Bahagian2: Pendekatan Novel Untuk Meningkatkan Potensi Penjanaan Semula Sel-sel Progenitor Endothelial yang Beredar dalam Pesakit Dengan Penyakit Buah Pinggang Peringkat Akhir

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

3. Keputusan

3.1.Demografi Pesakit

Subjek kawalan dan pesakit ESKD termasuk dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual 1. Parameter demografi pesakit ESKD termasuk ketinggian dan berat badan, vintaj dialisis, etiologi penyakit, dan penggunaan alkohol telah direkodkan dan dikumpulkan daripada rekod perubatan yang disimpan oleh Monash Health. , Clayton, Victoria, Australia.

Walaupun kultur EPC lewat daripada semua {{0}}} pesakit yang sihat berjaya diperolehi (daripada hasil ~1.5±0.3× 10 darjah sel/mL darah), data diperoleh daripada n=6-7 budaya yang diperolehi pesakit yang berasingan bagi setiap kumpulan rawatan untuk melengkapkan pelbagai ujian yang dijalankan. Walau bagaimanapun, hanya lima kultur EPC daripada n=11 sampel darah yang diperoleh pesakit ESKD matang menjadi EPC lewat (daripada hasil ~2.2±0.3×10 darjah sel/mL darah), daripada mana data diperoleh daripada n =3-5 budaya yang diperolehi pesakit berasingan bagi setiap kumpulan rawatan. Selain itu, bilangan EPCcoloni yang diperoleh daripada pesakit ESKD (4.3±1.9;p<0.01 vs.="" epccolonies="" derived="" from="" patients)was="" significantly="" lower="" than="" those="" obtained="" from="" healthy="" patients="" (19.3±8.6;="" n="4" samples="" per="">

Klik di sini untuk mengenali desert ginseng cistanche

3.2. Analisis Fungsional EPC Diperoleh daripada Pesakit Kawalan

EPC lewat yang diperoleh dan dibiakkan daripada lelaki yang sihat menyatakan reseptor RXFP1 pada permukaan sel mereka, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A. EPC lewat menunjukkan peningkatan ketara dalam kapasiti proliferatif (sebanyak~43 peratus) selepas 24 jam (Rajah 1B); Pembentukan tiub akibat EPC (seperti yang ditentukan oleh panjang tiub (sebanyak~45 peratus) dan bilangan dahan, simpang dan jerat (sebanyak~60-90 peratus) selepas 4 jam (Rajah 1C) dan penyembuhan luka akibat EPC ( sebanyak~60 peratus )selepas 8 jam (Rajah 1D), berbanding sel yang tidak dirawat apabila dirangsang oleh 10ng/mL RLX(semua p<0.05 vs.unstimulated="" cells),="" but="" not="" by="" 25%="" bm-msc-cm="" or="" 1="" ng/ml="">

Yang menarik, kesan gabungan 25 peratus BM-MSC-CM dan 10 ng/ml RLX meningkatkan lagi percambahan EPC (sebanyak~1.3-lipat;p<0.001 vs.25%="" bm-msc-cm="" or="" 10="" ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 1b),="" epc-induced="" tube="" formation="" (including="" tube="" length="" (by~65%)and="" the="" number="" of="" branches,="" junctions="" and="" meshes="" (by~1.1-2.4-fold;="" figure="" 1c)="" over="" the="" same="" time-period="" and="" epc-induced="" wound="" healing="" (by="" ~87-88%)="" after="" 4-8="" h=""><0.01 vs.25%bm-msc-cm="" after="" 8="" h;="" figure="">

Secara perbandingan, 20 peratus serum lembu janin (kawalan positif) merangsang pembiakan EPC (sebanyak~60 peratus) selepas 24 jam (p<0.001 vs.="" unstimulated="" cells;="" figure="" 1b)="" but="" failed="" to="" stimulate="" epc-induced="" capillary="" tube="" formation="" (figure="" 1c).="" based="" on="" these="" findings="" from="" healthy="" patient-derived="" epcs,="" the="" effects="" of="" 25%="" bm-msc-cm="" and/or="" 10="" ng/ml="" rlx="" were="" then="" evaluated="" on="" eskd="" patient-derived="">

