Bahagian Tiga DsbA-L Berinteraksi Dengan VDAC1 dalam Apoptosis Sel Tubular Berantara Mitokondria Dan Menyumbang Kepada Perkembangan Penyakit Buah Pinggang Akut

7. Penjanaan PT-VDAC1-KO tikus

Untuk menyiasat peranan VDAC1 dalam AKI, kami menubuhkan model tetikus yang memaparkan kalah mati VDAC1 dalam tubul proksimal buah pinggang. Rajah 7a menunjukkan protokol pembiakan yang digunakan untuk menjana PT-VDAC1-KO. RT-PCR telah digunakan untuk genotaip tetikus PT- VDAC1-KO; ini dilakukan dengan menguatkan 416-bp serpihan DNA alel flox dan 370-bp serpihan DNA gen Cre (Rajah 7, b; lorong 4 dan 6). Tikus jenis liar (PT-VDAC1-WT) tidak mempunyai gen Cre (Rajah 7, b, lorong 2 dan 3). Analisis imunoblot menunjukkan bahawa tahap ekspresi VDAC1 dalam korteks buah pinggang PTVDAC1-KO tikus adalah lebih rendah daripada pada tikus PTVDAC1-WT berikutan rawatan iskemia atau palsu (Rajah 7 c dan d). Ini selanjutnya disahkan oleh pewarnaan imunohistokimia VDAC1 (Rajah 7e). Data ini mengesahkan bahawa kami telah berjaya mewujudkan model tetikus1-KO PT- VDAC.

Rajah 7. Penciptaan dan ciri model tetikus1-KO PT-VDAC. (a, b) Protokol pembiakan untuk penjanaan tikus PTVDAC1-KO dan pengesanan PCR genotip jenis liar dan alel floks alel VDAC1 dan PEPCK-Cre. (c) Analisis imunoblot VDAC1 dan b-tubulin menggunakan tisu kortikal buah pinggang PT-VDAC1-KO dan PT-VDAC1-tikus sampah WT berikutan kecederaan IR. (d) Analisis imej skala kelabu di antara mereka. ( e ) Pewarnaan imunohistokimia VDAC1 dalam tisu kortikal buah pinggang jenis liar dan tikus VDAC1 berikutan kecederaan IR. Pembesaran asal x 400. Bar Parut:100µM. Setiap eksperimen(c & e) diulang 6 kali secara bebas dengan keputusan yang serupa. ANOVA sehala digunakan untuk perbandingan kumpulan Pelbagai (d). # hlm<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Klik di sini untuk mengetahui faedah Cistanche

8. Kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh I/R, apoptosis sel tiub dan kerosakan mitokondria telah diperbaiki dalam tikus PTVDAC1-KO

Rakan-rakan tikus PT-VDAC1-WT dan PT- VDAC1-KO telah dirawat dengan iskemia (28 min) diikuti oleh kecederaan reperfusi (48 jam). Kami kemudiannya memperoleh sampel darah dan tisu buah pinggang untuk pemeriksaan lanjut. Kami mendapati bahawa PT-VDAC1-KO secara ketara menindas ketinggian yang disebabkan oleh I/R dalam tahap BUN dan kreatinin (Rajah 8 a dan b). Kedua, analisis histologi dan TUNEL selanjutnya menunjukkan bahawa PT-VDAC{11}}KO melemahkan kerosakan tisu yang disebabkan oleh I/R dan apoptosis sel renal (Rajah 8 c, d, f dan g). Ketiga, analisis EM mendapati bahawa PT-VDAC1-KO melemahkan kerosakan mitokondria akibat I/R dengan ketara (Rajah 8 e dan h). Akhirnya, immunoblotting mengesahkan bahawa tikus PT-VDAC1-KO menunjukkan tahap caspase terbelah-3 yang berkurangan, pengumpulan Bax yang lebih rendah dalam mitokondria dan kadar pelepasan Cyt-c yang lebih rendah ke dalam sitosol (Rajah 8 I- o). Data ini menunjukkan bahawa VDAC1 juga mengantarkan AKI yang disebabkan oleh I/R.

