Bahagian Ⅱ Kekurangan Smad3 Memperbaik Terapi Berasaskan Islet Untuk Diabetes Dan Kecederaan Buah Pinggang Diabetik Dengan Menggalakkan Pembiakan Sel Melalui Mekanisme3-bergantung E2F

Kaedah

1. Haiwan

Tikus Smad3-null (Smad3KO) ialah hadiah baik daripada Prof. Chuxia Deng dan dikekalkan dalam heterozigot (Smad3 tambah /- ) dalam latar belakang C57BL/6 [20]. Tikus Smad3KO dijana dengan persilangan Smad3 plus /- tikus. Tikus db/db dengan mutasi Lepr (reseptor Leptin) dalam latar belakang C57BLKS telah dibeli dari Pusat Eksperimen Haiwan Universiti China Hong Kong (CUHK). Semua haiwan dikekalkan dalam kemudahan bebas patogen (SPF) khusus dengan akses percuma kepada makanan dan air pada kitaran siang/malam selama 12/12 jam. Semua manipulasi haiwan dalam kajian ini dilakukan mengikut peraturan dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Eksperimen Haiwan CUHK dengan Ruj. Tidak. 18-177-MIS.

2. Model tikus diabetes yang disebabkan oleh Streptozocin (STZ).

Tikus C57BL/6 jantan pada umur 8-10 minggu disuntik secara intraperitoneal dengan 50 mg/kg/hari STZ setiap hari selama 5 hari berterusan. 5 hari selepas suntikan STZ terakhir, tikus dengan glukosa darah rawak yang stabil lebih daripada 16 mM selama 2 hari berturut-turut dianggap sebagai kejayaan diabetes dan digunakan sebagai tikus penerima untuk pemindahan pulau kecil.

3. Pengasingan pulau kecil, pemindahan, dan penilaian fenotip diabetes

Pulau kecil telah diasingkan daripada tikus kalah mati Smad3 jantan atau betina (KO) atau jenis liar (WT) pada umur 8-10 minggu seperti yang diterangkan sebelum ini [21]. Untuk melakukan pemindahan pulau kecil, menunjukkan beberapa pulau kecil telah dipindahkan di bawah kapsul buah pinggang tikus db/db jantan pada usia minggu ke-4 atau tikus diabetes yang disebabkan oleh STZ pada hari ke-7 selepas suntikan STZ terakhir mengikut protokol yang diterangkan oleh Szot et al [ 22]. Secara ringkas, tetikus penerima telah dibius oleh Kombo anestesia (1.5 peratus ketamin dan 0.15 peratus xilazine, 6 μL/g berat badan). Selepas kehilangan kesedaran, hirisan 1 cm dibuat pada kulit yang menutupi buah pinggang kiri. Tarik keluar buah pinggang perlahan-lahan dan pastikan ia lembap dengan garam steril semasa pembedahan. Dengan jarum 25G, buat calar kecil pada kapsul untuk membuat samaran. Bilangan pulau kecil yang ditunjukkan telah dihantar ke dalam kapsul buah pinggang dengan tiub PE50. Lagipun, pulau-pulau kecil itu telah dipindahkan, tutup samaran dengan kauterisasi dengan api perlahan. Gantikan buah pinggang dan tutup peritoneum dengan jahitan. Tutup kulit dengan staples. 100 μL larutan Penicillin-streptomycin (Gibco, cat# 15140122, USA) disuntik secara intraperitoneal untuk mencegah jangkitan. 100 μL Tegmic disuntik secara intramuskular untuk melegakan kesakitan. Haiwan itu diletakkan dalam persekitaran yang hangat sehingga pulih sepenuhnya. Prosedur operasi yang sama juga dilakukan pada tikus kawalan palsu tetapi tanpa infusi pulau kecil. Paras glukosa darah (RBG dan FBG) rawak dan 6 jam bagi darah hujung ekor diperiksa setiap minggu dengan meter glukosa mudah alih (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Ujian rintangan insulin (IPITT), ujian toleransi glukosa (IPGTT), tahap HbA1c, dan insulin serum diukur seperti yang diterangkan sebelum ini [9].

