Bahagian1 ERCC1 Mutasi Menghalang Pembaikan Kerosakan DNA Dan Menyebabkan Disfungsi Hati dan Buah Pinggang dalam Pesakit

Kenalan: ali.ma@wecistanche.com

Katja Apelt et al

Klik untuk faedah ekstrak Cistanche untuk fungsi buah pinggang

pengenalan

Enam bilion pasangan asas genom manusia sentiasa terdedah kepada agen yang merosakkan DNA, menyebabkan pelbagai jenis lesi DNA genom, termasuk produk foto yang disebabkan oleh cahaya UV, pautan silang (ICL) intra dan interstrand, dan DNA dwi- putus helai (DSBs). Untuk memastikan integriti genomik, lesi DNA ini perlu dibaiki dengan cara yang khusus dan cekap. Mekanisme pembaikan DNA yang berbeza telah berkembang yang masing-masing bertindak ke atas subset tertentu lesi DNA. Walaupun banyak protein pembaikan DNA terlibat dalam satu laluan, endonuklease heterodimerikERCC1-XPF dikongsi antara beberapa laluan pembaikan DNA yang berbeza secara mekanis (Manandhar et al., 2015).

XPF tidak stabil dan cepat terdegradasi, yang dihalang oleh heterodimerisasi denganERCC1(Biggerstaff et al., 1993). Interaksi antara kedua-dua protein ini dimediasi oleh heliks heliks-jepit rambut berganda (HhH)2 motif yang terletak di C-termini masing-masing, serta melalui domain pusatERCC1, dan domain nuklease XPF (de Laat et al., 1998b; Jones et al., 2020; Tripsianes et al., 2005; Tsodikov et al., 2005). Pengikatan kepada DNA untai dua difasilitasi oleh ERCC1, manakala XPF mengantara persatuan dengan DNA untai tunggal (ssDNA) melalui domainnya (HhH)2 (Tsodikov et al., 2005). Setelah diposisikan, XPF menggunakan aktiviti pemangkinnya melalui motif nuklease yang sangat terpelihara untuk membelah substrat DNA yang berbeza pada 59 persimpangan buih dan 39 rantaian tunggal yang terjuntai dari heliks berganda DNA (de Laat et al., 1998a; Enzlin dan Sch¨ ialah, 2002; Matsunaga et al., 1996). Peranan utama ERCC1- XPF mula-mula ditunjukkan dalam pembaikan eksisi nukleotida (NER), di mana ia membelah DNA 59 yang rosak kepada lesi (Sijbers et al., 1996a).

NER mengiktiraf pelbagai jenis lesi DNA yang tidak berkaitan secara struktur, termasuk produk foto yang disebabkan oleh UV, melalui dua sub laluannya: pembaikan genom global (GGR) dan pembaikan berganding transkripsi (TCR). Sebahagian besar aktiviti NER bergantung pada GGR, di mana protein XPC mengiktiraf produk foto sepanjang genom dan merekrut kompleks faktor transkripsi IIH (TFIIH) (Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001). Lesi DNA yang menyebabkan terhentinya RNA polimerase II (RNAPII) semasa transkripsi mencetuskan pengambilan protein khusus TCR, seperti CSB, CSA, dan UVSSA, yang seterusnya merekrut kompleks TFIIH (Nakazawa et al., 2020; van der Weegen et al., 2020). Berikutan pengambilan TFIIH kepada lesi DNA, GGR dan TCR corong ke dalam mekanisme molekul biasa yang melibatkan persatuan XPA dan XPG (Marteijn et al., 2014), yang merangsang aktiviti helikase TFIIH dan membentuk kompleks ketepatan yang stabil bersama-sama dengan RPA ( Kokic et al., 2019; Riedl et al., 2003; Wakasugi dan Sancar, 1998). TheERCC1-XPF heterodimer direkrut ke kompleks NER oleh XPA melalui domain pengikat XPAERCC1(Tsodikov et al., 2007; Volker et al., 2001). Senggatan dwi oleh aktiviti terkoordinasi endonucleases XPF (59 dari lesi) dan XPG (39 dari lesi) melepaskan regangan ssDNA yang mengandungi lesi DNA (Li et al., 1995; Matsunaga et al., 1995; O 'Donovan et al., 1994; Staresincic et al., 2009), selepas itu jurang yang dijana diisi dan diikat untuk menyelesaikan pembaikan.

Sebagai tambahan kepada NER, ia telah ditunjukkan bahawaERCC1-XPF juga memainkan peranan penting dalam pembaikan ICL (Klein Douwel et al., 2014). Laluan pembaikan ini dimulakan dengan replikasi yang terhenti dan melibatkan pengiktirafan garpu replikasi terhenti ICL oleh kompleks Fanconi anemia (FA) teras berbilang protein, yang berfungsi sebagai kompleks ligase ubiquitin E3 untuk FANCD2. Mono-ubiquitylation FANCD2 mencetuskan pengambilan SLX4, yang seterusnya menyasarkanERCC1-XPF kepada ICLs (Abdullah et al., 2017; Klein Douwel et al., 2014; Walden and Deans, 2014; Wood, 2010). Setelah diambil, ERCC1-XPF mengantara untuk melepaskan cangkuk ICL dengan mencungkil untaian DNA ibu bapa pada kedua-dua belah lesi untuk membolehkan pintasan dan pembaikan lesi berikutnya (Kuraoka et al., 2000). Akhir sekali, ERCC1-XPF juga telah terlibat dalam pembaikan DSB melalui penggabungan semula homolog (Ahmad et al., 2008), di mana ia boleh membelah perantara gabungan semula yang berbeza dengan cekap (Wyatt et al., 2017). Sebagai alternatif, sel menggunakan laluan penyepuhlindapan lembaran tunggal{11}yang rawan ralat, yang melibatkan penyepuhlindapan kawasan dengan mikrohomologi dan penyingkiran seterusnya ekor 39 ssDNA yang tidak homolog denganERCC1-XPF (Adair et al., 2000; Li et al., 2013, 2019). Walau bagaimanapun, peranan tepat ERCC1-XPF dalam laluan pembaikan DSB ini tidak difahami sepenuhnya.

