Bahagian 3: Model Tetikus Unik Latihan Awal Kehidupan Membolehkan Memori Hippocampal Dan Keplastikan Sinaptik

untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk Bahagian 2

Bahan dan Kaedah

Haiwan. Tikus jenis liar adalah keturunan empangan C57Bl6J, yang asalnya diperoleh daripada Makmal Jackson dan dibiakkan lagi di kemudahan haiwan kami. Tikus mempunyai akses percuma kepada makanan dan air dan lampu dikekalkan pada kitaran terang/gelap 12 jam. Selepas bercerai susu pada hari selepas bersalin (P) 21, tikus ditempatkan dalam sama ada sangkar tempat tidur standard atau sangkar yang dilengkapi dengan roda larian. Kedua-dua tikus jantan dan betina digunakan untuk semua eksperimen senaman dan tingkah laku. Hanya tikus jantan digunakan untuk kajian elektrofisiologi. Semua ujian tingkah laku dilakukan semasa kitaran cahaya. Eksperimen telah dijalankan mengikut garis panduan Institut Kesihatan Nasional AS untuk penjagaan dan penggunaan haiwan dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti California, Irvine.

Klik untukKesan cistanche untuk meningkatkan ingatan

Paradigma roda larian. Selepas bercerai susu pada P21, tikus ditempatkan berpasangan dalam sama ada sangkar standard tanpa roda atau dilengkapi sama ada roda larian keluli tahan karat mudah alih atau pegun (diameter 4.5 cm, 112 gram, Starr Life Sciences). Haiwan yang ditempatkan dengan roda berjalan mempunyai akses percuma untuk tempoh yang telah ditetapkan: sama ada satu minggu semasa tempoh juvana (P21–27; juv ELE), satu minggu semasa remaja (P35–41; Adol ELE), atau tiga minggu akses berturut-turut (P21– 41; juv-adol ELE). Sekumpulan tikus tambahan ditempatkan dengan roda pegun semasa P21–41 (sta) untuk mengawal pengayaan alam sekitar daripada kehadiran roda dalam sangkar. Setiap roda dipasang dengan jejaring poliuretana yang ringan untuk mengelakkan anggota kecil tikus yang sedang menyusu daripada tergelincir melalui anak tangga roda. Aktiviti berjalan telah dijejaki melalui penderia yang dipantau secara digital yang dilampirkan pada port data dan komputer untuk pemerolehan data masa nyata (Vital View Sofware) melalui pengesanan magnet bagi revolusi roda. Setiap roda yang dipantau secara digital menjejaki jarak larian untuk sangkar (dua tikus ditempatkan setiap sangkar, oleh itu jarak perjalanan setiap sangkar mewakili jumlah jarak lari antara dua tikus). Putaran dikira mengikut minit setiap hari untuk tempoh larian dan ditukar kepada jarak larian setiap sangkar (km).