Klik di sini untuk mendapatkanfaedah Cistanche

4. Jumlah protein urin dan kreatinin serum

Air kencing 24 jam dikumpulkan dalam sangkar metabolik. Jumlah protein kencing selama 24 jam dikira dengan mendarabkan isipadu air kencing dan kepekatan protein kencing yang dikuantisasi oleh Kit Ujian Protein Bradford Mula Pantas (Bio-Rad, kucing # 5000201, Amerika Syarikat). Kreatinin serum ditentukan dengan kit kuantifikasi kreatinin (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, USA).

5. Histopatologi

Perubahan histopatologi buah pinggang telah diperiksa dalam bahagian paraformaldehyde-fixed, parafin-embedded (4 µm) dengan reagen Periodic Acid-Schiff (PAS) seperti yang diterangkan sebelum ini [23]. Pengembangan matriks Mesangial telah dijaringkan menggunakan program imej kuantitatif (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) seperti yang diterangkan sebelum ini [23].

6. Imunohistokimia

Buah pinggang atau pankreas yang mengandungi pulau kecil telah ditetapkan dalam 4 peratus paraformaldehid, tertanam dalam parafin, dan dibelah pada 4 μm. Selepas penghidratan semula, bahagian tersebut dirawat dengan pengambilan antigen pengantara gelombang mikro dalam 0.01 M sitrat (pH 6.0) selama 10 minit dan menyekat dalam 5 peratus BSA selama 1 jam . Pengeraman antibodi primer dilakukan semalaman pada suhu 4 darjah . Untuk pewarnaan pendarfluor, antibodi sekunder pendarfluor digunakan pada suhu bilik (RT) selama 1 jam. Untuk termogenesis pengantaraan DAB, langkah tambahan 3 peratus penyekatan H2O2 selama 15 minit dimasukkan sebelum pengambilan antigen. Selepas pengeraman antibodi utama, polimer konjugasi HRP (Envision plus System, Dako, Amerika Syarikat) telah ditambah. Untuk pewarnaan E2F3, pengambilan antigen dilakukan dalam larutan EDTA-Tris (pH 9.0). Antibodi yang digunakan dalam imunohistokimia diperincikan dalam Jadual S2. Kawasan positif pewarnaan dikuantisasi dengan perisian Image J (v1.47, NIH, USA).

Ekstrak cistanche

7. Pengukuran jisim sel yang dicantumkan dalam buah pinggang yang mengandungi pulau kecil

Indeks purata keluasan sel bagi setiap bahagian telah digunakan untuk mengira secara separa kuantitatif jisim sel dalam cantuman pulau kecil. Secara ringkas, buah pinggang yang mengandungi pulau kecil (tertanam parafin) dibelah berturut-turut pada 4 μm di sepanjang paksi sagittal. Bahagian berterusan pada selang 160 μm telah diimunisasikan secara fluoresen untuk insulin. Sekurang-kurangnya 6 bahagian dengan pewarnaan insulin-positif digunakan untuk pengiraan kawasan sel setiap bahagian dalam setiap tetikus. Kawasan sel insulin-positif dalam setiap bahagian dikira dengan perisian Image J (v1.47, NIH, USA). Indeks purata kawasan sel setiap bahagian dalam setiap tetikus dikira dengan membahagikan jumlah kawasan positif insulin kepada semua bahagian dengan bilangan bahagian positif insulin.