Kepentingan laluan pembaikan DNA digariskan oleh fenotip klinikal individu yang mengalami gangguan kekurangan pembaikan DNA yang diwarisi. Penyahaktifan GGR mengakibatkan Xeroderma pigmentosum (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760 dan 278780; DiGiovanna dan Kraemer, 2012), yang dicirikan oleh 22 kali ganda fotosensitiviti dan {} 9 kali ganda kepekaan foto. daripada kanser kulit. Neurodegenerasi, terencat pertumbuhan, dan penyakit berbilang sistem tanpa kanser kulit diperhatikan dalam sindrom Cockayne (CS; MIM 216400 dan 133540). Pesakit CS mempunyai kecacatan genetik terpilih dalam TCR yang menghalang pemprosesan RNAPII yang terhenti kerosakan DNA (Karikkineth et al., 2017; Nakazawa et al., 2020; Nakazawa et al., 2012; Ribeiro et al., 2018; Tufegdˇzi´ c Vidakovi´ c et al., 2020). Mutasi dalam gen pembaikan ICL penting menyebabkan FA (MIM 227650, 30000514, 207645, 6057646, 614083, 614083. , kecacatan organ, dan ketidakstabilan genom (Auerbach, 2009). Peranan daripadaERCC1-XPF dalam pembaikan ICL digariskan oleh kewujudan mutasi dalam XPF yang menimbulkan fenotip FA (Bogliolo et al., 2013; Ceccaldi et al., 2016; Kashiyama et al., 2013). Kecacatan yang diwarisi dalam pembaikan DSB menyebabkan pelbagai gangguan yang berkaitan dengan radiosensitiviti, kecenderungan kanser, kekurangan imun, dan degenerasi neuro (Helfricht et al., 2020; McKinnon dan Caldecott, 2007).

Gangguan kekurangan pembaikan DNA jarang berlaku dan berlaku dengan anggaran kekerapan ∼1 setiap 200,000 kelahiran hidup di seluruh dunia untuk XP, CS dan FA. Walau bagaimanapun, hanya dua laporan individu yang mempunyai mutasi bi-allelic ERCC1 (MIM 126380) telah diterangkan setakat ini (Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Kedua-dua individu memaparkan ciri yang konsisten dengan CS dan meninggal dunia pada 14 bulan dan 2.5 tahun. Individu pertama dan paling teruk terjejas (165TOR) membawa kodon henti pramatang (Q158X) pada satu alel dan varian missense F231L pada yang lain (Jaspers et al., 2007). Individu kedua (CS20LO) adalah homozigot untuk varian missense F231L (Kashiyama et al., 2013). Sel-sel daripada kedua-dua individu menunjukkan kepekaan terhadap kerosakan DNA yang disebabkan oleh UV, dan 165TOR, khususnya, juga agak sensitif terhadap agen yang mendorong ICL. Kedua-dua individu meninggal dunia pada awal kanak-kanak (1–2 tahun; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Individu ketiga (XP202DC) dengan mutasi bi-allelic ERCC1 yang meninggal dunia pada usia 37 tahun disebut dalam abstrak mesyuarat (Imoto, K., et al. 2007. Pesakit yang mengalami kecacatan dalam protein pembaikan eksisi nukleotida yang berinteraksiERCC1atau XPF menunjukkan xeroderma pigmentosum dengan degenerasi neurologi yang teruk. [Abstrak] J. Melabur. Dermatol. 127:S92). Individu ini adalah heterozigot kompaun untuk mutasi karut (K226X) dan mutasi splice dalamERCC1. Penerangan fenotip terperinci tidak tersedia, dan kesan mutasi ERCC1 ini tidak diketahui.

Fenotip bagi dua individu yang dinyatakan di atas adalah lebih teruk daripada yang dijangkakan daripada kekurangan NER sahaja, selaras dengan penglibatan ERCC1-XPF dalam berbilang laluan pembaikan DNA. Selaras dengan ini, sama ada tikus ERCC1 atau XPF-KO menunjukkan tahap kematian embrio yang tinggi dan jangka hayat berkurangan dan mati akibat kegagalan hati yang teruk (McWhir et al., 1993; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997), yang tidak diperhatikan dalam tikus XPA-KO yang kekurangan NER (de Vries et al., 1995; Nakane et al., 1995).

Dalam kajian semasa, kami menerangkan dua beradik dengan mutasi bi-allelicERCC1 yang mempunyai fenotip unik bertubuh pendek, fotosensitiviti, penyakit hati kolestatik progresif, dan tubulopati buah pinggang. Kedua-dua individu mengalami kerosakan hati yang progresif dan memerlukan pemindahan hati sebelum umur 10 tahun. Kajian fungsional menunjukkan bahawa tahap protein keadaan mantap ERCC1 dan XPF telah dikurangkan secara mendadak dalam sel pesakit dalam dan sel epitelium ketuk masuk yang membawa varian missense yang terdapat pada pesakit. Selain itu, protein ERCC1 mutan berinteraksi hanya lemah dengan protein pembaikan NER dan ICL yang lain. Kami melaporkan kes baharu kekurangan ERCC1 yang sangat mempengaruhi NER dan mempunyai kesan yang besar terhadap pembaikan ICL, yang bersama-sama menghasilkan fenotip unik yang menggabungkan kedudukan pendek, fotosensitiviti dan hati progresif dandisfungsi buah pinggang.

