BahagianⅠ: AKT1 Mitokondria Tiub Diaktifkan Semasa Kecederaan Reperfusi Iskemia Dan Mempunyai Peranan Kritikal dalam Kecenderungan Kepada Penyakit Buah Pinggang Kronik.
Apr 03, 2023
Abstrak
Disfungsi tubular renal boleh menyebabkan kecederaan buah pinggang akut dan berubah menjadi penyakit buah pinggang kronik. Walaupun mitokondria tiub dikaitkan dengan patofisiologi kegagalan buah pinggang, mekanismenya tidak jelas. Di sini, kami menunjukkan bahawa kecederaan reperfusi iskemia mendorong translokasi akut dan pengaktifan protein kinase B mitokondria (juga dikenali sebagai AKT1) dalam tubul renal. Kami membuat hipotesis bahawa isyarat AKT1 mitokondria boleh menghalang perkembangan kecederaan buah pinggang akut dan penyakit buah pinggang kronik yang berikutnya. Untuk menguji ramalan ini, kami menggunakan strategi Cre-Lox untuk menjana dua strain tikus transgenik khusus tubul renal baru yang mendorong ekspresi sama ada AKT1 dominan-negatif yang disasarkan mitokondria atau AKT1 aktif secara konstitutif. dalam tikus dominan AKT{10}}negatif yang disasarkan mitokondria, perencatan AKT1 mitokondria memburukkan azotemia, kecederaan tiub, fibrosis buah pinggang, glomerulosklerosis dan kemandirian selepas kecederaan reperfusi iskemia secara negatif. Sebaliknya, dalam tikus AKT1 aktif yang disasarkan mitokondria, AKT1 mitokondria tiub yang dipertingkatkan menandakan kecederaan buah pinggang yang dilemahkan, fungsi buah pinggang yang dilindungi, dan kemandirian yang lebih baik selepas kecederaan reperfusi iskemia (masing-masing 76.9 peratus berbanding 20.8 peratus). Apabila mitokondria AKT1 dihalang, peningkatan dalam respirasi mitokondria yang tidak bergandingan dan tekanan oksidatif ditemui dalam tubul renal, menyokong peranan disfungsi mitokondria dalam patofisiologi kegagalan buah pinggang. Oleh itu, kajian kami mencadangkan bahawa laluan isyarat AKT1 mitokondria tiub mungkin menjadi sasaran baru untuk pembangunan strategi baharu untuk mencegah dan merawat kecederaan buah pinggang dengan lebih baik.
Pernyataan Terjemahan
Kecederaan buah pinggang akut (AKI) dan perkembangan penyakit buah pinggang kronik (CKD) seterusnya adalah masalah kesihatan utama. Kami membangunkan model tetikus transgenik dan menentukan peranan pengaktifan AKT mitokondria tiub renal proksimal dalam AKI dan CKD. Mekanisme penyelamat perlindungan buah pinggang ini mungkin menjadi sasaran baharu untuk membangunkan strategi baharu untuk mencegah dan merawat AKI dan CKD dengan lebih baik. Kajian masa depan harus mengesahkan penglibatan laluan isyarat AKT mitokondria dalam kecederaan buah pinggang manusia dan meneroka sasaran dadah laluan AKT1 mitokondria.
Kata kunci
Mitokondria Akt1; Kecederaan Refusi Iskemia; Kecederaan Buah Pinggang Akut; Penyakit buah pinggang yang kronik;Ekstrak cistanche.
Klik di sini untuk mendapatkanManfaat cistanche untuk buah pinggang
pengenalan
Kecederaan buah pinggang akut (AKI) dan perkembangan penyakit buah pinggang kronik (CKD) seterusnya adalah masalah kesihatan utama. Pada masa ini, rawatan perubatan khusus untuk keadaan penyakit ini adalah terhad, sebahagiannya disebabkan oleh kekurangan pemahaman tentang mekanisme molekul yang mendasari kecederaan buah pinggang. Buah pinggang adalah salah satu organ yang paling memerlukan tenaga dalam badan, dan mitokondria, yang diperlukan untuk memudahkan pengangkutan aktif, mengekalkan kecerunan elektrokimia yang betul, dan mengawal homeostasis cecair, adalah sumber utama pengeluaran ATP selular melalui fosforilasi oksidatif. gangguan dalam pengeluaran ATP dan disfungsi mitokondria boleh menyebabkan peningkatan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS), yang seterusnya menjejaskan fungsi sel buah pinggang dan menyebabkan kematian sel. Walaupun kerosakan dan disfungsi mitokondria telah dilaporkan pada pesakit dengan penyakit buah pinggang dan model haiwan kecederaan buah pinggang akut dan kronik, pengetahuan tentang peranan patofisiologi mitokondria dalam kecederaan buah pinggang masih tidak lengkap.
