Bahagian 2: Kesan Anti-Radang, Antioksidan, Pelembap dan Antimelanogenesis Quercetin 3-O- -D-Glucuronide dalam Keratinosit Manusia Dan Sel Melanoma Melalui Pengaktifan Laluan NF-κB Dan AP{-1

Untuk butiran lanjut, hubungitina.xiang@wecistanche.com

Klik pautan untuk mengetahui bahagian 1:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118257.html

3. Perbincangan

Dalam kajian yang diterbitkan sebelum ini, Q-3-G telah digunakan untuk menghalang edema telinga, kebolehtelapan peritoneal dan edema pulmonari [50], bertindak sebagai kuatantioksidandalam plasma darah dengan lipoprotein berketumpatan rendah [42], mengurangkan pengubahsuaian oksidatif yang disebabkan oleh peroksinitrit [51], menggunakananti-radangkesan dengan menghalang laluan isyarat JNK dan ERK di bawah cabaran LPS [52] dan memiliki sifat antikanser terhadap sel-sel kanser payudara [56]. Walau bagaimanapun, tidak seperti sebatian induknya yang dikaji secara meluas,quercetin, faedah farmakologi dan mekanisme Q-3-G masih perlu diterokai. Sepanjang pengetahuan kami, peranan Q-3-G pada kesan perlindungan kulit belum dijelaskan sepenuhnya. Dalam kajian ini, menggunakan pelbagai penilaian in vitro, kami menumpukan pada mencirikan kesan perlindungan kulit Q-3-G terhadap UVBor H2O2, tekanan oksidatif dan keradangan yang disebabkan, penghidratan kulit dalam HaCaT (garisan sel keratinosit manusia), danantilanogenesisaktiviti dalam B16F10 (garisan sel melanoma murine).

Daya maju sel HaCaT, B16F10 dan HEK293T ditentukan selepas rawatan dengan Q-3-G dalam julat kepekatan bukan sitotoksik. Keputusan menunjukkan bahawa tiada perencatan yang ketara terhadap daya maju sel dalam sel HaCaT, B16F10 dan HEK293T berbanding kepekatan Q-3-Gup hingga 20 μM （Rajah 2a,3a, dan 4f）. Daya maju sel dalam sel HaCaT, B16F10 dan HEK293T pada kepekatan O-3-G sehingga 20 μM didapati lebih rendah daripada kepekatan kuersetin apabila ia digunakan untuk menyiasat kesan sitotoksik dalam SCC{{18} } dan HSC-6 sel（50 μM）【57】atau daya maju sperma （50-100μM）【58】. Walau bagaimanapun, Q-3-G ditunjukkan sebagai kurang toksik berbanding dengan aglikonnya [59]. Kekurangan kumpulan OH bebas pada kedudukan tiga mungkin menyumbang kepada kesan kurang toksik Q-3-G [29].

Sinaran UVB dengan panjang gelombang 280-315 nm menembusi lapisan atas kulit dan lebih berkesan daripada UVA dan UVC[60]. Sinaran UVB adalah punca kebanyakan kanser kulit dan kematian sel. Tambahan pula, kerosakan sel dalam sel HaCaT telah terbukti disebabkan oleh penyinaran UVB [61]. Akibatnya, kami menyiasat daya maju sel sel HaCaT selepas penyinaran UVB berbanding dengan rawatan Q-3-G. Seperti yang ditunjukkan dalam laporan sebelum ini, salah satu faktor utama yang membawa kepada sel, tisu, dan organ yang rosak ialah pendedahan UVB [62,63]. Q-3-G memulihkan daya maju sel yang berkurangan yang disebabkan oleh penyinaran UVB (Rajah 2b-d). Hasilnya ditunjukkan sama dengan kajian terdahulu mengenai kesan dan mekanisme pada sitotoksisiti yang disebabkan oleh UVB dalam HaCaT quercetin [64].