8. Kultur utama sel pulau kecil

Pulau kecil terpencil telah dipisahkan menjadi sel tunggal dan disemai ke dalam 96-plat perigi dalam 200 μL RPMI 1640 (Gibco, USA) ditambah 10 peratus FBS (Gibco, Amerika Syarikat) ditambah 1 peratus Penicillin-streptomycin (Gibco, USA) ditambah dengan 20 mM glukosa. Sel-sel pulau kecil telah dikultur untuk masa yang dinyatakan dalam inkubator yang ditetapkan pada 37 darjah, 5 peratus CO2, dan 100 peratus kelembapan. Untuk ketukan E2F3 yang dimediasi adenovirus, sel islet tercerai telah dibiakkan dalam medium yang mengandungi adenovirus yang mengekspresikan RNA jepit rambut pendek (shRNA) yang menyasarkan tetikus E2F3 (shE2F3) adenovirus secara berlebihan pada titer 10 pfu setiap sel selama 2 hari diikuti dengan penggantian sederhana. Jujukan batang dupleks shE2F3 ialah 5'-CATCCATGCTCTATTTTGT-3'. Sel-sel yang tersebar dari 50 pulau telah disemai setiap telaga untuk imunostaining dan RT-PCR, dan 100 pulau kecil setiap telaga untuk Western blot, yang telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [9].

9. Pelabelan BrdU in vivo dan in vitro

Untuk melakukan pelabelan in vivo BrdU, tikus disuntik secara intraperitoneal dengan 50 mg/kg/hari BrdU (dalam PBS) selama 7 hari dari hari ke-2 selepas pemindahan pulau kecil dan dikorbankan 2 jam selepas suntikan terakhir. Untuk pelabelan BrdU in vitro, sel pulau kecil yang tersebar telah dikultur selama 48 jam diikuti dengan penggantian dengan medium segar yang mengandungi 10 μM BrdU dan dikultur selama 24 jam tambahan. Immunostaining pendarfluor terhadap BrdU dalam tisu dan sel kultur telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [9].

Serbuk cistanche

10. RNA-Seq

Pulau kecil telah diasingkan daripada tikus Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m dan Smad3KO-db/m. Bagi setiap genotip, pulau kecil daripada lebih daripada 5 tikus dikumpulkan untuk pengasingan RNA. RNA telah disediakan dengan Kit Mini miRNeasy (Qiagen, Jerman). RNA-seq dan analisis data hiliran telah diterangkan sebelum ini [9]. Tahap ekspresi gen tertentu dibentangkan sebagai serpihan per kilobase transkrip per juta bacaan dipetakan (FPKM). Gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) ditakrifkan sebagai Lebih besar daripada atau sama dengan 2 lipatan varians FPKM antara dua kumpulan. DEG yang dikawal selia dan dikurangkan telah digabungkan dan digunakan untuk analisis pengayaan laluan Gene Ontology (GO) dan Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dengan sumber bioinformatik DAVID dalam talian (v6.8) dengan tetapan lalai. Subkategori GOTERM_BP_DIRECT telah digunakan untuk analisis GO.

11. Imunopresipitasi

Untuk melakukan immunoprecipitation di pulau kecil tikus, kira-kira 500 pulau yang baru diasingkan telah dilisekan dalam 500 mL penimbal RIPA. Antibodi anti-Smad3 arnab (2 ug) atau isotype IgG arnab telah ditambah dan diinkubasi pada 4 darjah semalaman dengan putaran lembut. Kemudian, 20 μL protein A agarose manik (Beyotime, cat # P2051, China) ditambah dan diinkubasi selama 2 jam pada 4 darjah . Selepas dicuci dengan teguh dengan penimbal RIPA segar, protein yang dibatasi dibebaskan dengan mendenaturasi dalam penimbal pemuatan 1xSDS dan tertakluk kepada analisis Western blot. Untuk mengelakkan pengaruh rantai berat IgG, IgG anti-arnab tetikus khusus rantai ringan (HRP conjugated, Abmart, cat# M21006, China) telah digunakan untuk mengenali protein Smad3 yang dimendakan.

