Bahagian 2: Kesan Anti-fibrotik 6-Bromo-indirubin-3 ′ -oxime (6-BIO) Melalui Peraturan Protein Pengaktif-1 (AP-1) Dan Faktor Transkripsi Protein Kekhususan-1 (SP-1) dalam Sel Buah Pinggang

Untuk Bahagian 1, klikdi sini.

3.3. 6-BIO melemahkan penanda fibrosis dan laluan isyarat berkaitan fibrosis dalam tubul proksimal (HK-2) dan sel fibroblas interstisial (NRK49F)

Seterusnya, kami mengesahkan kesan 6-BIO pada sel tubular proksimal dan sel fibroblas interstisial. Kami memerhatikan pengurangan kepekatan dan bergantung masa bagi ekspresi mRNA GSK3 oleh 6-BIO dalam sel HK-2 dan NRK49F (Rajah S2A dan B), dan ungkapan protein berkaitan ECM dan EMT yang terlibat dalambuah pinggangselfibrosisjuga dikurangkan (Rajah S2E). Selain itu, ekspresi dipertingkatkan GSK3 , apabila pendedahan TGF terhadap sel-sel ini, juga berkurangan dengan 6-rawatan BIO (Rajah S2C dan D). Rajah 3 menunjukkan ekspresi protein bagibuah pinggangfibrosispenanda dalam sel HK-2 dan NRK49F yang dirawat dengan TGF . Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3A, ekspresi protein PAI-1 dan CTGF meningkat dengan ketara sebagai tindak balas kepada rawatan dengan 5 dan 10 ng/mL TGF dalam sel HK-2 dan NRK49F, masing-masing. Walau bagaimanapun, ekspresi mereka berkurangan dengan ketara selepas rawatan dengan 6-BIO (Rajah 3B).SMADdan laluan isyarat MAPK dikawal oleh rawatan TGF, yang diterbalikkan oleh 6-rawatan BIO (Rajah 4). Seterusnya, kami menyiasat ungkapan faktor transkripsi AP-1 dan SP-1 yang terlibat dalam isyarat pengantaraan TGF dalam sel HK-2 dan NRK49F. Rajah 4D menunjukkan bahawa peningkatan pengantaraan TGF dalam PC-JUN dan PC-FOS telah dikurangkan sebagai tindak balas kepada rawatan dengan 6-perencat BIO dan JNK SP600125 dan apabila pemindahan C-JUN negatif dominan. Rajah 4E menunjukkan perubahan dalam keamatan protein berbanding kawalan. Selain itu, peningkatan pengantaraan TGF dalam tahap SP-1 telah dilemahkan dengan ketara sebagai tindak balas kepada rawatan dengan siRNA 6-BIO dan SP-1 (Rajah 4F). Rajah 4G menunjukkan perubahan dalam keamatan protein berbanding kawalan. Keputusan ini mencadangkan bahawa TGF /SMADdan isyarat MAPK serta faktor transkripsi, AP-1 dan SP-1, dikawal oleh 6-BIO.

3.4. 6-BIO melemahkan ekspresi nuklear protein PC-JUN, PC-FOS dan SP-1 dalam sel fibroblas tubular dan interstisial proksimal

Rajah 5A dan B menunjukkan penyetempatan PAI-1 dan CTGF dengan PC-JUN, PC-FOS dan SP-1. Pewarnaan merah PC-JUN, PC-FOS dan SP{11}} menunjukkan ekspresi berlebihan mereka dalam nukleus selepas rawatan TGF; begitu juga, pewarnaan hijau PAI-1 dan CTGF menunjukkan ekspresi berlebihan mereka dalam sitosol. Walau bagaimanapun, tahap ekspresi PC-JUN, PC-FOS dan SP-1 telah dikurangkan oleh 6-layanan BIO. Keputusan ini mencadangkan bahawa 6-BIO secara langsung mempengaruhi AP-1 dan SP-1, faktor transkripsi yang mengawal selia PAI-1 dan ungkapan CTGF.