Rajah 8. Pengecilan kecederaan buah pinggang akibat IR, apoptosis sel tiub, kerosakan mitokondria, dan ekspresi Bax, Cyt-c dan caspase3 terbelah dalam tikus PT-VDAC1-KO. Arteri renal dua hala PT-VDAC1-KO dan PT-VDAC1-Tikus sampah WT telah diapit selama 28 minit dan kemudian dilepaskan selama 48 jam untuk mewujudkan model IR. (a) BUN. (b) Kreatinin serum. (c) Pewarnaan hematoksilin dan eosin. (d) Bahagian perwakilan sel TUNEL-positif. (e) Pengesanan mikroskop elektron bagi morfologi mitokondria. (f) Skor kerosakan tiub. (g) Bilangan sel TUNEL-positif. (h) Skor kecederaan mitokondria. (i) Imunoblot menganalisis ungkapan caspase3, VDAC1, dan DsbA-L yang dibelah serta ungkapan BAX dan Cyt-c dalam pecahan mitokondria dan sitosolik. b-tubulin dan GAPDH digunakan sebagai kawalan pembebanan lisat atau sitosolik keseluruhan, masing-masing. COX IV digunakan sebagai kawalan pemuatan mitokondria. (j- p) Analisis imej skala kelabu di antara mereka. Pembesaran asal x 400. Bar Parut: 100µM dalam c & d 20µM dalam e. Setiap eksperimen(c- e&i) diulang 6 kali secara bebas dengan keputusan yang serupa. ANOVA sehala digunakan untuk perbandingan kumpulan Berbilang (a, b, f- h&j- p). # hlm<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Ekspresi berlebihan kerosakan buah pinggang yang disebabkan oleh I/R yang teruk DsbA-L telah dilemahkan dalam tikus PT-VDAC1-KO

DsbA-L semasa kecederaan iskemia. Seminggu sebelum model tetikus IR ditubuhkan, kami menyuntik urat ekor setiap tetikus dengan plasmid DsbA-L (suntikan dilakukan dua kali pada minggu ini). Ekspresi berlebihan DsbA-L memburukkan ketinggian yang disebabkan oleh IR dalam BUN dan ekspresi kreatinin, kerosakan buah pinggang, dan apoptosis buah pinggang; kesan ini telah dilemahkan dalam tikus PTVDAC1-KO (Rajah 9 a- d, e, dan f). Keputusan imunoblot selanjutnya menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan DsbA-L meningkatkan peningkatan yang disebabkan oleh IR dalam caspase terbelah-3, pengumpulan Bax dalam mitokondria dan pembebasan Cyt-c ke dalam sitosol; kesan ini telah dikurangkan dalam tikus PT-VDAC{12}}KO (Rajah 9 g dan h- l). Secara kolektif, keputusan ini selanjutnya menunjukkan bahawa VDAC1 mengantarkan kesan DsbA-L semasa kecederaan iskemia.

Rajah 9. Ekspresi berlebihan kerosakan buah pinggang akibat I/R yang teruk DsbA-L telah dilemahkan dalam tikus PT-VDAC1-KO. Tikus PT-VDAC1-KO dan PT-DsbA-L-WT telah dirawat dengan atau tanpa plasmid DsbA-L dan kemudian mewujudkan model IR. (a) BUN. (b) Kreatinin serum. (c) Pewarnaan hematoksilin dan eosin. (d) Bahagian perwakilan sel TUNEL-positif. (e) Skor kerosakan tiub. (f) Bilangan sel TUNEL-positif. (g) Imunoblot menganalisis ungkapan caspase3, VDAC1, dan DsbA-L yang dibelah serta ungkapan BAX dan Cyt-c dalam pecahan mitokondria dan sitosolik. b-tubulin dan GAPDH digunakan sebagai kawalan pembebanan lisat atau sitosolik keseluruhan, masing-masing. COX IV digunakan sebagai kawalan pemuatan mitokondria. (h- n) Analisis imej skala kelabu di antara mereka. Pembesaran asal x 400. Bar Parut: 100mM. Setiap eksperimen(c- e) diulang 6 kali secara bebas dengan keputusan yang sama. ANOVA sehala digunakan untuk perbandingan kumpulan Pelbagai (a, b, dan f- n). # hlm<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

suplemen cistanche

10. Pengecilan kerosakan buah pinggang yang disebabkan oleh I/R dalam tikus PTDsbA-L-KO telah dikurangkan oleh ekspresi berlebihan VDAC1