12. Kromatin immunoprecipitation-ChIP

Untuk melaksanakan ChIP dalam pulau kecil tetikus, kira-kira 2000 pulau kecil telah dikumpulkan daripada 8-10 minggu tikus C57BL/6 dan digunakan sebagai satu penyediaan ChIP. Pulau kecil yang baru diasingkan telah dirangsang dengan 10 ng/mL TGF- 1 (Gibco, USA) selama 15 minit dalam RPMI 1640 ditambah 1 peratus FBS ditambah 1 peratus Penicillin-streptomycin. ChIP telah dilakukan dengan Kit IP Kromatin Enzimatik SimpleChIP® Plus (CST, USA) mengikut arahan yang disyorkan. Antibodi dan primer yang digunakan dalam ujian ChIP diperincikan dalam Jadual S1 dan S2.

Cistanche standard

13. Ujian wartawan dwi-luciferase

Penganjur E2F3 tetikus (-1000 kepada tambah 451 bp) telah diklonkan ke dalam pGL3-vektor asas (pGL3-E2F3.Pro). Pada masa yang sama, mutasi titik tapak pengikat Smad3 telah dijalankan untuk menjana pGL3- E2F3.Pro. Mut. Untuk melakukan ujian wartawan dwi-luciferase, sel HEK293T telah disemai ke dalam 24-plat perigi pada ketumpatan 5 x 104 sel/telaga. Keesokan harinya, sel telah ditransfeksi dengan 500 ng pGL3-Asas atau pGL3-E2F3.pro atau pGL3-E2F3.pro.mut digabungkan dengan pcDNA3.1-Smad3, yang melebihkan tetikus Smad3, atau tidak (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 10F) dengan kaedah kalsium fosfat. Vektor pEGFP-C1 telah ditambah untuk mengimbangi dos pemindahan dalam setiap rawatan. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vektor yang menyatakan renilla luciferase telah dimasukkan dalam setiap rawatan untuk menormalkan kecekapan pemindahan. 6 jam selepas pemindahan, medium ditukar diikuti dengan pengeraman selama 48 jam tambahan. Sel-sel telah dilisiskan dan aktiviti luciferase ditentukan dengan Sistem Ujian Pelapor Dual-Luciferase ® (Promega, Amerika Syarikat) dan dikira dalam luminometer (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, USA). Aktiviti transkrip promoter E2F3 yang diklon dipersembahkan sebagai nisbah nilai luciferase kelip-kelip kepada renilla luciferase. Setiap rawatan dilakukan dalam tiga kali ganda.

14. Perangkaan

Data dibentangkan sebagai min ± SD dan dianalisis dengan perisian SPSS (16.0). Normaliti data telah disemak oleh ujian One-Sample Kolmogorov-Smirnov. Kehomogenan varians antara kumpulan telah diuji oleh statistik Levene. Untuk perbandingan antara kedua-dua kumpulan, ujian-t Pelajar telah digunakan. Untuk perbandingan antara berbilang kumpulan, ANOVA sehala dengan ujian LSD digunakan jika varians yang sama diandaikan. Untuk varians yang sama yang tidak diandaikan, statistik ujian Welch alternatif telah digunakan diikuti dengan beberapa perbandingan dengan ujian T2 Tamhane. P < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Suplemen cistanche

Kesimpulan

Kekurangan Smad3 sebahagian besarnya meningkatkan terapi penggantian pulau kecil untuk kedua-dua T1DM dan T2DM dan melindungi daripada kecederaan buah pinggang diabetes. Percambahan sel bergantung E2F3-yang dipertingkatkan mungkin merupakan mekanisme utama terapi pulau kecil Smad3KO dalam kedua-dua T1DM dan T2DM. Oleh itu, terapi penggantian sel Smad3KO mungkin merupakan strategi terapeutik yang lebih baik untuk diabetes secara klinikal.