Keputusan

Dua beradik dengan fotosensitiviti, bertubuh pendek, dan disfungsi hati dan buah pinggang yang progresif

Adik beradik 1 (PV50LD; Rajah 1 A) berumur 13 tahun, anak sulung daripada tiga adik beradik kepada ibu bapa yang sihat dan tidak berkaitan daripada etnik campuran termasuk warisan Orang Asli Australia, Malta dan Anglo-Celtic. Semasa mengandung, ibunya mengalami kardiomiopati diluaskan sementara yang menyelesaikan selepas bersalin. Dia dilahirkan pada usia kandungan 39 minggu, dan berat lahirnya ialah 1.9 kg (Z=−3.8), panjang 44 cm (Z=−2.44), dan lilitan kepala 29.5 cm (Z {{ 17}} −3.8). Dia mengalami pertumbuhan yang lemah semasa bayi, dan pada usia 18 bulan, dia diperhatikan mengalami disfungsi hati dengan corak yang kebanyakannya kolestatik. Ultrasound hati dan cholangiopancreatography resonans magnetik adalah normal. Fungsi hati secara beransur-ansur menurun, seperti yang terbukti daripada peningkatan progresif dalam -glutamyltransferase (GGT), alanine transaminase (ALT), dan paras bilirubin (Rajah S1, A–C). Pada biopsi hati (pada umur 3.5 tahun), parenkim lobular menunjukkan variasi dalam morfologi nuklear hepatosit, dengan beberapa nukleus yang lebih besar dan sel dengan nukleus berganda (Rajah S1 D) ke kawasan di mana sel mempunyai nukleus yang kecil dan tidak biasa. Terdapat fibrosis portal ringan dan pengembangan portal berserabut ringan dan keradangan antara muka fokus ringan tanpa duktopenia atau fibrosis periduktal (Rajah S1 E).

Dia mengalami sejumlah besar jangkitan berulang termasuk tonsillitis, cacar air, penyakit tangan-kaki-dan-mulut, radang paru-paru, bronkitis, dan episod demam berulang, sakit perut dan najis pucat tanpa sebab yang ditemui. Penyiasatan imunologi tidak mengenal pasti sebarang kekurangan imun. Dia mengalami episod fotosensitiviti okular dan kulit. Pada usia 6 tahun, disfungsi buah pinggang dikesan, dengan ciri-ciri yang menunjukkan disfungsi tubular proksimal yang dicirikan oleh albuminuria (julat sub-nefrotik) dan hiperkalsiuria. Fungsi buah pinggangnya berubah-ubah, dengan episod terputus-putuskecederaan buah pinggang akut, progresifkerosakan buah pinggangdengan peningkatan paras kreatinin (Rajah S1 F), dan tindak balas minimum terhadap perencatan acetylcholinesterase. Ultrasound buah pinggang menunjukkan kecilbuah pinggangdengan peningkatan echogenicity dan mengurangkan pembezaan kortikodulari. Ujian fungsi paru-paru menunjukkan penyakit paru-paru sekatan ringan hingga sederhana.

Pencapaian perkembangan adalah normal, tetapi beberapa masalah pembelajaran jelas pada usia sekolah tanpa tanda regresi. Penglihatan dan pendengaran adalah normal. Pertumbuhan kekal sangat perlahan walaupun diberi makanan tambahan. Dia agak stabil sehingga umur 9.5 tahun apabila dia menunjukkan bukti dekompensasi hati dengan tahap bilirubin yang semakin meningkat (Rajah S1 C) dan nisbah normal antarabangsa. Dia menjalani pemindahan hati ortotopik pada umur 9 tahun 10 bln. Selepas pemindahan hati, tubulopatinya telah stabil, walaupun kreatinin serumnya terus meningkat pada kadar yang lebih perlahan (Rajah S1 F). Dia secara klinikal stabil. Pada usia 12 tahun, kekurangan ovari telah didiagnosis. Pengimejan resonans magnetik otak (MRI) pada umur 12 tahun menunjukkan atrofi serebrum ringan dengan atrofi cerebellar sederhana dan atrofi batang otak ringan. Pada penilaian terakhir (berumur 13.5 tahun), pertumbuhan adalah perlahan (berat 22.4 kg [Z=−6.08] dan ketinggian 134.7 cm [Z=−3.72]). Dia mempunyai badan yang sangat langsing dengan sebahagian besar otot yang lemah dan kekurangan lemak subkutan. Dia mengalami jeragat di kawasan yang terdedah kepada matahari (Rajah 1 A). Dia mempunyai mata yang agak dalam, dan rambut kulit kepalanya nipis. Tiada keabnormalan sinar radial. Pemeriksaan neurologi menunjukkan kelemahan ringan, ataksia minimum, dan refleks tertekan.

Adik beradik 2 (PV46LD; Rajah 1 A) berumur 11 tahun, adik kepada adik 1. Kehamilan adalah rumit oleh plasenta previa dan kardiomiopati ibu sementara, dan adik beradik 2 dilahirkan pada usia kehamilan 35 minggu dengan berat lahir 1.79 kg (centile ketiga), panjang 45 cm (centile ke-50), dan lilitan hadapan 29 cm (kurang daripada centile ketiga). Dia mempunyai kekurangan lemak subkutan dan ciri muka yang serupa dengan kakaknya. Dia mempamerkan kegagalan untuk berkembang maju pada tahun pertama kehidupan dan kerosakan hati dari umur 2 tahun, dengan peningkatan tahap GGT, ALT, dan bilirubin dengan ketara (Rajah S1, A–C). Biopsi hati pada umur 6 tahun menunjukkan kerosakan pada saluran hempedu intrahepatik, mengakibatkan fibrosis periduktal. Seperti biopsi hati daripada kakaknya, sejumlah sederhana hepatosit bernukleus dua dilihat, beberapa dengan nukleus besar dan nukleolus besar.