Untuk mengesahkan lebih lanjut jika kerosakan tiub pengantara DsbA-L bergantung kepada VDAC1, tikus tikus PTDsbA-L -WT dan PT- DsbA-L -KO pertama kali terdedah kepada rawatan I/R, dan kemudian disuntik melalui urat ekor. dengan plasmid overexpression VDAC1. Peningkatan yang disebabkan oleh I/R dalam tahap BUN dan kreatinin telah diperbaiki dalam tikus PT- DsbA-L -KO; bagaimanapun, kesan ini telah dihalang oleh ekspresi berlebihan VDAC1 (Rajah 10 a dan b). Pewarnaan HE dan TUNEL menunjukkan bahawa tahap relatif kerosakan tisu buah pinggang yang disebabkan oleh IR dan apoptosis sel renal telah dikurangkan dalam tikus PT- DsbAL -KO dan bahawa kesan ini telah disekat oleh overexpression VDAC1 (Rajah 10 c- f). Immunoblotting menunjukkan bahawa tikus PT- DsbA-L -KO mempunyai tahap caspase terbelah yang lebih rendah-3, tahap pengumpulan Bax yang lebih rendah dalam mitokondria dan kadar pelepasan Cyt-c yang lebih rendah ke dalam sitosol; bagaimanapun, kesan ini telah dihapuskan oleh overexpression VDAC1 (Rajah 10 g-m). Data ini menyokong fakta bahawa DsbA-L mempromosikan kecederaan iskemia dengan cara yang bergantung kepada VDAC1.

Rajah 10. PT-DsbA-L-KO memperbaiki kecederaan buah pinggang tikus yang disebabkan oleh IR telah berkurangan dengan ekspresi berlebihan VDAC1. Tikus PT-DsbA-L-KO dan PT- DsbA-L-WT telah dirawat dengan atau tanpa plasmid VDAC1 dan kemudian menubuhkan model IR. (a) BUN. (b) Kreatinin serum. (c) Pewarnaan hematoksilin dan eosin. (d) Bahagian perwakilan sel TUNEL-positif. (e) Skor kerosakan tiub. (f) Bilangan sel TUNEL-positif. (g) Imunoblot menganalisis ungkapan caspase3, VDAC1, dan DsbA-L yang dibelah serta ungkapan BAX dan Cyt-c dalam pecahan mitokondria dan sitosolik. b-tubulin dan GAPDH digunakan sebagai kawalan pembebanan lisat atau sitosolik keseluruhan, masing-masing. COX IV digunakan sebagai kawalan pemuatan mitokondria. (hm) Analisis imej skala kelabu di antara mereka. Pembesaran asal x 400. Bar Parut: 100mM. Setiap eksperimen (c, d, dan g) diulang 6 kali secara bebas dengan keputusan yang serupa. ANOVA sehala digunakan untuk perbandingan kumpulan Berbilang (a, b, e, f, dan h- m). # hlm<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. Kecederaan buah pinggang akibat CLP telah dilemahkan dalam tikus PT-DsbA-LKO atau PT-VDAC1-KO

AKI yang disebabkan oleh sepsis adalah satu lagi punca biasa AKI dalam amalan klinikal. Rakan sampah PT- DsbA-L atau VDAC-WT dan PT-DsbA-L atau VDAC1-KO telah tertakluk kepada model CLP dan kemudian dieutanasi 18 jam selepas pembedahan. Keputusan menunjukkan bahawa tikus PT-DsbA-L atau VDAC1- KO telah mengurangkan dengan ketara peningkatan yang disebabkan oleh CLP dalam tahap BUN dan kreatinin, serta peningkatan tahap kerosakan tisu buah pinggang dan apoptosis sel renal (Rajah S1 dan S2 a- f ). Immunoblotting mengesahkan bahawa tikus PTDsbA-L atau VDAC1-KO juga menunjukkan pengurangan tahap caspase terbelah-3, tahap pengumpulan Bax yang lebih rendah dalam mitokondria dan kadar pelepasan Cyt-c yang lebih rendah ke dalam sitosol (Rajah S1 dan S2 g- n). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahawa kedua-dua DsbA-L dan VDAC1 mengantarkan perkembangan AKI septik.

12. Kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh VAN telah dilemahkan pada tikus PT-DsbAL-KO atau PT-VDAC1-KO

AKI yang disebabkan oleh Vancomycin (VAN) juga merupakan model penting untuk AKI. Rakan sampah PT- DsbA-L atau VDAC1-WT dan PT-DsbA-L atau VDAC1-KO disuntik secara intraperitoneal dengan VAN (600mg/kg) selama 7 hari berturut-turut. Keputusan menunjukkan bahawa tikus PT-DsbA-L atau VDAC1-KO telah mengurangkan dengan ketara peningkatan paras BUN dan kreatinin akibat VAN, kerosakan tisu buah pinggang dan apoptosis sel renal (Rajah S3 dan S4 an-f). Analisis imunoblot selanjutnya mengesahkan bahawa tikus PTDsbA-L atau VDAC1-KO juga menunjukkan pengurangan tahap caspase terbelah-3, tahap pengumpulan Bax yang lebih rendah dalam mitokondria dan kadar pelepasan Cyt-c yang lebih rendah ke dalam sitosol (Rajah S3 dan S4 g- m). Ringkasnya, data ini menunjukkan bahawa kedua-dua DsbA-L dan VDAC1 mengantarkan AKI yang disebabkan oleh VAN.