Fungsi mitokondria yang dipertingkatkan boleh menghalang kecederaan reperfusi iskemia (IRI). Semasa fasa iskemia IRI, kekurangan oksigen menghalang pemindahan elektron dalam rantai pernafasan mitokondria dan mengurangkan pengeluaran ATP. Kemasukan ion natrium dan pengeluaran proton seterusnya membantu memulihkan pH normal dan boleh menggalakkan kemandirian sel dengan memulihkan isipadu intrasel Semasa reperfusi, pemulihan aliran darah dikaitkan dengan peningkatan spesies oksigen reaktif (ROS), Ca2 ditambah aliran masuk ke mitokondria, kehilangan kecerunan elektrokimia transmembran mitokondria, dan pengaktifan laluan apoptosis Perubahan intraselular ini mungkin memudaratkan sel yang bertahan selepas kecederaan iskemia awal.
AKI lebih kerap berlaku pada pesakit yang dimasukkan ke hospital dan boleh mempercepatkan permulaan CKD baharu, memburukkan lagi CKD sedia ada, dan membawa kepada kematian buah pinggang Mekanisme yang mendasari peralihan daripada AKI kepada CKD tidak jelas. Kajian haiwan terkini mencadangkan bahawa disfungsi tiub buah pinggang memainkan peranan penting dalam perkembangan AKI kepada CKD, mencerminkan peralihan daripada AKI kepada CKD pada manusia. Memahami laluan isyarat yang mengawal kecederaan buah pinggang akan membolehkan kami mengenal pasti sasaran terapeutik baharu untuk mengurangkan kecederaan buah pinggang dan mencegah perkembangan AKI kepada CKD.
Hubungan antara laluan isyarat sitoplasma dan fungsi mitokondria semasa kecederaan buah pinggang sebahagian besarnya tidak diketahui. Fungsi mitokondria berkait rapat dengan isyarat sitoplasma, organel lain, dan laluan nuklear Makmal kami telah mengenal pasti pengaktifan dan translokasi AKT1 kepada mitokondria sebagai langkah utama dalam melindungi kardiomiosit daripada kecederaan IRI dengan mengawal selia kompleks fosforilasi oksidatif, meningkatkan kecekapan fosforilasi oksidatif dan mengurangkan ROS. Walau bagaimanapun, sama ada IRI boleh mencetuskan pemindahan AKT1 yang diaktifkan dari sitoplasma ke mitokondria dalam tubul renal tidak diketahui. Sekiranya AKT1 mitokondria boleh diaktifkan dalam tubul renal sebagai tindak balas kepada kecederaan buah pinggang, adalah penting untuk menilai peranan patofisiologi mitokondria AKT1 dalam perkembangan kecederaan buah pinggang akut (AKI) dan penyakit buah pinggang kronik (CKD). Di sini, kami menggunakan dua model tetikus transgenik khusus tubul renal inducible yang memodulasi isyarat AKT1 mitokondria dalam vivo dan menunjukkan peranan perlindungan pengaktifan AKT1 mitokondria tubular renal semasa IRI terhadap AKI dan pembangunan CKD berikutnya.
Suplemen cistanche
Keputusan
Pengaktifan AKT1 Mitokondria dalam Tubul Renal apabila IRI
Kami mula-mula menyiasat sama ada IRI mengaktifkan AKT1 dalam mitokondria buah pinggang. Untuk tujuan ini, kami menubuhkan model IRI buah pinggang dengan mengikat arteri buah pinggang kiri selama 30 minit diikuti oleh nefrectomy kontralateral (Nx). Ligasi arteri buah pinggang kiri diterbalikkan untuk menamatkan fasa iskemia, reperfusi dilakukan, dan buah pinggang kiri dituai pada selang masa yang ditunjukkan.