Rajah 1. Kesan CM dan/atau RLX terbitan BM-MSC terhadap daya maju/percambahan EPC yang diperolehi pesakit yang sihat, angiogenesis dan penyembuhan luka. EPC lewat CD34t daripada darah pesakit lelaki yang sihat didapati mengekspresikan reseptor RLX serumpun, RXFP1; bar skala =50 μm （A）.Percambahan EPC selepas 24 jam (24 jam)daripada n =7EPC yang diperoleh pesakit setiap kumpulan (B);Pembentukan tiub pengantara EPC (ditentukan daripada jumlah panjang tiub, bilangan dahan, bilangan simpang dan bilangan jerat) selepas 4 jam daripada n =6 EPC yang diperoleh pesakit bagi setiap kumpulan (C) dan penyembuhan luka yang dimediasi EPC selepas 4 jam dan 8 jam daripada n=6pesakit- EPC yang diperolehi bagi setiap kumpulan (D), ditentukan sebagai tindak balas kepada 20 peratus serum lembu janin (FBS; kawalan positif), 25 peratus BM-MSC-CM(25 peratus CM), RLX [1 ng/mL (RLX{{26} })atau 10ng/mL (RLX-10)]atau kesan gabungan 25 peratus CM dan RLX-1 atau RLX-10. Penutupan luka lengkap dicapai oleh EPC yang tidak dirawat dalam masa 24 jam. Imej perwakilan pembentukan tiub kapilari daripada EPC dan EPC yang tidak dirawat yang dirawat dengan 25 peratus CM sahaja atau digabungkan dengan RLX-10 (C) dan penutupan luka daripada EPC yang tidak dirawat dan yang dirawat dengan 25 peratus CM ditambah RLX{{36} }(D) ditunjukkan. Bulatan berwarna dalam setiap lajur setiap graf bar mewakili titik data individu daripada setiap kumpulan. Data dianalisis menggunakan ANOVA sehala diikuti dengan ujian post-hoc Tukey untuk membolehkan beberapa perbandingan antara kumpulan.*p<><><0.001 vs.untreated=""><><001, *=""><0001vs.25%cm-treated><><0.001 vs.rlx1-treated=""><><0.001 vs.rlx-10-treated=""><><0.01 y.25%cm+rlx-1-treated="">

3.3. Analisis Fungsional EPC yang Diperolehi daripada Pesakit ESKD

Seperti yang diterangkan sebelum ini, hanya lima kultur EPC daripada n =11 sampel darah yang diperoleh pesakit ESKD matang menjadi EPC lewat, yang mana data diperoleh daripada n =3-5 kultur/kumpulan rawatan yang berasal daripada pesakit yang berasingan. EPC yang diperoleh pesakit ESKD ini masih menyatakan RXFP1 (mencadangkan bahawa mereka juga boleh bertindak balas terhadap rawatan RLX; Rajah 2A) tetapi telah mengurangkan daya maju dan kapasiti proliferatif (sebanyak ~70 peratus; p< 0.01="" vs.="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients)="" compared="" to="" their="" counterparts="" isolated="" and="" grown="" from="" normal="" patients="" (figure="" 2b).="" interestingly,="" the="" addition="" of="" 20%="" fbs="" (positive="" control)and="" all="" treatments="" evaluated,="" stimulated="" epc="" proliferation="" (by~1.2-1.6-fold)="" after="" 24="" h,="" almost="" back="" to="" levels="" that="" were="" measured="" from="" untreated="" epcs="" from="" normal="" patients(all="" no="" different="" from="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients;="" figure="" 2b).10="" ng/ml="" rlx="" alone="" promoted="" epc-mediated="" tube="" length,="" number="" of="" junctions="" and="" number="" of="" meshes="" after="" 4h="" (all="" by~1-2.5-fold),="" whereas="" all="" three="" measures="" in="" addition="" to="" the="" number="" of="" branches="" were="" further="" increased="" by="" the="" combined="" treatment="" (all="" by~3.1-4.2-fold;="" all=""><0.05 vs.25%bm-msc-cm="" or="" 10ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 2c).="" epc-induced="" wound="" healing="" in="" vitro="" from="" eskd="" patients="" took="" longer="" to="" achieve="" compared="" to="" that="" from="" healthy="" patients="" but="" was="" more="" rapidly="" stimulated="" by="" 10="" ng/ml="" rlx(by~54%)or="" the="" combination="" therapy="" (by="" ~63%)="" to="" almost="" complete="" closure="" after="" 24="" h="" (figure="">