Klik dia untuk mendapatkan lebih banyak maklumat produk

Beberapa kajian telah menerangkan bahawa UVB boleh menggalakkan tindak balas keradangan yang teruk, yang membawa kepada masalah pada kulit [1,2,4,27].UVB mengaktifkan enzim pro-radang yang penting seperti COX-2 dan sitokin seperti TNF- . COX-2 ialah enzim berkaitan keradangan yang dicetuskan oleh sitokin dan mediator pro-radang [65], yang merangsang tindak balas keradangan. Oleh kerana COX-2 menghasilkan pengantara radang PGE-2, ia mendorong tindak balas keradangan [66,67] dan TNF- ialah sitokin pro-radang utama [68] dalam tindak balas keradangan. Tindak balas keradangan ini menyebabkan kerosakan kulit, yang mengakibatkan penuaan kulit [69]. Tahap ekspresi mRNA enzim radang COX-2 dan sitokin pro-radang TNF- telah dihalang oleh Q-3-G (Rajah 2e,). Menurut hasil yang diterbitkan sebelum ini, quercetin juga mengurangkan ekspresi gen dan pengeluaran TNF- [70]. Berkenaan dengan sifat antioksidan, ujian penghapusan radikal DPPH dan ABTS adalah kaedah yang pantas, boleh dipercayai dan boleh dihasilkan semula untuk menilai in vitro.aktiviti antioksidansebatian tulen dan ekstrak tumbuhan [54] dan telah digunakan secara meluas dalam kaedah biasa untuk menyiasat aktiviti penghapusan sebatian atau ekstrak semulajadi [1,46,71,72]. Q-3-G didapati mengurangkan kereaktifan radikal dalam kedua-dua ujian dan sitometri aliran dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Keputusan ini adalah selaras dengan kajian yang dilaporkan sebelum ini, di mana Q-3-G menghalang pembentukan ROS dengan ketara dalam sel PC-12 pheochromocytoma [34]. Selain bertindak secara kimia dengan kesan antioksidan, kami menunjukkan bahawa Q-3-G meningkatkan tahap Nrf2, salah satu pengawal selia penting bagi tekanan oksidatif dalam sel. Beberapa sebatian atau ekstrak semula jadi telah dilaporkan mempunyai sifat antioksidan melalui isyarat ARE yang bergantung kepada Nrf 2-[46,73,74]. Secara keseluruhan, penemuan ini menunjukkan bahawa Q-3-G mempunyai aktiviti antioksidan (Rajah 2g-j). Melanosom daripada sintesis melanin berlaku dalam organel intraselular [75-77]. Pengeluaran berlebihan melanin boleh menjejaskan penampilan kulit dan penyakit kulit yang berkaitan dengan hiperpigmentasi. Kami mendapati bahawa rawatan dengan O-3-G dalam sel B16F10 yang disebabkan oleh c -MSH menghalang rembesan melanin. Seperti dalam karya sebelumnya, melanogenesis intraselular juga dikawal oleh metabolit kuersetin dan beberapa kuersetin-3-O- -D-glucopyranosides [24,78,79].

Mengekalkan kulit yang sihat memerlukan penghidratan kulit yang mencukupi, dan NMF dan HA mempunyai peranan penting dalam proses ini [12]. FLG ialah konstituen penghalang kulit, jadi peningkatan tahap ekspresi FLG mungkin dikaitkan dengan pelembab [80]. Dalam kajian kami, Q-3-G didapati mempengaruhi aktiviti pengekalan kelembapan kulit dengan meningkatkan FLG dan TGM-1 (Rajah 3c,d). Tahap ekspresi FLG dan TGM-1 telah disekat oleh JNK, IKK dan IkBainhibitors (SP600125 dan Bay11-7082, masing-masing). Kami menumpukan pada enzim berkaitan MAPK kerana kajian kami bertujuan untuk menentukan mekanisme molekul yang Q-3-Menggunakan kesan perlindungan kulitnya. JNK memainkan peranan penting dalam apoptosis keratinosit yang disebabkan oleh tekanan oksidatif [81]. Fosforilasi c-Jun, TAK1, MKK4 dan INK dinaikkan oleh Q-3-G. Selain itu, retinol tidak meningkatkan fosforilasi c-Jun, TAK1, MKK4 atau JNK dengan ketara, menunjukkan bahawa terdapat beberapa perbezaan dalam ciri perencatan antara Q-3-G dan retinol dalam isyarat AP-1 laluan. Seperti dalam hasil yang diterbitkan sebelum ini, laluan JNK-c-Jun/AP-1 dikaitkan dengan kesan anti-apoptosisquercetin[82]. Berbanding dengan kajian terdahulu [83], dengan mengawal selia laluan isyarat NF-kB dan AP-1, laluan ini juga didapati terlibat dalam mekanisme asas kuersetin. Selaras dengan mekanisme kompaun induknya, keputusan kami menunjukkan bahawa laluan NF-kB turut disertakan dalam kesan perlindungan kulit Q-3-Gaby pengaktifan p50, p65, IKK , IkB , Akt dan Src selepas rawatan dengan Q-3-G dalam sel HaCaT. Selain itu, Q-3-G mengawal selia AP-1-mengantarakan aktiviti Luc dan NF-B-Luc (Rajah 4). Penemuan ini menunjukkan bahawa isyarat AP{15}} dan NF-kB pengantara MAPK menyumbang kepada sifat perlindungan kulit pengantaraan Q{17}G.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan

Q-3-G telah diperoleh daripada Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA).HaCaT, HEK293T dan sel B16F10 telah dibeli daripada American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA).ABTS diammonium salt, DPPH, asid askorbik(AA), ABTS, dan retinol telah dibeli daripada Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO, USA). Fetal bovine serum(FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dan phosphate-buffered saline (PBS) telah dibeli daripada Gibco(Grand Island, NY, USA).3-(4-5-Dimethylthiazol{{ 7}}yl)-25-diphenyltetra-sodium bromide (MTT) telah dibeli daripada Amresco (Brisbane, Australia). TRILzol dan premix PCR telah dibeli daripada Bio-D Inc. (Seoul, Korea). Kit sintesis cDNA dibeli daripada Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Primer hadapan dan belakang untuk PCR (tindak balas rantai polimerase) telah disintesis oleh Macrogen, Inc. (Seoul, Korea). Semua antibodi yang berkaitan dengan bentuk fosforilasi atau jumlah protein sasaran dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel (Beverly, MA, Amerika Syarikat).

4.2.Budaya Sel

Sel HaCaT dan B16F10 telah dikultur dalam DMEM dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus antibiotik (streptomycin dan penisilin). Sel HEK293T telah dibiakkan dalam DMEM dengan 5 peratus FBS dan 1 peratus antibiotik. Talian sel ini diinkubasi dalam 5 peratus CO, pada 37 darjah.

4.3. Ujian Daya Tahan Sel

Sel B16F10 telah disemai pada sel 2×10 darjah setiap telaga dalam 96-plat perigi selama 24 jam, kepekatan berbeza Q-3-G（0-20 μM） telah ditambahkan padanya, dan kemudian mereka diinkubasi selama 48 jam. Sel HaCaT disalut dalam 96-plat perigi, dan sel telah disemai pada 6×10 darjah sel/mL. Selepas pengeraman semalaman, sel telah diinkubasi dengan kepekatan Q-3-G （0-20 μM） yang berbeza selama 24 jam. Sel HEK293T telah disemai pada 6×10 darjah sel/mL dalam 96-plat perigi selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan Q-3-G （0-20 μM）. Sel yang diinkubasi dirawat dengan 10μL/telaga larutan MTT, dan selepas 3 jam dirawat dengan 100 μL Penyelesaian Berhenti MTT. Menggunakan ujian MTT konvensional untuk daya maju sel yang diukur [84], penyerapan pada 570 nm diukur menggunakan pembaca (Instrumen BioTek, Winooski, VT, USA).

4.4. Analisis mRNA oleh RT-PCR Separa Kuantitatif dan PCR Masa Nyata Kuantitatif

Sel HaCaT telah dirawat dengan Q-3-G（5-30 μM） atau retinol（10ug/mL） selama 12 jam.RNA dimendakkan menggunakan reagen TRI seperti yang dilaporkan sebelum ini [85]. Kit sintesis cDNA digunakan untuk mensintesis DNA pelengkap. RT-PCR telah dijalankan menggunakan primer terbalik dan hadapan khusus. Primer untuk RT-PCR dan PCR masa nyata disenaraikan dalam Jadual 1.

4.5. Ujian DPPH

Ujian DPPH telah digunakan untuk menilai kapasiti penghapusan radikal Q-3-G. Metanol digunakan untuk melarutkan DPPH kepada kepekatan akhir 250 μM. Kemudian, 475 mL DPPH adalah

bertindak balas dengan 5 mL Q-3-G（0-40 μM） atau AA（500 mM）pada 37 darjah selama 30 minit. Kawalan positif ialah AA. Penentuan kesan penghapusan DPPH dan pengiraan telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [86].

