Bahagian1: Kesan Asites Anti-Malignan Daripada Jumlah Diterpenoid Daripada Radix Euphorbiae Ebracteolatae Disebabkan Oleh Perubahan Aquaporin Melalui Menghalang Aktiviti PKC dalam Buah Pinggang

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

Abstrak: Kajian ini menilai kesan anti-ascites daripada jumlah diterpenoid yang diekstrak daripada Euphorbiae ebracteolate Radix(TDEE) pada tikus ascitic malignan dan menjelaskan mekanisme asasnya. TDEE diekstrak oleh diklorometana dan tertakluk kepada kromatografi lajur. Ketulenan enam diterpenoid yang diasingkan daripada TDEE ditentukan 77.18 peratus oleh HPLC. TDEE (3 dan 0.6 g herba mentah/kg, po) mengurangkan asites dan meningkatkan pengeluaran air kencing. Sementara itu, analisis daya maju sel tumor, kitaran, dan apoptosis menunjukkan bahawa TDEE tidak mempunyaiantitumoraktiviti. Di samping itu, tahap ekspresi aquaporin (AQPs) dan tahap translokasi membran protein kinase C (PKC) dan PKC dalambuah pinggangdan sel diukur. TDEE mengurangkan tahap AQP1-4 dan menghalang ekspresi PKC dalam pecahan membran. Empat diterpenoid utama, kecuali sebatian 2, mengurangkan tahap AQP1 dalam sel-2 buah pinggang manusia. Sebatian 4 dan 5 menghalang ekspresi AQP2-4 dalam sel saluran pengumpul medulla dalam murine. Perencatan akibat diterpenoid bagi ekspresi AQP1-4 telah disekat oleh phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA; agonis PKC). Diterpenoid daripada TDEE adalah komponen anti-ascites utama. Kesan anti-ascites diterpenoid mungkin dikaitkan dengan perubahan dalam AOP dalam buah pinggang untuk menggalakkan diuresis. Perencatan ekspresi AOP1-4 oleh TDEE adalah berkaitan dengan perencatan pengaktifan PKC.

Kata kunci: Euphorbia ebracteolate Hayata; diuresis; komponen bioaktif; terpenoid; sel buah pinggang; perencat PKC

Klik untuk mengetahui manfaat herba cistanche

1. Pengenalan

Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) ialah ahli genus Euphorbia dalam keluarga Euphorbiaceae dan digunakan secara meluas dalam rawatan kembung perut dan edema, jangkitan parasit, batuk kering, dan penyakit lain dalam perubatan tradisional Cina(TCM)[1]. Akar EEH (EER) mengandungi pelbagai terpenoid, yang dianggap sebagai komponen yang berkesan. Kajian terbaru tentang terpenoid telah dijalankan untuk menentukan merekaanti-radang, antivirus,anti-tuberkulosis dan kesan lain secara in vitro [2-5]. Walau bagaimanapun, penyiasatan penyelidikan asas mengenai kesan tradisional EER dalam rawatan kembung perut dan edema adalah terhad. Menurut teori TCM, EER dengan cepat boleh menghapuskan distensi abdomen dan edema dengan menggalakkan kencing dan cirit-birit [6]. Kajian terdahulu kami telah menunjukkan bahawa jumlah diterpenoid daripada EER (TDEE) boleh menyebabkan cirit-birit dengan mengawal selia ekspresi aquaporin (AQP)-1 dan AQP3 [7]. Walau bagaimanapun, sehingga kini, bahan berkesan anti-ascites dalam EER masih tidak jelas.

Kembung perut dan edema digambarkan sebagai asites dalam perubatan moden. Ascites adalah pengumpulan patologi cecair peritoneal [8]. Terdapat banyak punca pembentukan asites, seperti sirosis, tumor, kegagalan jantung, dan sindrom nefrotik [9]. Kejadian asites berkaitan dengan hipertensi portal, yang membawa kepada vasodilatasi arteri splanchnic, pengurangan dalam jumlah peredaran yang berkesan, pengaktifan sistem vasokonstriktor endogen, dan pengekalan air yang gemar dalam buah pinggang [10]. AQP adalah pengangkut air membran pantas untuk melintasi halangan epitelium dan endothelial dan dengan itu memainkan peranan asas dalam mengekalkan keseimbangan air [11]. Banyak kajian telah menunjukkan bahawa AQP memainkan peranan penting dalam pembentukan dan gangguan asites [12-15]. Terdapat banyak jenis AQP dalam buah pinggang, seperti AQP1, AQP2, AQP3, dan AQP4[16]. Oleh kerana TDEE boleh mengawal ekspresi AQP dalam usus [7], kami mencadangkan TDEE boleh digunakan dalam rawatan asites dengan mengawal AQP dalam buah pinggang.