Lokasi objekingatan(OLM) protokol. Lokasi objekingatanprotokol yang digunakan dalam kajian ini telah disesuaikan dan diubah suai daripada protokol sebelumnya44. Pada hari ke-36 selepas bersalin, tikus dibawa ke dalam bilik ujian dengan kecerahan bilik yang berkurangan. Tikus dikendalikan selama kira-kira 2 minit setiap satu, selama 5 hari berturut-turut sebelum sesi latihan OLM (dua kali sehari untuk 2 hari pertama diikuti sekali sehari untuk 3 hari berikutnya). Sesi pembiasaan adalah 5 minit, dua kali sehari selama 3 hari (P38-P40) dan berlaku dalam ruang yang mengandungi empat isyarat spatial unik pada setiap dinding ruang (garisan mendatar, X hitam, jalur menegak dan dinding kosong) . Pelaziman bertindih dengan 2 hari terakhir pengendalian. Semasa fasa latihan (P41), tikus diletakkan ke dalam bilik yang sama dengan dua objek yang sama dan terdedah kepada sama ada tempoh latihan subthreshold (3 min) atau threshold (10 min); reka bentuk kajian yang dimaklumkan oleh kerja terdahulu yang menunjukkan bahawa 3 minit latihan biasanya tidak mencukupi untuk jangka panjangingatanpembentukan45. Untuk tikus dalam sangkar senaman, roda larian dikunci serta-merta selepas latihan OLM untuk menghapuskan sebarang kesan akut senaman padaingatanpenyatuan. Pada hari ujian (P42; 24 jam selepas latihan), salah satu objek telah dipindahkan ke lokasi baru di dalam ruang, dan tikus kemudian dibenarkan untuk meneroka objek selama 5 minit. Masa yang dihabiskan dengan setiap objek ditentukan melalui analisis buta dengan pemarkahan tangan, dan nilai yang diperoleh pada kedua-dua hari latihan dan ujian ditukar kepada Indeks Diskriminasi (DI), berdasarkan lokasi baharu objek semasa ujian: [(masa yang diluangkan meneroka objek novel – masa yang diluangkan untuk meneroka objek biasa)/(jumlah masa meneroka kedua-dua objek) × 100 peratus ]. Tiada perbezaan yang ketara dalamingatanprestasi antara haiwan yang tidak aktif dan yang ditempatkan dengan roda pegun, jadi kumpulan ini digabungkan dan diwakili sebagai "tiada ELE" dalam semua analisis OLM. Percubaan pelaziman dianalisis untuk jarak perjalanan merentasi sesi menggunakan perisian analisis tingkah laku ANY-maze (Stoelting Co). Tikus dengan masa penerokaan yang tidak sekata antara dua objek semasa fasa latihan (DI > 20) atau yang tidak menunjukkan penurunan dalam jumlah jarak yang dilalui merentasi sesi pelaziman telah dikecualikan daripada analisis.

Cistanche boleh membantu meningkatkan daya ingatan

kajian elektrofisiologi. Eksperimen elektrofisiologi telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini, dan sumber kaedah ini telah diterbitkan di tempat lain66. Hanya tikus jantan digunakan untuk eksperimen elektrofisiologi. Secara ringkas, tikus jantan dari semua kumpulan ELE telah dikorbankan antara P42-51, dan hirisan dikumpulkan dari hippocampus rostral. Potongan koronal dibelah (Leica VT1000 S) pada ketebalan 320um dan diletakkan di dalam ruang rakaman antara muka dengan cecair serebrospinal tiruan yang dipanaskan terlebih dahulu (31 ± 1 darjah) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, dan 10 mM d-glukosa). Kepingan terus diperas pada kadar 1.75–2 ml seminit manakala permukaan kepingan didedahkan kepada 95 peratus O2/5 peratus CO2 yang hangat dan lembap. Rakaman bermula selepas sekurang-kurangnya 2 jam pengeraman. Potensi postsynaptic excitatory field (fEPSPs) direkodkan daripada stratum radiatum CA1b menggunakan pipet kaca tunggal (2-3 MΩ) yang diisi dengan 2 M NaCl. Denyutan rangsangan (0.05 Hz) dihantar ke unjuran kolateral-komisar Schafer menggunakan elektrod perangsang bipolar (wayar nichrome berpintal, 65 μm) yang diletakkan dalam CA1c. Keamatan semasa telah diselaraskan untuk mendapatkan 50 peratus tindak balas fEPSP maksimum. Selepas garis dasar yang stabil diwujudkan, LTP diinduksi dengan satu kereta api dengan lima letusan theta, di mana setiap letusan (empat nadi pada 100 Hz) dihantar 200 ms antara satu sama lain (iaitu, pada frekuensi theta). Keamatan rangsangan tidak meningkat semasa TBS. Data dikumpul dan didigitalkan oleh NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Teta Burst). Data dalam angka LTP telah dinormalisasi kepada 10 minit terakhir garis dasar dan dibentangkan sebagai min ± SE. Langkah-langkah garis dasar pada lengkung I/O, kemudahan nadi berpasangan dan LTP dianalisis menggunakan ANOVA dua hala dan analisis regresi linear (perisian Graphpad Prism 8).Cistanche boleh membantu meningkatkan daya ingatan.