Rujukan

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Pemindahan pulau kecil pankreas klinikal. Nat Rev Endokrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Pembezaan sel stem pluripoten manusia kepada sel pankreas berfungsi untuk terapi diabetes: Inovasi, cabaran dan hala tuju masa hadapan. J Biol Eng. 2017; 11: 21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Penilaian cantuman histologi selepas pemindahan pulau kecil klinikal. Pemindahan. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Pelbagai peranan TGF-beta/Smads dalam fibrosis dan keradangan buah pinggang. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Isyarat TGF-beta/Smad dalam fibrosis buah pinggang. Fisiol Depan. 2015; 6: 82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Rangkaian isyarat smad mengawal percambahan sel pulau kecil. kencing manis. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Perencatan Isyarat TGF-beta Menggalakkan Replikasi Sel beta Pankreas Manusia. kencing manis. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Perencatan Gabungan Laluan DYRK1A, SMAD dan Trithorax Bersinergi untuk Mendorong Replikasi Teguh dalam Sel Beta Manusia Dewasa. Metab Sel. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Kekurangan Smad3 menggalakkan percambahan dan fungsi sel beta dalam tikus db/db melalui memulihkan ekspresi Pax6. Theranostics. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Kaedah untuk pengasingan pulau kecil murine dan pemindahan buah pinggang subkapsular. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Pemindahan isograft islet meningkatkan sensitiviti insulin dalam model murine diabetes jenis 2. Endokrin. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Induksi p16ink4a dan p19ARF oleh TGFbeta1 menyumbang kepada penangkapan pertumbuhan dan tindak balas penuaan dalam keratinosit tetikus. Karsinog Mol. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Mengawal percambahan semasa perkembangan retina. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Peraturan E2F oleh protein keluarga pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Penindasan Sementara Isyarat Reseptor TGFbeta Memudahkan Pemindahan Pulau Kecil Manusia. Endokrinologi. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Gangguan SMAD2 dalam sel beta pankreas tetikus membawa kepada hiperplasia pulau kecil dan rembesan insulin terjejas disebabkan oleh pengecilan aktiviti saluran K ditambah yang sensitif ATP. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Ekspresi berlebihan E2F3 menggalakkan percambahan sel beta manusia berfungsi tanpa induksi apoptosis. Kitaran Sel. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Isyarat Keluarga TGF-beta dalam Kawalan Percambahan dan Kemandirian Sel. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--kemajuan dan cabaran dalam percambahan sel beta manusia. Nat Rev Endokrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Gangguan sasaran SMAD3 mengakibatkan imuniti mukosa terjejas dan tindak balas sel T yang berkurangan terhadap TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol untuk pengasingan pulau kecil daripada pankreas tikus. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Pemindahan pulau kecil pankreas ke dalam kapsul buah pinggang tikus diabetes. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Pemadaman Smad3 menghalang fibrosis buah pinggang dan keradangan dalam nefropati diabetik jenis 2. Metabolisme. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2, dan Hui-Yao Lan2,7

1 Pusat Penyelidikan Perubatan Bersepadu dan Jabatan Nefrologi, Hospital Perubatan Tradisional Cina Gabungan Universiti Perubatan Barat Daya, Luzhou, Sichuan, 646000, China.

2. Jabatan Perubatan dan Terapeutik, dan Institut Sains Kesihatan Li Ka Shing, Universiti Cina Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.

3. Makmal Bersama Guangdong-Hong Kong mengenai Penyakit Ginjal Imunologi dan Genetik, Hospital Rakyat Wilayah Guangdong, Akademi Sains Perubatan Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, China.

4. Makmal Utama Bioelektronik Negeri, Makmal Utama Jiangsu untuk Biobahan dan Peranti, Pusat Pengajian Sains Biologi & Kejuruteraan Perubatan, Universiti Tenggara, Nanjing, China.

5. Makmal Utama Pencegahan dan Pengurusan Penyakit Buah Pinggang Kronik Bandar Zhanjiang, Institut Nefrologi, Hospital Gabungan Universiti Perubatan Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, China.

6. Pangkalan Penyelidikan Klinikal Perubatan Tradisional Cina Kebangsaan, Hospital Perubatan Tradisional Cina Gabungan Universiti Perubatan Barat Daya, Luzhou, Sichuan, 646000, China.

7. Makmal Penyelidikan Bersama Hospital Rakyat Wilayah CUHK-Guangdong mengenai Penyakit Ginjal Imunologi dan Genetik, Universiti China Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.