Dia mempunyai episod fotosensitiviti okular dan kulit. Dia mempunyai penemuan tubulopati buah pinggang dengan kerosakan buah pinggang ringan, dengan tahap kreatinin yang semakin meningkat (Rajah S1 F). Ultrasound buah pinggang menunjukkan kecilbuah pinggangdengan nefrokalsinosis. Pencapaian perkembangan adalah normal, tetapi ketidakupayaan intelektual ringan (IQ 66) telah didiagnosis pada usia sekolah. Terdapat kemajuan ke hadapan yang perlahan dengan pencapaian perkembangan saraf dan tiada regresi yang pasti. Penglihatan dan pendengaran adalah normal. Kerosakan hati adalah progresif, dan pada usia 8 tahun, dia menjalani pemindahan hati. MRI otak pada usia 5 tahun adalah normal, tetapi MRI berulang pada 10 tahun menunjukkan atrofi serebelum sederhana dan atrofi serebrum ringan. Pada usia 11 tahun, pengukuran estrogen, hormon perangsang folikel dan hormon lutein menunjukkan corak yang menunjukkan ketidakcukupan ovari. Pada penilaian terakhir pada umur 11 tahun, pertumbuhan adalah perlahan (berat 20 kg [Z=−3.89] dan ketinggian 120.7 cm [Z=−3.17]). Dia mempunyai badan yang sangat nipis dengan lemak subkutan yang minimum dan sebahagian besar otot yang lemah, ciri-ciri wajah keluarga, mata yang agak dalam dan bintik-bintik pada kawasan yang terdedah kepada matahari (Rajah 1 A). Dia tidak mempunyai kelainan sinar radial. Pemeriksaan neurologi menunjukkan kelemahan ringan dengan ataksia ringan dan refleks tidak hadir.

Analisis molekul mengenal pasti mutasi ERCC1 bi-allelik novel

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>Varian T missense telah disahkan oleh penjujukan Sanger dalam kedua-dua adik-beradik yang terjejas (Rajah 1 B). Penjujukan genom keseluruhan mendedahkan pemadaman dalam exon 4 pada alel ibu (hg19: chr19:45,922,224- 45,924,375; Rajah S2 B), yang telah disahkan oleh PCR kuantitatif perbandingan (qPCR) exon 4 dan exon 5 daripada ERCC1 dalam kedua-dua adik-beradik dan ibu (Rajah 1, C dan D). Pemadaman, yang dijangkakan sebagai alel nol, tidak dikesan dalam bapa mahupun dalam empat sampel kawalan negatif (Rajah 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) terletak dalam domain (HhH)2 (Rajah 1 E), varian missense (p.R156W) terletak dalam domain pusat ERCC1 dan berdekatan dengan poket pengikat XPA (110–154 aa) daripada ERCC1 (Rajah 1 E). Analisis struktur domain pusat ERCC1 mendedahkan poket hidrofobik berbentuk V sempit yang mengikat motif pendek (67-80 aa) yang terdapat dalam XPA (Rajah 1 F; Tsodikov et al., 2007). Asid amino yang melapisi poket pengikat XPA dalam ERCC1 (Rajah 1 F) adalah penting untuk NER tetapi boleh dibuang untuk laluan pembaikan bergantung{17}}ERCC lain (Orelli et al., 2010). Sisa R156 yang digantikan dalam pesakit terletak betul-betul di bawah poket pengikat XPA dan membentuk jambatan garam dengan asid amino lawan D129 (Rajah 1 F). Oleh itu, penggantian R156W berkemungkinan menjejaskan kestabilan poket yang mengikat XPA. Ada kemungkinan penggantian ini juga melemahkan interaksi antara domain pusat ERCC1 dan domain nuklease XPF (Jones et al., 2020), dan kami akan meramalkan bahawa ini boleh membawa kepada ketidakstabilan ringan hingga sederhana antara muka heterodimer, mengakibatkan kestabilan protein berkurangan.

Fibroblas PV46LD dan PV50LD memaparkan kecacatan NER yang teruk Satu ciri kekurangan NER ialah kepekaan yang kuat terhadap penyinaran UV-C. Untuk menangani kesan kekurangan ERCC1 pada fungsi NER, kami memperoleh fibroblas utama daripada biopsi kulit kedua-dua adik-beradik yang terjejas. Untuk membenarkan ujian survival klonogenik, kami mengabadikan sel PV50LD dengan memperkenalkan hTERT (Rajah S3 A). Sebagai kawalan, kami menjana sel ERCC1-KO penuh dalam sel RPE1-hTERT oleh CRISPR-Cas9 (Rajah 2 A). Ujian kelangsungan hidup UV-C klonogenik menunjukkan bahawa sel PV50LD-hTERT adalah hipersensitif kepada penyinaran UV-C, walaupun tidak pada tahap yang sama seperti sel ERCC1-KO penuh (Rajah 2 B), mencadangkan kecacatan teruk pada NER.

Lesi DNA yang disebabkan oleh UV yang ditemui semasa transkripsi diperbaiki oleh TCR, yang boleh diukur dengan pemulihan ujian sintesis RNA (RRS) (Nakazawa et al., 2010). Kami mengukur RRS dalam 48BR fibroblas (WT), fibroblas pesakit, dan termasuk fibroblas primer kekurangan XPA (XP1PD) sebagai kawalan. Pelabelan transkrip yang baru lahir oleh 5-penggabungan ethynyl-uridine menunjukkan penurunan yang kuat akibat UV dalam transkrip yang baru lahir dalam semua garisan sel pada 3 jam selepas UV-C. Walaupun transkripsi pulih sepenuhnya 48BR dalam masa 18 jam selepas penyinaran UV-C, kedua-dua fibroblas pesakit pulih walaupun kurang daripada sel pesakit XP-A yang kekurangan NER (Rajah 2, C dan D), menunjukkan bahawa TCR hampir tidak hadir dalam keadaan ini.