Korteks buah pinggang yang diperkaya dalam tubul buah pinggang telah diasingkan dan mitokondria disediakan melalui subfraksinasi. Selepas reperfusi, kelimpahan pAKT1 dan AKT1 mitokondria meningkat, mencadangkan pemindahan AKT1 diaktifkan ke dalam mitokondria (Rajah 1A). Ini serupa dengan apa yang kita perhatikan dalam miokardium berbanding dengan kawalan kendalian palsu atau kawalan buah pinggang yang direseksi, di mana AKT1 mitokondria dinaikkan dengan ketara 30-60 minit selepas reperfusi (Rajah 1A dan B) (n= 11-15). Mitokondria pAKT1 juga meningkat. Keputusan ini menunjukkan bahawa pengaktifan dan translokasi AKT1 yang disebabkan oleh IRI kepada mitokondria buah pinggang. Pewarnaan iHC mengesahkan fosforilasi AKT1 dalam tubul renal selepas IRI (Rajah 1C). Pewarnaan latar belakang untuk pAKT1 adalah minimum dalam tubul buah pinggang kawalan yang dikendalikan palsu, manakala pAKT1 secara mendadak dinaikkan dalam tubul buah pinggang selepas IRI (Rajah 1C dan 1D). Tiada pAKT1 dilihat di mana-mana kawasan buah pinggang kecuali tubulus. untuk mengesahkan penyetempatan subselular pAKT1 dalam tubulus, pAKT1 telah diwarnai dalam kombinasi dengan penanda mitokondria. Penyetempatan bersama pAKT1 dan mitokondria yang ketara diperhatikan dalam sel tiub buah pinggang di IRI (Rajah 1E). Bersama-sama, keputusan ini mencadangkan pemindahan IRI dan pengaktifan AKT1 kepada mitokondria.
Rajah 1. Translokasi akut yang disebabkan oleh reperfusi iskemia dan pengaktifan AKT1 dalam mitokondria buah pinggang.
Penjanaan tikus transgenik dengan ekspresi khusus tubul renal yang boleh diinduksi bagi AKT negatif dominan dalam mitokondria
Untuk menguji hipotesis bahawa pengaktifan AKT1 mitokondria tiub renal semasa IRI melindungi buah pinggang daripada AKI dan perkembangan CKD seterusnya, kami menghasilkan model tetikus transgenik yang membolehkan ekspresi tamoxifen (TAM) yang disebabkan oleh penargetan mitokondria khusus tiub AKT1 negatif dominan. AKT1 negatif dominan (mdnAKT) dan jujukan penargetan mitokondria telah ditambahkan pada terminal N. Ekspresi bersyarat tamoxifen transgen AKT1 telah dimediasi menggunakan pCALNL (lihat Bahan dan Kaedah). Untuk mengecualikan kesan mengelirukan yang dikaitkan dengan penyepaduan rawak tatasusunan transgen dalam genom, satu salinan transgen telah diperkenalkan oleh penggabungan semula homolog dalam sel ES dengan transgen yang disasarkan pada lokus Gt(ROSA) 26atau pada kromosom. Tikus dua gen (KMDAKT) diperoleh dengan menyeberangi tikus mdnAKT yang disebabkan oleh tam dengan tikus KSP-CreERT2 hemizygous, di mana aktiviti Cre yang disebabkan oleh tam didorong oleh promoter calmodulin 16 khusus sel tubular renal. aktiviti Cre akibat suntikan tam, mitokondria terpencil, dan protein mitokondria yang dipisahkan oleh SDS-PAGE untuk immunoblotting. Keputusan menunjukkan bahawa TAM berjaya mendorong ekspresi mutan AKT1. Protein mutan tidak dapat dikesan dalam tikus KMDAKT, tikus KSPCreERT2, dan tikus jenis liar (suntikan minyak jagung).
Untuk mengesahkan ekspresi khusus buah pinggang, protein mitokondria diekstrak daripada tisu yang berbeza selepas suntikan TAM. AKT1 mutan yang ditagnya hanya diekspresikan dalam buah pinggang. Bahagian buah pinggang telah diwarnai dengan antibodi anti-tagnya dan Mitotracker mitokondria untuk pengimejan imunofluoresensi. Keputusan menunjukkan bahawa semua mutan AKT1 telah diwarnai dengan antibodi tag-Nya dan disetempatkan kepada mitokondria. Tiada mutasi AKT1 dikesan dalam glomeruli. Aktiviti enzimatik mitokondria AKT1 dianalisis menggunakan GSK3 rekombinan untuk mengesahkan peranan negatif utama dalam mitokondria tubul KMDAKT yang dirawat tam. Oleh kerana AKT1 mitokondria tubul renal diaktifkan oleh IRI, kami membandingkan aktiviti enzimatik AKT1 dalam mitokondria yang diasingkan daripada tikus yang dirawat tam dan tikus yang dirawat minyak jagung selepas IRI. Keputusan menunjukkan bahawa aktiviti AKT1 mitokondria buah pinggang telah dihalang dengan ketara dalam tikus KMDAKT yang dirawat TAM. Oleh itu, garis tetikus transgenik ini adalah model yang baik untuk mengkaji peranan AKT1 dalam mitokondria tiub.