Rajah 2. Kesan CM dan/atau RLX terbitan BM-MSC pada tahap V ESKD yang diperolehi pesakit EPC daya maju/proliferasi, angiogenesis dan penyembuhan luka. EPC lewat yang diperoleh daripada darah pesakit ESKD lelaki juga didapati mengekspresikan RXFP1; bar skala= 50 um (A).Percambahan EPC selepas 24 jam (24 jam) ditentukan daripada n=4 EPC yang diperoleh pesakit setiap kumpulan sebagai tindak balas kepada 20 peratus FBS (kawalan positif), 25 peratus BM -MSCCM (25 peratus CM), RLX [10 ng/mL (RLX-10)]atau kesan gabungan 25 peratus CM ditambah RLX-10.Data daripada EPC yang tidak dirawat diperoleh daripada pesakit lelaki yang sihat(disediakan dalam Rajah 1B) juga disertakan untuk perbandingan (B). Pembentukan tiub pengantara EPC(ditentukan daripada jumlah panjang tiub, bilangan cawangan, bilangan simpang dan bilangan jerat) selepas 4j daripada n=3 EPC yang diperolehi pesakit setiap kumpulan(C) dan penyembuhan luka yang dimediasi EPC selepas 24j daripada n=5 EPC terbitan pesakit bagi setiap kumpulan (D), ditentukan sebagai tindak balas kepada 25 peratus BM-MSC-CM(25 peratus CM), RLX[10 ng/mL (RLX-10)] atau kesan gabungan 25 peratus CM campur RLX-10. Imej perwakilan pembentukan tiub (C) dan penutupan luka (D) daripada setiap empat kumpulan yang dianalisis ditunjukkan. Bulatan berwarna dalam setiap lajur setiap graf bar mewakili titik data individu daripada setiap kumpulan; manakala peratusan kumulatif penutupan penyembuhan luka daripada setiap kumpulan rawatan yang dikaji selama 24 jam ditunjukkan (C).*p<><><0001 vs="" untreated=""><><001 vs.25%cm-treated="" cells;=""><0.05,><0.01 vs.rlx-10-treated="">

4. Perbincangan

Kajian terdahulu telah melaporkan bahawa bilangan EPC berkurangan dalam pesakit ESKD, yang telah dikaitkan dengan peningkatan ketara dalam kematian akibat penyakit. Ia juga dilaporkan bahawa hemodialisis jangka panjang, yang dianggap sebagai terapi utama untuk ESKD, juga boleh menyumbang kepada peningkatan kehilangan EPC yang disebabkan oleh ESKD ini pada pesakit. Walau bagaimanapun, kajian lain juga melaporkan bahawa hemodialisis pesakit ESKD gagal memulihkan keupayaan EPC sahaja untuk membiak dan berhijrah secara in vitro berbanding EPC yang diperolehi dalam pesakit yang sihat. Penemuan gabungan ini memberikan rasional mengapa ejen yang boleh meningkatkan percambahan dan fungsi EPC diperlukan dengan segera. Memandangkan pengembangan EPCyield untuk terapeutik alogenik telah terbukti agak sukar dan memakan masa, kajian kami mencadangkan rawatan baru dengan menggabungkan CM dan RLX terbitan BM-MSC untuk meningkatkan percambahan EPC dan keupayaan fungsi peningkatan EPC secara in vitro, dengan utama memberi tumpuan kepada menyediakan kajian bukti konsep untuk terjemahan klinikal langsung dalam memodulasi kapasiti penjanaan semula EPC dalam vivo. Buat pertama kalinya, kajian ini menunjukkan potensi terapeutik untuk menggabungkan BM-MSC-CM dengan RLX sebagai satu cara untuk menggalakkan daya maju, proliferatif dan kapasiti penjanaan semula EPC manusia.