Untuk mengkaji aktiviti GGR, kami mengukur sintesis DNA tidak berjadual (UDS) dalam sel tidak membahagi (Nakazawa et al., 2010). Untuk tujuan ini, fibroblas primer disinari secara tempatan dengan cahaya UV-C diikuti dengan pelabelan nadi dengan analog timidin 5-ethynyl-deoxyuridine (EdU) untuk mengukur pembaikan. Penggabungan EdU yang jelas telah dikesan dalam sel 48BR di tapak kerosakan DNA akibat UV tempatan. Walau bagaimanapun, hanya tahap penggabungan EdU yang sangat rendah dapat dikesan dalam fibroblas pesakit pada tahap yang sama seperti dalam fibroblas kekurangan XPA (XP1PD; Rajah 2, E dan F). Tahap UDS dalam sel PV46LD dan PV50LD adalah setanding dengan, atau lebih rendah daripada, tahap yang diukur dalam ERCC{12}}kekurangan 165TOR (Jaspers et al., 2007) dan CS20LO (Kashiyama et al., 2013) yang diterangkan sebelum ini. sel, yang kami sertakan secara selari (Rajah 2 G dan Rajah S3 B). Yang penting, ekspresi semula ERCC1 bertanda menu dalam kedua-dua fibroblas menyelamatkan sepenuhnya penggabungan EdU (Rajah 2, E dan F; dan Rajah S3 C), mengesahkan bahawa kecacatan UDS yang kuat adalah disebabkan oleh kekurangan ERCC1. Kami juga memperoleh fibroblas utama daripada ibu bapa, yang memaparkan UDS biasa di tapak kerosakan UV tempatan (Rajah 2 H), menunjukkan bahawa kecacatan ERCC1 heterozigot masing-masing dalam ibu bapa diberi pampasan sepenuhnya oleh alel WT.

Fibroblas PV46LD dan PV50LD mempunyai tahap protein ERCC1 dan XPF yang sangat rendah

NER melibatkan pemasangan kompleks pembaikan DNA yang sangat terkoordinasi dan berjujukan, di mana pengambilan XPA berlaku di hiliran TFIIH tetapi di hulu ERCC1-XPF (Volker et al., 2001). Untuk menangani sejauh mana fibroblas pesakit masih menyokong pemasangan kompleks NER, kami menyinari fibroblas tempatan dengan UV-C dan memantau pengambilan beberapa protein teras NER oleh pelabelan imunofluoresen (Rajah 3 A, kuantifikasi, dan Rajah S3 D). Pengambilan jelas TFIIH, XPA, dan ERCC1 di tapak kerosakan DNA akibat UV tempatan dikesan dalam sel 48BR, manakala sel XP1PD yang kekurangan XPA gagal merekrut ERCC1 seperti yang diterangkan sebelum ini (Rajah 3 A dan Rajah S3 D; Volker et al., 2001). Kedua-dua sel PV46LD dan PV50LD menunjukkan pengambilan normal TFIIH dan XPA, manakala pengambilan ERCC1 ke tapak kerosakan DNA akibat UV tempatan tidak dapat dikesan (Rajah 3 A dan Rajah S3 D).

Kehilangan penyetempatan ERCC1 mungkin disebabkan oleh kegagalan pengambilan ERCC1, pengurangan umum dalam tahap protein ERCC1, atau gabungan kedua-duanya. Analisis Western blot sememangnya mendedahkan bahawa tahap keadaan mantap kedua-dua ERCC1 dan XPF telah dikurangkan secara mendadak dalam sel PV46LD dan PV50LD (Rajah 3 B). Ekspresi ERCC1 sisa, walau bagaimanapun, masih dikesan jika dibandingkan dengan sel ERCC1-KO penuh (Rajah 3 B). Pengurangan paras protein ERCC1 dan XPF dalam sel PV46LD sangat serupa dengan paras berkurangan yang dikesan sama ada dalam sel CS20LO atau 165TOR (Rajah 3 C dan Rajah S3, E dan F), menunjukkan bahawa fenotip yang lebih teruk dalam individu daripada yang mana sel-sel ini diperolehi bukan disebabkan oleh kesan yang lebih kuat terhadap kestabilan protein. Selaras dengan keputusan UDS kami, kami mengesan ekspresi ERCC1 dan XPF biasa dalam sel daripada ibu bapa, menunjukkan pampasan oleh alel WT (Rajah 3 D). Pelabelan imunofluoresen mengesahkan bahawa tahap protein ERCC1 dan XPF telah dikurangkan dengan teruk, manakala sel daripada ibu bapa tidak dapat dibezakan daripada sel WT (Rajah 3 E). Kuantifikasi data Western blot menunjukkan bahawa paras protein ERCC1 telah dikurangkan kepada ~ 20 peratus fibroblas pesakit dalam, juga mengakibatkan paras tahap XPF yang sama berkurangan (~ 20 peratus; Rajah 3 F).

Ketidakstabilan varian R156W missense membawa kepada ketidakstabilan ERCC1-XPFprotein dan kecacatan NER yang teruk

Adalah menarik untuk membuat spekulasi bahawa tahap protein keadaan mantap rendah ERCC1-XPF dan kecacatan NER yang kuat dalam fibroblas pesakit disebabkan oleh penggantian asid amino R156W dalam ERCC1. Walau bagaimanapun, memandangkan individu yang terjejas adalah adik beradik, kami tidak boleh mengecualikan bahawa ciri genetik lain yang dikongsi di antara mereka juga mungkin menyumbang kepada fenotip ini.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), yang telah disahkan oleh penjujukan Sanger dalam dua klon individu (Rajah 4 A). Mutasi missense menyebabkan pengurangan teruk tahap protein ERCC1 dan XPF dalam kedua-dua klon KI (klon 2–17 dan 2–51; Rajah 4 B dan Rajah S4, A dan B). Kuantifikasi data Western blot menunjukkan bahawa paras protein ERCC1 dan XPF hampir sama rendah seperti dalam sel KO ERCC1-(Rajah 4 C). Penemuan ini membuktikan bahawa penggantian asid amino R156W mempunyai kesan yang kuat terhadap kestabilan ERCC1.