Faedah cistanche
Perencatan tubul renal mitokondria AKT memburukkan IRI dalam vivo
IRI diinduksi dalam iskemia buah pinggang unilateral. Dalam siri eksperimen terakhir, AKT1 terfosforilasi hampir tidak dapat dikesan dalam mitokondria tubul renal proksimal. Tiada perbezaan ketara dalam histologi buah pinggang, nitrogen urea darah (BUN), dan kreatinin serum (Cr) diperhatikan dalam tikus KMDAKT yang disuntik minyak jagung dan disuntik tam, menunjukkan bahawa isyarat AKT1 mitokondria tidak mempunyai peranan penting dalam struktur dan fungsi buah pinggang pada peringkat awal. sebelum induksi IRI. Untuk menyiasat sama ada mitokondria AKT1 memainkan peranan perlindungan semasa IRI, IRI unilateral digunakan untuk mendorong AKI dalam tikus minyak jagung atau tikus TAM-KMDAKT. tidak terdapat perbezaan dalam tahap BUN atau Cr yang diperoleh sejurus selepas induksi IRI, tetapi dalam tikus TAM-KMDAKT, kedua-dua tahap BUN dan Cr telah meningkat dengan ketara selepas 45 hari. Keputusan ini menunjukkan bahawa pengaktifan AKT1 mitokondria yang disekat dalam tubul renal semasa IRI memburukkan lagi perkembangan lewat disfungsi buah pinggang. analisis histologi bahagian buah pinggang yang diwarnai H&E menunjukkan bahawa kecederaan buah pinggang bertambah teruk pada tikus TAM-KMDAKT. Skor kecederaan tubular renal Jablonski adalah lebih tinggi dengan kehilangan sempadan berus tiub, lisis tiub dan lebih banyak serpihan dalam lumen tiub (p=0.018). Untuk mengecualikan kesan TAM atau Cre recombinase, kami juga menganalisis tikus KSP/CreERT2 yang disuntik TAM, dan skor Jablonski adalah serupa dalam tikus minyak jagung KMdakt dan TAM-KSP/CreERT2 pada hari ke-7 selepas IRI (Rajah 3D) (p{{ 19}}.7613). Data ini menunjukkan bahawa penemuan kami tidak dikelirukan oleh kesan TAM atau Cre recombinase. Dalam tikus TAM-KMDAKT selepas IRI, pewarnaan trichrome Masson menunjukkan kawasan fibrotik yang lebih tinggi ( peratus ) (p<0.001), disertai dengan struktur tiub yang tidak teratur dengan tuangan dan serpihan intra-luminal. ekspresi col1a meningkat, selaras dengan pewarnaan trichrome Masson. Ekspresi tGF tidak meningkat, menunjukkan bahawa mitokondria AKT1 tidak mengawal tindak balas keradangan. Selepas IRI, ekspresi penanda kecederaan tiub- KIM -1 telah meningkat dalam kumpulan TAM-KMDAKT, mengesahkan peningkatan kecederaan buah pinggang dalam kumpulan TAM-KMDAKT (p=0.002).
Pewarnaan TUNEL digunakan untuk menilai apoptosis sel buah pinggang. Bilangan sel apoptosis meningkat dengan ketara dalam tubul (p{{0}}.0054) dan glomeruli (p<0.001) tikus TAM-KMDAKT berbanding kumpulan kawalan. Adalah dicadangkan bahawa perencatan AKT1 mitokondria tiub semasa IRI memburukkan lagi kematian sel tiub dan kecederaan glomerular. Selaras dengan ini, pengaktifan kedua-dua caspase 9 (promoter) dan caspase 3 (executor) telah meningkat dengan ketara dalam sel epitelium tiub renal TAM-KMDAKT. Untuk meneroka lebih lanjut perubahan glomerular kronik, analisis pewarnaan asid-Schiff (PAS) berkala dilakukan pada bahagian buah pinggang untuk mengukur glomerulosklerosis. Walaupun tiada perbezaan dalam glomerulosklerosis dilihat pada 7 hari selepas IRI (p=0.2634), lebih banyak glomerulosklerosis ditemui dalam tikus TAM-KMDAKT pada 45 hari selepas IRI (p<0.001). Penemuan ini menunjukkan bahawa laluan isyarat AKT mitokondria tubular renal boleh mengawal pembentukan parut glomerular semasa perkembangan CKD. Analisis survival Kaplan-Meier menunjukkan kesan perencatan AKT mitokondria tiub pada hasil IRI. Kemandirian dikurangkan selepas IRI dalam tikus TAM-KMDAKT berbanding dengan kawalan (p=0.0013).