Dalam kajian ini, kami menunjukkan kejayaan pengasingan dan pencirian EPC awal dan lewat daripada darah pesakit sihat dan ESKD yang dikumpul daripada jumlah darah yang kecil (sekitar 5-40 mL). Kebanyakan kajian terdahulu telah menggunakan sekitar 50 mL darah periferi sebagai volum permulaan untuk mengasingkan EPC [24-26]. Sesetengah kajian tidak menyatakan jumlah permulaan darah yang diperlukan untuk pengasingan EPC. Tambahan pula, EPC lewat telah dikenal pasti mengikut morfologinya serta kapasiti proliferatifnya yang tinggi, dan keupayaan membentuk koloninya, daripada 20 mL darah periferal, menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya 20 mL darah periferi diperlukan untuk mendapatkan EPC yang boleh membiak. . Dalam kajian ini, walaupun bilangan sampel untuk pesakit ESKD adalah daripada kohort kecil berbanding subjek kawalan, dengan jumlah permulaan ~5 mL darah periferi, kami mengenal pasti bahawa hasil EPC bukan sahaja rendah tetapi tidak selalunya boleh mengalami perkembangan pembezaan kepada koloni EPC lewat. Tambahan pula, EPC awal diperhatikan daripada kawalan sihat pada hari 6-10 budaya, manakala EPC lewat muncul selepas 14-28 hari dalam budaya. Pemerhatian ini konsisten dengan laporan sebelumnya [25]. Beberapa faktor boleh menyumbang kepada pembezaan atau transformasi PBMC kepada EPC awal dan lewat.

Walaupun BM-MSC sahaja boleh mendorong kesan reparatif dalam buah pinggang melalui kesan anti-radang, anti-apoptosis, antioksidan, pro-angiogenik, dan rangsangan EPC, keberkesanan terapeutik sel stem ini terjejas teruk dalam tetapan penyakit kronik 30. BM-MSC juga telah ditunjukkan mempunyai kesan renoprotektif yang lebih besar dalam banyak model eksperimen yang berbeza dan kini sedang dinilai dalam pelbagai ujian klinikal [31]. Lebih sedikit kajian walaupun telah menyiasat peranan angiogenik MSC dalam model fibrotikpenyakit buah pinggang. Satu kajian melaporkan tentang kesan MSC pada vaskular buah pinggang, di mana media terkondisi daripada BM-MSC diperkaya dengan faktor pertumbuhan, seperti VEGF, HGF dan IGF-1 dapat meningkatkan pertumbuhan EC aorta dan percambahan. Tambahan pula, kajian dalam model pra-klinikal penyakit Alport (keadaan genetik yang dicirikan oleh keabnormalan mikrovaskular buah pinggang dan kegagalan fungsi), memerhatikan bahawa tikus yang dirawat dengan MSC-CM menyatakan tahap mRNA VEGFR yang tinggi dalam buah pinggang, tetapi tidak dalam peredaran, dan juga dipertingkatkanbuah pinggangPercambahan EC secara in vitro.

Kajian terdahulu mendapati bahawa sitokin dan faktor pertumbuhan dalam CM tali pusat-MSC dengan ketara meningkatkan bilangan tiub dan peratusan pemulihan luka sel endothelial vaskular umbilical manusia (HUVECs) secara in vitro. Mekanisme yang mendasari sifat ini dikenal pasti melalui peningkatan ekspresi sitokin SDF-1-CXCR4 dan MCP-1, yang meningkatkan kadar penghijrahan HUVEC untuk menutup kawasan luka yang dijana dalam ujian penyembuhan luka yang dijalankan . Walau bagaimanapun, memandangkan kajian terdahulu kami yang menunjukkan bahawa 100 peratus BM-MSC-CM sahaja boleh merangsang dengan ketara ukuran percambahan EPC, pembentukan tiub kapilari, angiogenesis, dan penyembuhan luka, manakala pentitratan BM-MSC-CM turun kepada 25 peratus mengurangkan ini. kesan, kajian semasa menggunakan penggunaan 25 peratus BM-MSC-CM supaya potensi kesan sinergistik 25 peratus CM dan RLX dapat ditentukan secara optimum.