Untuk memastikan lebih lanjut bahawa kecacatan NER dalam fibroblas pesakit disebabkan oleh penggantian asid amino R156W dalam ERCC1, kami mengukur aktiviti TCR dengan memantau permulaan semula transkripsi selepas penyinaran UV. Walaupun sel RPE1-hTERT ibu bapa menunjukkan permulaan semula normal pada 18 jam selepas UV, kedua-dua klon R156W-KI menunjukkan kecacatan TCR yang kuat setanding dengan sel ERCC1-KO penuh (Rajah 4, D dan E). Begitu juga, percubaan UDS mendedahkan aktiviti GGR biasa dalam sel RPE1-hTERT ibu bapa, yang telah dikurangkan dengan teruk di bawah 10 peratus dalam kedua-dua klon R156W-KI dan sel ERCC1-KO (Rajah 4, F dan G) . Akhirnya, kami mengukur kepekaan UV satu klon R156W-KI (2-51) berbanding dengan fibroblast PV50LD pesakit yang diabadikan hTERT. Sel R156W-KI menunjukkan fenotip sensitif UV yang kuat, walaupun tidak sesensitif sel ERCC1-KO penuh (Rajah 4 H). Menariknya, fenotip sensitif UV R156W-KI sangat serupa dengan fibroblas pesakit PV50LD-hTERT. Penemuan ini membuktikan bahawa paras protein ERCC1-XPF yang rendah dan kecacatan NER yang kuat adalah akibat langsung daripada penggantian asid amino R156W dalam ERCC1.

Penggantian ERCC1R156W menyebabkan penyetempatan sitoplasma separa

Fibroblas pesakit dan sel KI memaparkan paras protein yang berkurangan secara mendadak dan sangat mengurangkan aktiviti NER. Kami seterusnya ingin meneroka sama ada kecacatan NER hanya disebabkan oleh pengurangan paras protein ERCC1-XPF atau sama ada protein ERCC1R156Wmutant telah mengurangkan aktiviti sebagai endonuklease atau dalam NER.

Untuk menangani perkara ini, kami menjana sel ERCC1-KO oleh CRISPR Cas9 dalam sel U2OS yang dilengkapi dengan sistem Flp-In/T-Rex. Menggunakan penggabungan semula terarah tapak berasaskan Flp, kami menyasarkan cDNA yang mengekodkan ERCC1WT atau ERCC1R156W berteg GFP ke tapak sasaran pengecaman Flp genomik (FRT) untuk mendayakan ekspresi terdorong daripada penganjur virus yang kuat. Analisis Western blot menunjukkan bahawa ERCC1WT dan ERCC1R156W dinyatakan pada tahap yang sama dan ungkapan mana-mana protein menyelamatkan tahap protein XPF yang dikurangkan yang diperhatikan dalam sel KO ERCC1-(Rajah 5 A). Oleh itu, sel-sel ini merupakan sistem model yang sangat baik untuk merungkai kesan khusus penggantian ERCC1R156W apabila dinyatakan pada tahap WT daripada kesan ekspresi ERCC1 yang lebih rendah dalam fibroblas pesakit dan sel epitelium KI.

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa mutasi missense dalam XPF boleh menyebabkan mislokalisasi ERCC1-XPF dalam sitoplasma (Ahmad et al., 2010). Selaras dengan ini, kami juga mengesan bahawa ~ 40 peratus daripada kumpulan protein ERCC1R156W disalahtempatkan ke sitoplasma, yang hanya ~ 15 peratus dalam sel pengekspres ERCC1WT (Rajah 5, B dan C). Penyetempatan ERCC1 yang salah ini juga meningkatkan pecahan XPF sitoplasma (Rajah 5, B dan C), menunjukkan bahawa ERCC1R156W mungkin sebahagiannya tersalah lipat.

Untuk menguji kemungkinan ini, kami melakukan eksperimen immunoprecipitation pada ERCC1WT-GFP dan ERCC1R156W-GFP diikuti oleh spektrometri jisim bebas label kuantitatif (MS) untuk memetakan interaksi pembezaan kedua-dua protein ERCC1. Yang penting, MS kuantitatif mengesahkan bahawa jumlah protein ERCC1WT-GFP dan ERCC1R156W-GFP yang sama telah ditarik ke bawah (Rajah 5 D). Secara mengejutkan, interaksi ERCC1R156W telah diperkaya untuk protein kejutan haba (HSP), khususnya keluarga HSPA, manakala interaksi dengan XPF dikurangkan secara kuantitatif berbanding dengan ERCC1WT (Rajah 5 D). Protein HSPA adalah pendamping lipatan protein yang menghalang pengagregatan protein tersalah lipat (Stetler et al., 2010). Eksperimen Co-imunoprecipitation (Co-IP) sememangnya mengesahkan bahawa ERCC1R156W-GFP sangat berinteraksi dengan HSPA4 berbanding dengan ERCC1WT (Rajah 5 E), mencadangkan salah lipatan separa ERCC1R156W.

Untuk menangani sejauh mana ERCC1R156W-XPF masih aktif sebagai endonuclease, kami membersihkan kompleks rekombinan daripada sel serangga Sf9 (Rajah S4 C). Prosedur kami yang telah ditetapkan sebelum ini melibatkan langkah penapisan gel yang membolehkan kami menilai sama ada ERCC1-XPF berada dalam keadaan dimerik atau terkumpul (Rajah 5 F, pecahan 2 dan 1, masing-masing). Hasil kompleks ERCC1R156W XPF rekombinan adalah lebih rendah dan menunjukkan tahap protein agregat yang lebih tinggi. Selain itu, kami juga melihat pengurangan dalam pecahan protein heterodimerik berbanding dengan ERCC1WT-XPF (Rajah 5 F). Namun begitu, rekombinan heterodimerik ERCC1R156W-XPF dalam pecahan 2 aktif sepenuhnya apabila diinkubasi dengan substrat DNA model gelung batang, manakala ERCC1-XPFD687A yang tidak aktif secara pemangkin, disertakan sebagai kawalan negatif, tidak mempunyai aktiviti hirisan (Rajah). 5 G). Penemuan ini mencadangkan bahawa ERCC1R156W-XPF sebahagiannya salah lipatan dan salah tempat, tetapi pecahan protein yang dilipat dengan betul masih aktif sebagai endonuklease.