Analisis statistik. ANOVA sehala digunakan untuk menganalisis kesan masa latihan awal kehidupan pada OLM Acquisition DIs (Rajah 2d, g), OLM Testing DIs (Rajah 2e, h) dan OLM Testing jumlah masa penerokaan (Rajah 2f). , i) dalam setiap jantina. Perbandingan berbilang post-hoc Dunnett digunakan untuk membuat perbandingan khusus kepada kumpulan "tiada ELE" (sedentari) apabila keputusan ANOVA yang ketara diperhatikan. ANOVA dua hala digunakan untuk menganalisis berat tetikus yang diperoleh semasa tempoh ELE (Rajah 1b, faktor kumpulan ELE dan jantina). Langkah berulang dua hala (RM) -ANOVA digunakan untuk menganalisis jarak larian harian (Rajah 1c-e, faktor hari selepas bersalin dan jantina), sesi pelaziman (Rajah 2b, c) dan untuk membandingkan pemerolehan OLM DI vs ujian DI untuk setiap tetikus untuk perbandingan dalam kumpulan. Ujian post hoc Sidak digunakan untuk membuat perbandingan khusus apabila interaksi penting atau kesan utama kumpulan berjalan atau sesi OLM diperhatikan. Selain itu, ANOVA tiga hala telah dilakukan untuk OLM Testing DIs untuk menentukan sebarang interaksi yang signifikan antara tiga pembolehubah nominal (tempoh latihan OLM, kumpulan ELE dan jantina). Untuk keadaan yang jarang berlaku bahawa data larian 24 jam untuk hari tertentu tidak direkodkan, nilai telah dikira berdasarkan mengambil purata larian jarak tiga hari sebelumnya, untuk melaksanakan analisis statistik. Ujian-t Pelajar yang tidak berpasangan digunakan untuk menganalisis jumlah jarak larian bagi setiap kumpulan ELE (Rajah 1f–h), serta membandingkan DI ujian OLM antara 3-min dan 10-min tikus sedentari terlatih. Jarak larian kumulatif dinyatakan sebagai Min ± SD. Kesan utama dan interaksi untuk semua ANOVA diterangkan dalam teks dan legenda angka, bersama-sama dengan bilangan haiwan tertentu bagi setiap jantina yang digunakan dalam setiap eksperimen. Semua analisis adalah dua hujung dan memerlukan nilai 0.05 untuk kepentingannya. Bar ralat dalam semua angka mewakili SEM. Untuk semua eksperimen, nilai ±2 sisihan piawai daripada min kumpulan dianggap terpencil dan dialih keluar daripada analisis. Semua statistik telah dilakukan dengan perisian GraphPad Prism 8. Jumlah bilangan tikus yang digunakan dalam eksperimen tingkah laku=152.

Cistanche boleh membantu meningkatkan daya ingatan

Diterima: 16 Januari 2020; Diterima: 13 Mei 2020;

Diterbitkan: xx xx xxxx

Ucapan terima kasih

Penyelidikan ini disokong oleh Institut Gangguan Neurologi dan Strok Kebangsaan Institut Kesihatan Nasional, di bawah nombor anugerah K12NS098482 (dianugerahkan kepada ASI) dan Sekolah Perubatan UC Irvine, Jabatan Pediatrik. Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Marcelo Wood atas perbincangan saintifik mereka dan input kritikal mengenai projek itu.

Sumbangan pengarang

ASI, TY, SP, FS dan TV melakukan eksperimen senaman dan tingkah laku serta menganalisis data; EK melakukan semua eksperimen elektrofisiologi, menganalisis data, dan mengedit manuskrip; ASI merancang kajian, menganalisis data, mentafsir keputusan, dan menulis manuskrip.

kepentingan bersaing

Pengarang mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.

Maklumat tambahan

Surat-menyurat dan permintaan untuk bahan hendaklah dialamatkan kepada ASI

Maklumat cetakan semula dan kebenaran tersedia di www.nature.com/reprints.

Nota Penerbit Springer Nature kekal berkecuali berkenaan dengan tuntutan bidang kuasa dalam peta yang diterbitkan dan gabungan institusi.