-NO dalam beberapa kajian eksperimen baru-baru ini telah dikaitkan dengan kesan yang menggalakkan pada fungsi mitokondria semasa gangguan metabolik, termasuk diabetes jenis 2, melalui mekanisme yang melibatkan pelembab tekanan oksidatif [47]. Selain itu, Shiva dan rakan sekerja telah menunjukkan bahawa kedua-dua rawatan pra-dan akut dengan nitrit tak organik mempunyai kesan sitoprotektif dan berpotensi mengehadkan kecederaan reperfusi jantung dan hepatik melalui modulasi rantai pengangkutan elektron mitokondria dan pengurangan ROS [48]. Dalam model in vivo IR kami, TFAM telah meningkat dalam buah pinggang bukan iskemia, tetapi tidak berubah dengan ketara dalam buah pinggang iskemia. Memandangkan nitrit memulihkan ekspresi TFAM secara in vitro berikutan hipoksia-reoksigenasi, kami membuat spekulasi bahawa ini boleh dikaitkan dengan perbezaan yang bergantung kepada masa dalam ekspresi. Dalam model in vivo, analisis TFAM hanya dibuat selepas 2 minggu dan ada kemungkinan bahawa ini akan berbeza pada titik masa yang lebih awal selepas reperfusi.

Isyarat Ang I yang meningkat diketahui secara meluas untuk merangsang NADPH oksidase dan pengeluaran ROS terbitan mitokondria, yang membawa kepada tekanan oksidatif [49-51]. Cao dan rakan sekerja menunjukkan bahawa refleks reno-cerebral mengaktifkan sistem renin-angiotensin berikutan IR, yang menggalakkan tekanan oksidatif dan perkembangan kecederaan buah pinggang [52]. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa rawatan nitrat melembapkan penguncupan pengantara Ang I dalam arteriol aferen renal dan hipertensi melalui mekanisme yang melibatkan pengurangan hiperaktif simpatetik dan pelembab tekanan oksidatif, serta pengurangan ekspresi reseptor jenis Ang 1 [{{7} }]. Selaras dengan penemuan sebelumnya, data kami menunjukkan bahawa rawatan nitrat mengurangkan tekanan darah yang dikaitkan dengan tahap Ang II yang lebih rendah dalam buah pinggang berikutan IR dan mengecutkan penguncupan pengantara Ang IⅡ dalam kedua-dua arteri interlobar dan arteriol aferen.

Oleh kerana keabnormalan sel endothelial berikutan IR berkait rapat dengan kecederaan buah pinggang dan fungsi buah pinggang yang terjejas, kami seterusnya menggunakan sel endothelial glomerular (GEC) untuk kajian mekanistik. Model in vitro hypoxia-reoxygenation, dengan dan tanpa rawatan nitrat serentak, digunakan untuk meniru senario in vivo IR. Keputusan in vitro kami menunjukkan bahawa hypoxia-reoxygenation meningkatkan kematian sel, pengeluaran ROS mitokondria, dan caspase terbelah-3, mengurangkan daya maju sel dan ekspresi protein kompleks OXPHOS I dan TFAM. Semua perubahan abnormal ini telah diperbaiki dengan ketara oleh nitrit.

Oleh kerana data in vivo kami menunjukkan bahawa tahap Ang I meningkat dalam buah pinggang berikutan IR, kami juga mengkaji kesan rawatan nitrit dalam GEC berikutan hipoksia-reoksigenasi dengan kehadiran Ang. Data kami menunjukkan bahawa hipoksia-reoksigenasi dalam kombinasi dengan Ang I terus menurunkan daya maju sel dan meningkatkan pengeluaran ROS mitokondria, yang sekali lagi dihalang oleh rawatan nitrat serentak.

Semasa normoxia dan pH normal, NO yang diperolehi NOS dioksidakan kepada nitrit dan nitrat, tetapi semasa keadaan hipoksia dan berasid, nitrit boleh dikurangkan kembali kepada NO oleh tindakan reduktase nitrit XOR. Inkubasi bersama dengan perencat XOR terpilih febuxostat menghapuskan kesan perlindungan nitrit berikutan hipoksia-reoksigenasi dalam GEC. Data ini mencadangkan bahawa XOR memangkinkan pengurangan nitrit kepada NO, yang seterusnya mengantara perlindungan sel daripada kecederaan akibat hipoksia-reoksigenasi.

Beberapa batasan kajian semasa termasuk bahawa kumpulan dengan rawatan nitrat sahaja dalam haiwan yang dikendalikan secara palsu tidak disertakan. Sebab utama untuk ini adalah bahawa kajian terdahulu dalam tikus dan tikus biasa tidak melihat sebarang kesan mendalam, menggunakan dos nitrat yang sama, pada tekanan darah, fungsi buah pinggang, atau kereaktifan vaskular. Batasan lain ialah semua pencirian in vivo dibuat hanya selepas dua minggu reperfusi. Titik masa tambahan berpotensi menjana lebih banyak cerapan mekanistik.

Kesimpulannya, rawatan akut dengan nitrat tak organik sebelum kejadian iskemia buah pinggang, diikuti dengan rawatan pemakanan nitrat yang berterusan selama dua minggu reperfusi, dilindungi daripada disfungsi buah pinggang dan kecederaan melalui mekanisme yang melibatkan pengurangan sel-sel radang yang menyusup dan paras angiotensin I dalam iskemia. buah pinggang serta modulasi fungsi mitokondria. Ujian klinikal masa depan boleh menjelaskan jika campur tangan dengan nitrat tak organik boleh memberikan kesan yang bermanfaat pada pesakit yang berisiko tinggi untuk mendapat kecederaan IR buah pinggang.