AQP memainkan peranan penting dalam pembentukan air kencing, bagaimanapun, mekanisme mengawal selia ekspresi AQP dalam buah pinggang belum dijelaskan. Pada masa ini, hanya sebilangan terhad laporan menunjukkan bahawa AQP dikawal melalui laluan protein kinase C(PKC) dan protein kinase A(PKA) [17-20]. Sesetengah terpenoid yang diasingkan daripada Euphorbia (cth, uphold dan ingenol 3-angelate) mempunyai kesan pengawalseliaan pada PKC. TDEE boleh mengawal ekspresi AQP dalam buah pinggang melalui laluan PKC.

Dalam kajian ini, kami mengekstrak TDEE dan menilai kesan anti-ascitesnya serta ekspresi AQP yang dianalisis, PKC, dan aktiviti PKA dalam buah pinggang tikus ascitic. Kemudian, kami mengasingkan dan membersihkan diterpenoid utama daripada TDEE untuk menyiasat kesannya ke atas protein AQPs dan tahap ekspresi mRNA dalam dua jenissel buah pinggang(sel buah pinggang manusia-2 (HK-2) dan sel saluran pengumpul medula dalam murine(mIMCD3)). Akhir sekali, kami memilih sebatian diterpenoid (euphebracteolatin A), menggunakan phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA; agonis PKC) untuk mengaktifkan laluan PKC, untuk mengenal pasti sama ada ekspresi AQP dalam buah pinggang dikawal selia melalui laluan PKC. Kajian ini bertujuan untuk menentukan kesan anti-ascites TDEE dalam EER dan menyediakan asas untuk aplikasi klinikal EER dan pengenalpastian ubat-ubatan calon untuk kesan diuresis dan anti-ascitic.

2. Keputusan

2.1.Kesan TDEE terhadap Berat Cecair Ascitic, Berat Air Kencing dan Kandungan Air Najis

Rawatan tikus ascitic dengan jumlah ekstrak EER (TEER) dan TDEE (3 dan 0.6 g herba mentah/kg, po) dan furosemide (ubat positif) mengurangkan peningkatan berat bendalir ascitic dengan ketara berbanding model. kumpulan (Rajah 1A). Rajah 1C menunjukkan bahawa berat air kencing dengan ketara (m.s<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. Kesan TDEE pada Tahap Albumin Serum dalam Tikus Ascitic

Albumin serum adalah protein yang paling banyak dalam plasma vertebrata dan boleh mengekalkan tekanan osmotik darah dan mengawal pengangkutan air. Rajah 1B menunjukkan bahawa pengeluaran asites dalam tikus model menyebabkan penurunan ketara dalam albumin serum berbanding kumpulan normal. Selepas rawatan dengan furosemide, TEER dan TDEE(3 dan 0.6 g herba mentah/kg, po), tahap albumin serum telah pulih dengan berkesan berbanding kumpulan model. Tiada peningkatan dalam indeks ini diperhatikan dalam kumpulan NTDEE.

2.3. Kesan TDEE terhadap Daya tahan Sel Tumor, Kitaran dan Apoptosis dalam Tikus Ascitic

Dalam asites malignan, sel tumor terapung dalam cecair ascitic. Kami menilai sama ada pengurangan asites berkaitan dengan aktiviti antikanser TEER dan TDEE. Keputusan menunjukkan bahawa ubat-ubatan ini tidak menghalang daya maju sel tumor (Rajah 2A) dan tidak membawa kepada penangkapan kitaran sel (Rajah 2B) dan apoptosis (Rajah 2C, D).

2.4.Kesan TDEE pada Ekspresi AQP dalam Buah Pinggang Tikus Ascitic

Buah pinggang adalah organ penting untuk penyerapan semula air dan kepekatan air kencing. Saluran air AQP menjadi pengantara pengangkutan air yang cepat dalam buah pinggang. Oleh itu, kami mengkaji ekspresi AQP dalam buah pinggang. Rajah 3 menunjukkan bahawa peningkatan asites mempunyai sedikit kesan ke atas AQPsexpression dalam buah pinggang berbanding dengan kumpulan normal. Apabila dirawat dengan TEER dan TDEE, ekspresi protein AQP1, AQP2, AQP3, dan AQP4 adalah lebih rendah daripada kumpulan model pada kebanyakan dos. TEER menghasilkan penurunan ketara dalam ekspresi AQP2, AQP3 dan AQP4 pada dos 3.0 dan {{10}}.6g herba mentah/kg, manakala ungkapan AQP1 hanya dikurangkan pada dos rendah (0.6g herba mentah/kg). Terutama, TDEE mempunyai kesan perencatan yang sama pada ekspresi AQP3 dan AQP4 sebagai TEER pada dua dos. Perbezaan antara TDEE dan TEER ialah TDEE menghalang ekspresi AQP1 dan AQP2 hanya pada dos yang tinggi (3g herba mentah/kg).NTDEE mempunyai kesan lemah pada tahap AQP dalam buah pinggang, dan hanya mengawal ekspresi protein AQP4 pada dos 3g herba mentah/kg.