RLX menunjukkan potensi angiogeniknya dengan mendorong VEGF dan faktor pertumbuhan fibroblast asas (bFGF) di tapak luka pada tikus. Selain itu, RLX telah ditunjukkan untuk meningkatkan NO intraselular yang berasal dari sumsum tulang manusia-EPC dan penghijrahan pada tikus, menunjukkan bahawa RLX boleh menggalakkan angiogenesis dalam vivo . Walau bagaimanapun, diperhatikan bahawa RLX tidak mengikat secara langsung kepada EC, sebaliknya mendorong angiogenesis melalui keupayaannya untuk menggalakkan faktor pertumbuhan yang memainkan peranan dalam penyembuhan luka. Sebaliknya, kajian ini menunjukkan bahawa daya maju/percambahan, pembentukan tiub, dan kapasiti penyembuhan luka EPC telah dipertingkatkan dengan ketara dengan pemberian 10 ng/mL RLX, selaras dengan penemuan sebelumnya[18]. Di samping itu, diperhatikan bahawa kedua-dua EPC awal dan lewat menyatakan reseptor RXFP1, yang mencadangkan bahawa RLX akan dapat mengikat secara langsung kepada reseptornya pada EPC untuk menggalakkan proliferasi EPC dan angiogenesis yang disebabkan oleh EPC secara in vitro.

Kajian terdahulu dari makmal kami telah menunjukkan bahawa menggabungkan BM-MSC dan RLX lebih berkesan melemahkan atau membalikkan organ.keradangandan fibrosis dalam model murine nefropati obstruktif [15], hipertensiCKD, atau penyakit saluran pernafasan alahan kronik(AAD)[37] dalam vivo. Penemuan kajian ini kini telah memperluaskan penemuan tersebut untuk menunjukkan bahawa kesan gabungan CM dan RLX yang diperolehi BM-MSC boleh meningkatkan daya maju dan kadar percambahan EPC yang diperolehi pesakit ESKD manusia secara in vitro (ke tahap yang diukur dalam pesakit normal), dan keupayaan sel-sel ini untuk menggalakkan angiogenesis. Ini ditunjukkan oleh peningkatan kapasiti terapi kombinasi untuk menggalakkan pembentukan tiub kapilari yang disebabkan oleh EPC dan penyembuhan luka berbanding CM sahaja. Dalam konteks ini, ada kemungkinan bahawa kesan vaskulogenik NO-pengantara RLX yang mengakibatkan penambahan RLX(pada 10ng/mL) yang disebabkan oleh nombor EPC dan penyembuhan luka yang dimediasi EPC, telah dipertingkatkan secara sinergi oleh kesan menggalakkan EPC daripada mediator angiogenik (seperti VEGF dan bFGF) yang dirembeskan oleh BM-MSC-CM dan dirangsang oleh RLX. Walaupun sifat ex vivo kajian ini dan bilangan rendah budaya EPC yang diperoleh pesakit ESKD yang dianalisis, faedah sinergistik terapi gabungan yang dinilai jelas terbukti.

5. Kesimpulan

Memandangkan memperluaskan hasil EPC daripada terapeutik alogenik telah terbukti sukar dan memakan masa, terapi novel ini mungkin menjanjikan satu rawatan yang baik untuk penghidap ESKD. Secara keseluruhan, penemuan daripada kajian ini mempunyai kepentingan klinikal yang tinggi, terutamanya untuk pesakit ESKD, di mana kehilangan nombor EPC yang beredar menyumbang kepada pertumbuhan terjejas dan angiogenesis, hasil kardiovaskular yang buruk, dan kematian yang berkaitan. Tambahan pula, kerana pesakit ESKD sering meninggal duniapenyakit vaskular(aterosklerosis, strok, penyakit vaskular periferal)[40], terapi gabungan ini mungkin menyediakan cara baru untuk memperlahankan perkembangan penyakit vaskular pada pesakit ini. Selain itu, membangunkan terapi baharu yang boleh melambatkan perkembangan CKD akan menjimatkan berbilion dolar sistem penjagaan kesihatan dalam terapi penggantian buah pinggang. Memandangkan kedua-dua MSC dan RLX telah pun dinilai secara klinikal, strategi baru yang menggabungkan terapi gabungan ini boleh dikesan pantas untuk ujian manusia.