Protein mutan ERCC1R156W gagal berinteraksi dengan cekap dengan faktor NER teras

Kami seterusnya membincangkan cara penggantian ERCC1R156W mempengaruhi NER menggunakan sel ERCC1-KO yang dibentuk semula. Oleh kerana penggantian R156W terletak betul-betul di bawah poket pengikat XPA dalam ERCC1 (Rajah 1 F), kami bertanya sama ada ERCC1R156W masih boleh berinteraksi dengan protein NER sebagai tindak balas kepada penyinaran UV. Untuk menguji ini, kami mengimunisasikan ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP atau GFP yang digabungkan dengan isyarat penyetempatan nuklear (GFP-NLS) sebagai kawalan daripada sel yang disinari UV dan seterusnya melakukan MS tanpa label. Dengan membandingkan ERCC1-GFP dengan GPF-NLS, kami mengenal pasti interaktor konstitutif serta akibat UV ERCC1. Analisis kami mendedahkan bahawa kedua-dua ERCC1WT dan ERCC1R156W berinteraksi dengan XPF dan protein perancah pembaikan khusus ICL SLX4 dan SLX4IP, walaupun secara kuantitatif dikurangkan dalam sel pengekspres ERCC1R156W (Rajah 6, A dan B). Secara mengejutkan, interaksi yang disebabkan oleh UV dengan subunit TFIIH XPB dalam sel ERCC1WT telah hilang sepenuhnya dalam sel ERCC1R156W (Rajah 6, A dan B). Eksperimen Co-IP mengesahkan bahawa ERCC1R156W gagal untuk mengaitkan sama ada dengan TFIIH atau XPA sebagai tindak balas kepada penyinaran UV, manakala interaksi teguh dikesan selepas tarik-turun ERCC1WT (Rajah 6 C dan Rajah S4, D dan E).

Pengambilan kompleks ERCC1-XPF kepada NER bergantung sepenuhnya pada XPA (Volker et al., 2001), menimbulkan persoalan sama ada ERCC1R156W masih direkrut ke tapak kerosakan DNA akibat UV. Untuk menangani perkara ini, kami memantau pengambilan ERCC1-GFP kepada lesi DNA yang disebabkan oleh UV menggunakan pengimejan sel hidup. Untuk tujuan ini, sel telah disinari dengan laser UV-C (266-nm), yang mencetuskan pengambilan pantas ERCC1WT-GFP dalam tempoh 60 saat pertama selepas penyinaran, mencapai dataran tinggi sekitar 120 s (Rajah 6, D dan E). Sebaliknya, hanya pengambilan ERCC1R156W-GFP yang sangat lemah boleh dikesan apabila penyinaran UV-C menggunakan keadaan yang sama (Rajah 6, D, dan E). Penemuan ini menunjukkan bahawa ketidakupayaan ERCC1R156W untuk berinteraksi dengan XPA sangat mengehadkan hubungannya dengan kompleks NER.

Penemuan kami dalam sel ERCC1-KO tersusun semula menunjukkan bahawa ERCC1R156W masih menyokong aktiviti pembaikan baki (~40 peratus) apabila dinyatakan pada tahap yang sama seperti ERCC1WT. Untuk cuba mengukur pembaikan sisa dalam fibroblas utama PV46LD dan PV50LD, yang menunjukkan pengurangan ketara protein mutan ERCC1R156W, kami melakukan eksperimen UDS di mana kami membenarkan sel untuk menggabungkan EdU untuk tempoh masa yang panjang (4 jam) untuk menangkap pembaikan sisa . Walaupun UDS masih di bawah ~ 10 peratus dalam sel XP1PD kekurangan XPA, dalam sel PV46LD dan PV50LD UDS meningkat daripada ~ 10 peratus kepada ~ 20 peratus UDS di bawah keadaan ini (Rajah 6 J dan Rajah S5 A). Penemuan ini menunjukkan bahawa protein mutan ERCC1R156W, yang dinyatakan pada tahap rendah dalam sel pesakit, menyokong aktiviti NER sisa, mungkin menjelaskan ciri klinikal ringan seperti XP yang dilihat pada kedua-dua adik-beradik. Di bawah keadaan ini, kami juga mengesan sisa UDS dalam sel ERCC1- kekurangan 165TOR (Jaspers et al., 2007) dan CS20LO (Kashiyama et al., 2013) yang dijelaskan sebelum ini pada tahap yang lebih tinggi daripada yang dikesan dalam sel PV46LD dan PV50LD (Rajah 6 J dan Rajah S5 A).