Ekstrak cistanche

13. Apoptosis sel HK-2 pengantaraan DsbA-L disebabkan oleh I/R telah dikaitkan dengan VDAC1

Keputusan di atas mendapati bahawa DsbA-L terlibat dalam apoptosis sel BUMPT, bagaimanapun, fungsi DsbA dalam sel tubular renal manusia masih tidak jelas. DsbA-L siRNA telah dipindahkan ke dalam sel HK2 dan kemudian terdedah kepada pengurangan ATP selama 2 jam dan pemulihan selama 2 jam. Keputusan imunoblot menunjukkan bahawa DsbA-L siRNA terutamanya meningkatkan peningkatan yang disebabkan oleh I/R dalam caspase terbelah-3 dan ekspresi VDAC1, peningkatan pengumpulan Bax dalam mitokondria, dan peningkatan pengeluaran Cyt-c ke dalam sitosol ( Rajah S5 an- h). Data juga mencadangkan bahawa peranan DsbA-L dalam apoptosis sel HK2 berkaitan dengan VDAC1 semasa rawatan I / R.

14. Apoptosis sel HK-2 pengantaraan DsbA-L yang disebabkan oleh I/R bergantung kepada VDAC1

Untuk mengesahkan lagi sama ada peranan DsbA-L dalam apoptosis sel HK2 bergantung kepada VDAC1. Pertama, sel HK2 telah ditransfeksi bersama dengan DsbA-L siRNA ditambah dengan atau tanpa plasmid VDAC1 dan kemudian terdedah kepada pengurangan ATP selama 2 jam dan pemulihan selama 2 jam. Keputusan imunoblot menunjukkan bahawa DsbA-L siRNA melemahkan peningkatan yang disebabkan oleh I/R dengan ketara dalam caspase terbelah-3 dan ekspresi VDAC1, peningkatan pengumpulan Bax dalam mitokondria dan peningkatan pengeluaran Cyt-c ke dalam sitosol, kesan ini telah diterbalikkan oleh overexpression plasmid VDAC1 (Rajah S6a- h). Kedua, sel HK2 telah ditransfeksi bersama dengan siRNA VDAC1 ditambah dengan atau tanpa plasmid DsbA-L dan kemudian terdedah kepada I (2 jam) / R (2 jam). Keputusan imunoblot menunjukkan bahawa siRNA VDAC1 terutamanya meningkatkan peningkatan yang disebabkan oleh I/R dalam caspase terbelah-3 dan ekspresi VDAC1, peningkatan pengumpulan Bax dalam mitokondria, dan peningkatan pengeluaran Cyt-c ke dalam sitosol, kesan ini tidak dipertingkatkan oleh ekspresi berlebihan plasmid DsbA-L (Rajah S7a- h). Data mengesahkan dengan jelas bahawa VDAC1 mengantara peranan pro-apoptosis DsbA-L dalam sel HK-2 semasa rawatan I/R.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h dan Dongshan Zhang a,b *

sebuah Jabatan Perubatan Kecemasan, Republik Rakyat China

b Institut Perubatan Kecemasan dan Penyakit Sukar, Hospital Xiangya Kedua, Universiti Selatan Tengah, Changsha, Hunan 410011, Republik Rakyat China

c Jabatan Oftalmologi, Republik Rakyat China

d Jabatan Pembedahan Kencing, Republik Rakyat China

e Jabatan Pembedahan Dada, Republik Rakyat China

f Jabatan Pembedahan Am, Hospital Xiangya Kedua, Republik Rakyat China

g Jabatan Kesihatan Awam, Universiti Selatan Tengah, Changsha, Hunan, Republik Rakyat China

h Jabatan Endokrinologi, Hospital Rakyat Shenzhen, Kolej Perubatan Klinikal Kedua Universiti Jinan, Hospital Gabungan Pertama Universiti Sains dan Teknologi Selatan, Shenzhen, Republik Rakyat China

1 Xiaozhou Li dan Jian Pan memberi sumbangan yang sama kepada kajian ini