Kadar kemandirian tikus TAM- KMDAKT jauh lebih rendah daripada kawalan dalam tempoh 7 hari selepas IRI, tetapi tahap BUN/Cr tikus TAM- dan minyak jagung- KMDAKT adalah serupa dalam tempoh ini. Perubahan BUN/Cr yang dilaporkan dalam tikus yang dirawat TAM mungkin telah dipandang remeh kerana ketiadaan data BUN/Cr daripada tikus mati. Di samping itu, kematian yang lebih tinggi dalam tikus TAM-KMDAKT mungkin disebabkan oleh disfungsi organ distal (paru-paru, jantung, otak) dan bukannya perubahan BUN/Cr sahaja.
Peranan AKT1 mitokondria tiub juga dinilai dalam tikus KMDAKT betina. serum BUN / Cr dan histologi buah pinggang adalah lebih tinggi dalam tikus betina TAM-KMDAKT 45 hari selepas IRI. Tiada kesan seks yang ketara diperhatikan.
Herba Cistanche
RUJUKAN
1. Yang JY, Deng W, Chen Y, et al. Translokasi terjejas dan pengaktifan mitokondria Akt1 mengurangkan aktiviti Kompleks V fosforilasi oksidatif mitokondria dalam miokardium diabetes. J Mol Sel Kardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, et al. Kadar metabolik khusus organ dan tisu utama merentasi masa dewasa: penilaian oleh model mekanistik bagi perbelanjaan tenaga berehat. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Peranan Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1alpha (PGC-1alpha) dalam Penyakit Buah Pinggang. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, et al. Pengubahan PPARalpha dan coactivatornya PGC-1 dalam kegagalan buah pinggang akut yang disebabkan oleh cisplatin. Buah Pinggang Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Pemain Kuasa Mitokondria dalam Fungsi Buah Pinggang? Trend Metab Endokrinol. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Meningkatkan bioenergetik mitokondria di bawah keadaan iskemia meningkatkan toleransi iskemia hangat dalam buah pinggang. Am J Physiol Fisiol Renal. 2015;308(1):F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Biologi sel iskemia/kecederaan reperfusi. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Laluan molekul dalam melindungi hati daripada kecederaan iskemia/reperfusi: kemas kini 2015. Clin Sci (Lond). 2015;129(4):345–62.
9. Lihat EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Risiko jangka panjang hasil buruk selepas kecederaan buah pinggang akut: kajian sistematik dan meta-analisis kajian kohort menggunakan definisi konsensus pendedahan. Buah Pinggang Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Perlindungan Mitokondria selepas Iskemia Akut Menghalang Regulasi Berpanjangan IL-1beta dan IL-18 dan Menangkap CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, et al. PGC1alpha memacu biosintesis NAD yang menghubungkan metabolisme oksidatif kepada perlindungan buah pinggang. alam semula jadi. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Mitokondria dan isyarat sel. J Sel Sci. 2012;125(Pt 4):807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y, et al. Protein kinase B (PKB/AKT1) membentuk kompleks isyarat dengan protein mitokondria dan menghalang disfungsi tenaga glikolitik dalam kardiomiosit berbudaya semasa kecederaan iskemia-reperfusi. Endokrinologi. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, et al. Pengaktifan gen yang cekap dalam sel mamalia dengan menggunakan adenovirus rekombinan yang menyatakan Cre recombinase khusus tapak. Asid Nukleik Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Ekspresi terkawal transgen yang diperkenalkan oleh elektroporasi in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Disfungsi Organ Jauh dalam Kecederaan Buah Pinggang Akut: Satu Tinjauan. Am J Ginjal Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Chen sedap1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. Pusat Diabetes UC Irvine dan Jabatan Perubatan, Universiti California, Irvine, California
2. Jabatan Fisiologi dan Biofizik, Universiti California, Irvine, California
3. Jabatan Perubatan, Universiti Perubatan Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwan
4. Jabatan Perubatan Dalaman, Hospital Ta-Tung Perbandaran Kaohsiung, Taiwan
5. Jabatan Pembedahan Plastik, Universiti Perubatan Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwan
6. Jabatan Biologi Perkembangan dan Sel, Universiti California, Irvine, California
7. Jabatan Diabetes, Endokrinologi dan Metabolisme, Pusat Perubatan Nasional City of Hope, Duarte, California