2.5.Kesan TDEE terhadap Pengaktifan PKC dan PKA dalam Buah Pinggang Tikus Ascitic

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa ekspresi AQP boleh dikawal oleh pengaktifan PKC dan PKA. Kami mengkaji kesan TDEE pada pengaktifan PKC-a, PKC- dan PKA. Pengaktifan PKC diukur dengan translokasinya dari sitosol ke membran sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, dan B, tahap ekspresi protein PKC- dalam pecahan membran telah menurun dengan ketara dalam kumpulan TDEE, manakala tidak terdapat kesan yang ketara pada tahap ekspresi protein membran PKC-. Phospholipase C(PLC) ialah molekul isyarat huluan penting yang mengantara pengaktifan rawatan PKC.TDEE tidak mempunyai sebarang kesan ke atas tahap fosforilasi dan jumlah PLC (Rajah 4D). PKA ialah heterotetramer yang terdiri daripada dua subunit pemangkin yang terikat kepada dua subunit pengawalseliaan. Pembebasan subunit pemangkin adalah ciri pengaktifan PKA. Dalam Rajah 4C, TDEE tidak menjejaskan ekspresi subunit pemangkin PKA.

2.6.Penentuan Kandungan Enam Diterpenoid dalam TDEE oleh Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)

Keputusan eksperimen haiwan menunjukkan bahawa TDEE adalah pecahan berkesan utama EER. Kami mengasingkan enam diterpenoid (struktur sebatian 1 hingga 6 ditunjukkan dalam Rajah 5; data spektrum telah ditambah kepada Bahan Tambahan) daripada TDEE dan menggunakan sebatian ini sebagai piawai untuk menentukan kandungan diterpenoid dalam TDEE. Kromatogram HPLC untuk TDEE dan enam piawaian diterpenoid dibentangkan dalam Rajah 6. Kandungan sebatian 1 hingga 6 masing-masing ialah 1.07 peratus ,12.00 peratus ,12.69 peratus ,9.15 peratus , 39.26 peratus dan 3.02 peratus, perakaunan. untuk 77.18 peratus daripada TDEE.

2.7. Kesan Diterpenoid daripada TDEE pada Ekspresi AQP dalam Sel Buah Pinggang

TDEE ialah pecahan aktif EER yang menghalang asites dengan mengurangkan ekspresi AQP1, AQP2, AQP3, dan AQP4 dalam buah pinggang. Pada masa yang sama, TDEE juga mengurangkan ekspresi protein dan mRNA AQP1, AQP2, AQP3 dan AQP4 dengan ketara dalam sel-2 buah pinggang manusia(HK-2)dan sel salur pengumpul medulla dalaman murine (mIMCD3) (Rajah 7). Komponen utama TDEE ialah diterpenoid. Kami membandingkan kesan antara campuran TDEE dan diterpenoids (enam diterpenoid terpencil dicampur mengikut kandungannya dalam TDEE). Keputusan menunjukkan bahawa kesan perencatan campuran diterpenoid dan TDEE pada ekspresi AQP1, AQP2, AQP3, dan AQP4 adalah serupa (Rajah 7). Aktiviti empat diterpenoid utama daripada TDEE dinilai secara in vitro. Rajah 8 dan 9 menunjukkan bahawa tahap ekspresi protein dan mRNA AQP1 dalam sel HK-2 telah dikurangkan dengan ketara oleh sebatian 3,4 dan 5. Rawatan dengan sebatian 2 tidak menyebabkan penurunan ketara dalam AOP1 pada protein dan mRNA peringkat. Untuk sebatian ini, sebatian 3 (diterpenoid jenis ent-abietane) adalah lebih aktif daripada sebatian lain. Dalam sel mlMCD3, empat sebatian diterpenoid menyebabkan darjah perencatan berbeza ekspresi AQP2, AQP3 dan AQP4. Keputusan ekspresi protein dan gen dibentangkan dalam Rajah 8 dan 9. Sebatian 4 dan 5 mempunyai kesan perencatan AQP2, AQP3, dan AQP4 yang kuat berbanding dengan kumpulan kawalan pada tahap gen dan protein. Kompaun 2 dan 3 hanya menunjukkan kesan yang berbeza pada ekspresi mRNA Aqp2, Aqp3, dan Aqp4.

2.8.Kesan Pengaktif PKC terhadap Perencatan AQPs akibat Diterpenoid

Keputusan daripada eksperimen haiwan menunjukkan bahawa TDEE secara serentak menghalang aktiviti PKC dan ekspresi AQP dalam buah pinggang tikus yang mengandungi sel tumor H22. Untuk menjelaskan lebih lanjut sama ada PKC mengawal ekspresi AQP dalam sel buah pinggang, agonis PKC (PMA) telah dirawat terlebih dahulu dalam sel HK-2 dan mIMCD3 pada 1.5 jam sebelum rangsangan diterpenoid (Euphebracteolatin A). Perubahan ekspresi membran PKC, AOP1, AOP2, AOP3, dan AOP4 telah dikesan. Keputusan Western Bolt menunjukkan bahawa euphebracteolatin A boleh mengurangkan ekspresi protein membran PKC , AOP1, AOP2, AOP3, dan AOP4, dan kesannya boleh dilemahkan oleh prarawatan PMA (Rajah 10).