4.6.ABTS Assay

Ujian ABTS telah dilakukan seperti yang dilaporkan sebelum ini [72]. Secara ringkas, isipadu yang sama bagi larutan 7.4 mM ABTS dan larutan kalium persulfat 2.4 mM dicampur dan disimpan pada suhu bilik semalaman untuk menghasilkan kation radikal ABTS. Penyelesaian ABTS telah ditambahkan pada setiap telaga 96-plat telaga, dengan penambahan Q-3-G（0-40 μM） atau AA（500 mM） setiap telaga. Campuran diinkubasi pada 37 darjah selama 30 minit, dan kemudian penyerapannya pada 730 nm diukur.

4.7. Ujian ROS Selular oleh Sitometri Aliran

Untuk memeriksa pembentukan ROS intraselular, pewarna sensitif pengoksidaan, 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA), telah digunakan. Sel HaCaT terdedah kepada UV, dan kemudian sel dituai dan digantung semula dengan 300 ul PBS dengan 20 μM DCFDA selama 30 minit pada 37 darjah dalam gelap. Sel-sel kemudiannya dibasuh dengan PBS dan pendarfluor diukur pada 485/535 nm oleh Beckman CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, Amerika Syarikat).

4.8.Analisis Western Blot

Sel HaCaT telah disemai pada ketumpatan 6 × 10 darjah sel / mL. Selepas pengeraman semalaman, kepekatan berbeza Q-3-G（0-10 μM） atau retinol （10 ug/mL） telah ditambah dan terus diinkubasi selama 24 jam. Penyediaan protein dan lisat seluruh sel telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [87]. Antibodi khusus digunakan untuk mengesan jumlah bentuk dan bentuk fosforilasi Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src, dan Akt, yang divisualisasikan dengan reagen chemiluminescence [88].

4.9. Analisis Kandungan dan Rembesan Melanin

Sel B16F10 telah disemai pada ketumpatan 2×10 darjah sel/mL ke dalam 12-plat perigi dan diinkubasi semalaman. Medium kultur ditukar untuk medium segar ditambah dengan Q-3-G（10-20 μM） atau arbutin （1 mM）. Pengeluaran melanin telah dirangsang dengan a-MSH (100 nM) selama 48 jam. Untuk ujian rembesan melanin, ketumpatan optik pada 475 nm diukur. Selepas itu, sel-sel dituai untuk menentukan kandungan melanin intraselular, menggunakan penimbal lisis untuk melisiskan sel dan mengepamnya melalui sentrifugasi (12,000 rpm, 5 min). Pelet sel pekat telah dibubarkan dalam 100 mL penimbal larut (1 M NaOH, 10 peratus DMSO) dan cair pada 55 darjah. Penyerapan diukur pada 405 nm menggunakan pembaca ketumpatan optik [89].

4.10.Penyinaran UVB

Sel HaCaT telah disemai pada ketumpatan 1×105 sel/mL ke dalam 6-plat perigi menggunakan MEM bebas serum dan mengalami kebuluran selama 24 jam. Sel HaCaT telah dirawat terlebih dahulu dengan G-3-Q selama 30 minit dan kemudian penyinaran UVB. Kemudian, sel HaCaT telah dibasuh dengan PBS dan terdedah kepada penyinaran UVB (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Perancis). Tenaga penyinaran UVB ialah 30 mJ/cm2²【90】.

4.11.H2O2 Rawatan

Sel HaCaT telah disemai ke dalam 6-plat perigi dan tertakluk kepada 24 jam kelaparan menggunakan MEM tanpa serum. Sel-sel telah dirawat terlebih dahulu dengan kepekatan Q-3-G（5-10 μM yang berbeza dan selepas 30 minit diinkubasi dengan H2O2 （500 μM） selama 12 jam.

4.12. Luciferase Reporter Gene Assay

Sel HEK293T telah disemai pada ketumpatan 3×10 darjah sel/mL ke dalam 24-plat perigi. Sel HEK293T telah dipindahkan dengan 2 ug plasmid yang mengandungi AP-1-Luc atau NF-kB-Luc dan b-galactosidase, menggunakan polyethylenimine[91]. Selepas 24 jam pengeraman, sel telah dirawat dengan Q-3-G（5-10 μM） atau retinol（10 ug/mL） selama 24 jam lagi. Ujian luciferase dilakukan oleh luminometer pada penyerapan setiap sampel diukur pada 475 nm menggunakan pembaca plat mikro Spectramax 250 (Peranti Molekul, San Jose, CA, Amerika Syarikat), seperti yang dilaporkan sebelum ini [92].