Kesan ERCC1R156W dalam pembaikan ICL

Semasa pembaikan ICL, protein perancah SLX4 merekrut ERCC1-XPF untuk melakukan hirisan mencabut cangkuk yang membolehkan pembaikan seterusnya. Analisis MS kami mendedahkan bahawa ERCC1R156W masih berinteraksi dengan SLX4, walaupun pada tahap yang dikurangkan berbanding dengan ERCC1WT (Rajah 6, A dan B). Eksperimen Co-IP sememangnya mengesahkan interaksi kuat ERCC1WT dengan SLX4, yang tidak terjejas oleh penyinaran UV, manakala interaksi dengan ERCC1R156W telah dikurangkan dengan kuat (Rajah 7 A). Untuk menangani sama ada interaksi yang dikurangkan ini menjejaskan pengambilan ERCC1 kepada ICL, kami menyinari sel tempatan dengan laser UV-A (365 nm) dengan kehadiran trioxsalen, yang merupakan terbitan psoralen yang membentuk ICL apabila penyinaran UV (Velimezi et al. , 2018). Penyinaran tempatan dengan laser UV-A mencetuskan pengambilan FANCD2 endogen hanya dalam sel yang tersensitisasi dengan trioxsalen, menunjukkan bahawa ICL telah diinduksi di bawah keadaan kami (Rajah S5 B). Kami dapat mengesan pengambilan GFP-ERCC1WT-GFP yang kuat kepada ICL tempatan, manakala pengambilan ERCC1R156W adalah lebih lemah (Rajah 7, B dan C), menunjukkan bahawa interaksi yang berkurangan dengan SLX4 juga menurunkan kecekapan ERCC1R156W direkrut untuk ICL. Walau bagaimanapun, ujian kemandirian klonogenik selepas pendedahan kepada agen pengaruh ICL mitomycin C (MMC) menunjukkan bahawa ERCC1R156W menyelamatkan hipersensitiviti sel ERCC1-KO kepada MMC, walaupun kurang sedikit daripada ERCC1WT (Rajah 7 D). Eksperimen ini menunjukkan bahawa protein mutan ERCC1R156W menyokong pembaikan ICL hampir dengan tahap WT apabila protein mutan dinyatakan tahap hampir normal.

Untuk menangani sama ada fibroblas pesakit PV46LD dan PV50LD, yang menunjukkan ekspresi ERCC1R156W yang berkurangan dengan ketara, masih menyokong pembaikan ICL yang cekap, kami melakukan ujian pecah kromosom yang disebabkan oleh MMC. Kaedah ini mengukur pecahan kromosom yang disebabkan oleh MMC dalam sel metafasa yang disebabkan oleh kekurangan dalam pembaikan ICL. Walaupun sel 48BR (WT) terkumpul sangat sedikit rehat selepas MMC, kami mengukur pecahan kromosom yang disebabkan oleh MMC yang ketara dalam sel WK8103 yang diperoleh pesakit Fanconi (Poll et al., 1984; Rajah 7 E). Kedua-dua PV46LD dan PV50LD menunjukkan fenotip perantaraan dengan peningkatan pembentukan pecah sebagai tindak balas kepada MMC, walaupun tidak pada tahap yang sama seperti sel Fanconi (Rajah 7 E). Selaras dengan ini, sel PV50LD-hTERT dan sel RPE1-hTERT R156W-KI sensitif kepada MMC dalam ujian survival klonogenik, manakala sel VU121F-hTERT yang kekurangan FANCF (Joenje et al., 1997) dan terutamanya ERCC{ {24}}Sel KO adalah hipersensitif kepada MMC (Rajah 7 F). Kesimpulannya, ungkapan ERCC1R156W yang lebih rendah dan interaksi yang berkurangan dengan SLX4 mempunyai kesan yang besar terhadap pembaikan ICL, walaupun sel pesakit tidak begitu sensitif seperti Fanconi atau sel ERCC1-KO penuh. Ini mungkin menjelaskan mengapa tiada ciri seperti FA yang kelihatan pada dua beradik itu.

Kesan ERCC1R156W dalam pembaikan DSB

Memandangkan peranan ERCC1-XPF dalam pembaikan DSB, kami juga menangani sejauh mana ERCC1R156W masih menyokong proses pembaikan ini. Untuk tujuan ini, kami melakukan pengimejan sel hidup selepas penyinaran laser UV-A dalam sel yang disensitisasi dengan BrdU untuk menghasilkan DSB tempatan (Lukas et al., 2003). Pengambilan XRCC4 endogen boleh dikesan di tapak penyinaran laser UV-A tempatan hanya selepas pemekaan BrdU (Rajah S5 C), menunjukkan bahawa DSB telah diinduksi di bawah keadaan kami. Pengambilan ERCC1WT-GFP ke tapak DSB telah dikesan dengan jelas, sedangkan ini adalah lebih lemah untuk ERCC1R156W (Rajah 8, A dan B). Walau bagaimanapun, ujian kelangsungan hidup klonogenik selepas sinaran mengion (IR) tidak menunjukkan perbezaan antara sel ERCC{14}}KO yang dibentuk semula dengan sama ada ERCC1WT atau ERCC1R156W (Rajah 8 C), menunjukkan bahawa protein ERCC1 mutan menyokong pembaikan DSB.

Untuk menangani ini juga dalam sel pesakit, kami melakukan ujian survival klonogenik dalam fibroblas yang diabadikan hTERT selepas terdedah kepada peningkatan dos IR. Kekurangan fibroblas dalam XRCC4 (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) jelas sensitif kepada IR yang sudah berada pada dos terendah (2 Gy). Walau bagaimanapun, sel PV50LD-hTERT tidak begitu sensitif pada 2 Gy dan hanya menunjukkan sensitiviti yang meningkat pada dos yang lebih tinggi (Rajah 8 D). Sebenarnya, sel ERCC1-KO penuh dan sel R156W-KI hanya memaparkan sensitiviti kecil kepada IR (Rajah S5 D), mencadangkan sumbangan kecil ERCC1-XPF untuk melindungi sel daripada IR. Kaedah lain untuk menilai kapasiti pembaikan DSB ialah memantau resolusi fokus H2AX yang disebabkan oleh IR dalam masa. Kedua-dua 48BR dan fibroblas pesakit menunjukkan pelepasan normal fokus H2AX dalam masa 24 jam selepas penyinaran dengan dos fisiologi 2 Gy (Rajah 8, E dan F; dan Rajah S5 E). Walau bagaimanapun, rawatan sel 48BR dengan perencat protein kinase (DNA-PK) yang bergantung kepada DNA menekan sepenuhnya resolusi fokus H2AX pada semua titik masa yang dianalisis (Rajah 8, E dan F). Penemuan ini menunjukkan bahawa sel PV46LD dan PV50LD mahir sepenuhnya dalam pembaikan DSB di bawah beban kerosakan yang rendah.