4.13. Penggambaran Morfologi Sel

Sel HaCaT telah disemai ke dalam 6-plat perigi pada ketumpatan sel 1× 10 darjah sel/mL. Sel HaCaT telah dirawat dengan G-3-Q selama 30 minit dan kemudian penyinaran UVB. Selepas 24 jam, 4×, 10×, dan 20× gambar objektif mikroskop telah diambil (Olympus, Tokyo, Jepun).

4.14. Analisis statistik

Semua data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Ujian Mann-Whitney dan ujian-t Pelajar digunakan untuk membandingkan perbezaan statistik antara kumpulan. Satu nilai p<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Kesimpulan

Penyelidikan kami menunjukkan bahawa Q-3-aktiviti anti-radang dan antioksidan yang dipamerkan melindungi daripada faktor tekanan oksidatif dan keradangan di bawah penyinaran UVB dan pendedahan HO. Kami juga menunjukkan bahawa Q-3-G mempunyai keupayaan merangsang pelembap dalam sel HaCaT. Sebagai tambahan kepada kesan antitimelanogenesis Q-3-G, ia ditunjukkan untuk menghalang rembesan melanin dalam B16F10 yang disebabkan oleh -MSH. Akhir sekali, kesan Q-3-G telah dimediasi melalui pengaktifan laluan isyarat AP-1 dan NF-kB. Aktiviti pelindung kulit Q-3-G dalam sel keratinosit manusia HaCaT dan sel melanoma murine B16F10 diringkaskan dalam Rajah 5. Kajian ini membuktikan bahawa Q-3-G boleh berkesan kerana anti-radangnya, sifat antioksidan, pelembab dan antilanogenesis dalam keratinosit manusia dan sel melanoma melalui pengaktifan laluan NF-kB dan AP-1. Kesimpulannya, keputusan jelas menunjukkan bahawa metabolit konjugat ini berpotensi untuk melindungi sel kulit. Siasatan lanjut diperlukan untuk mengesahkan kesan Q-3-G dalam pelbagai model in vivo, terutamanya berkaitan model pelindung kulit.

Rujukan

1. Kim, E.; Hwang, K.; Lee, J.; Han, SY; Kim, E.-M.; Park, J.; Cho, JY Kesan perlindungan kulit daripada epigallocatechin gallate. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 173. [CrossRef]

2. Draelos, ZD Rawatan baharu untuk memulihkan kebolehtelapan halangan epidermis yang terjejas: krim pembaikan penghalang kulit. Clin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, AT; Zmijewski, MA; Zbytek, B.; Tobin, DJ; Theoharides, TC; Rivier, J. Peranan utama CRF dalam sistem tindak balas tekanan kulit. Endokr. Wahyu 2013, 34, 827–884. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Scott, T. Sinaran UV dan kulit. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 12222–12248. [CrossRef]

5. Rittie, L.; Fisher, Lata isyarat akibat cahaya UV GJ dan penuaan kulit. Penuaan Res. Wahyu 2002, 1, 705–720. [CrossRef]

6. Videira, JIKA; Moura, DF; Magina, S. Mekanisme mengawal melanogenesis. An. Coli. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [CrossRef] [PubMed]

7. Che, DN; Xie, GH; Cho, BO; Shin, JY; Kang, HJ; Jang, SI Kesan perlindungan ekstrak batang anggur terhadap kerosakan akibat UVB dalam kulit tikus C57BL. J. Photochem. Photobiol. B 2017, 173, 551–559. [CrossRef]

8. Jeong, D.; Lee, J.; Jeong, SG; Hong, YH; Yoo, S.; Han, SY; Kim, JH; Kim, S.; Kim, JS; Chung, YS; et al. Ekstrak etanol Artemisia Asiatica mempamerkan aktiviti anti-penuaan foto. J. Ethnopharmacol. 2018, 220, 57–66. [CrossRef]

9. McDaniel, D.; Farris, P.; Valacchi, G. Penuaan kulit atmosfera-Penyumbang, dan perencat. J. Kosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [CrossRef]

10. Rao, CV; Pal, S.; Mohammed, A.; Farooqui, M.; Doescher, MP; Asch, AS; Yamada, HY Kesan biologi dan akibat epidemiologi pendedahan arsenik, dan reagen yang boleh memperbaiki kerosakan arsenik dalam vivo. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Sinha, K.; Das, J.; Sahabat, PB; Sil, PC Tekanan oksidatif: Laluan apoptosis yang bergantung kepada mitokondria dan bebas mitokondria. Gerbang. Toksik. 2013, 87, 1157–1180. [CrossRef]