3.5. 6-BIO melemahkan aktiviti penggalak PAI-1, CTGF, AP-1 dan SP-1 dalam sel fibroblas tubular dan interstisial proksimal

Seterusnya, kami menyiasat sama ada 6-BIO menghalang aktiviti penggalak gen PAI-1, CTGF, AP-1 dan SP-1. Aktiviti penggalak PAI-1 dan CTGF meningkat sebagai tindak balas kepada TGF tetapi dikurangkan oleh 6-rawatan BIO (Rajah 6A dan B). Selain itu, penurunan itu ketara apabila sel dirawat dengan 6-BIO sahaja berbanding dengan kehadiran TGF . AP-1 dan SP-1 mengikat kepada penganjur PAI-1 dan CTGF. Rajah 6C dan 6D menunjukkan aktiviti penggalak AP-1 dan SP-1. Aktiviti luciferase AP-1 dan SP{16}} telah ditingkatkan dengan rawatan TGF dan dikurangkan sebanyak 6-BIO dalam cara yang bergantung kepada dos. Rajah 6E menunjukkan ungkapan faktor transkripsi dalam ekstrak protein nuklear. Oleh itu, kami mengesahkan bahawa ekspresi nuklear PC-JUN, PC-FOS dan SP-1 meningkat sebagai tindak balas kepada rawatan TGF dan telah ditindas oleh 6-rawatan BIO. Rajah 6F menunjukkan perubahan dalam keamatan protein berbanding kawalan. Selain itu, keputusan kami mencadangkan bahawa 6-BIO bertindak pada tapak pengikatan faktor transkripsi penganjur untuk melemahkan pengikatan AP-1 dan SP-1. Kami melakukan ujian pengikatan promoter in vitro dengan kehadiran 6-BIO untuk mengesahkan perkara yang sama. Pengikatan protein nuklear dan PC-JUN, PC-FOS dan SP-1 telah dilemahkan oleh penambahan 6-BIO dalam cara yang bergantung kepada kepekatan (tambahan Rajah 3). Keputusan ini menunjukkan bahawa 6-BIO menghalang aktiviti penggalak PAI-1 dan CTGF serta fungsi AP-1 dan SP-1; oleh itu, ia mungkin mempunyai potensi terapeutik dalambuah pinggangfibrosis.

4. Perbincangan

Menggunakan model tikus UUO dan TGF -treatedbuah pinggangtubul proksimal yang diperolehi dan garisan sel fibroblast interstisial, kami menunjukkan bahawa 6-rawatan BIO boleh melemahkanbuah pinggangkerosakan. Model UUO ialah model haiwan perwakilan nefropati obstruktif yang dicirikan oleh tubulointerstitial progresif.fibrosis[43]. Analisis histopatologi bagibuah pinggangtisu yang diperoleh daripada model UUO menunjukkan bahawa pengumpulan ECM dan atrofi tiub dalam ruang interstisial telah dipulihkan oleh 6-rawatan BIO. Di samping itu, menggunakan TGF -treatedbuah pinggangsel fibroblas interstisial yang berasal dari tubul proksimal, kami menunjukkan bahawa 6-rawatan BIO boleh melemahkanbuah pinggangkerosakan. Dalam model UUO dan sel HK-2 dan NRK49F yang dirawat TGF, 6-BIO menghalang ekspresibuah pinggangfibrosispenanda serta MAPK danSMADlaluan isyarat. Selain itu, 6-rawatan BIO mengurangkan ekspresi protein PC-JUN, PC-FOS dan SP-1 yang disebabkan oleh UUO dan TGF , serta ekspresi nuklear dan aktiviti penggalak AP{{6 }} dan SP-1 dalam TGF- -merawat sel HK-2 dan NRK49F. Perencatan faktor transkripsi AP- dan SP-1 oleh 6-rawatan BIO telah dikaitkan dengan perencatan pengumpulan ECM yang membawa kepada pemburukanbuah pinggangfibrosis. Ini dicapai dengan menekan MAPK danSMADlaluan isyarat yang membawa kepada pengurangan dalam ekspresi PAI-1 dan CTGF. Keputusan kami mencadangkan bahawa 6-BIO mungkin menjadi agen terapeutik yang berpotensi melawanbuah pinggangpenyakit, serta untuk mencegahbuah pinggangkerosakan yang disebabkan oleh UUO dan TGF .

Klik untuk Cistanche organik untuk penyakit buah pinggang

Derivatif indirubin telap sel semisintetik 6-BIO tergolong dalam keluarga bis-indole dan secara semula jadi berlaku dalam moluska dan tumbuhan gastropod yang boleh dimakan [12]. Indirubin mengandungi ikatan hidrogen intramolekul antara 2-C ikatan berganda O dan kumpulan N1-H dan satu lagi ikatan hidrogen antara molekul antara molekul. 6-BIO mempunyai struktur yang diubah suai secara kimia di mana kedudukan 6-digantikan dengan Br untuk mengatasi kelemahan sifat farmakokinetik yang lemah disebabkan oleh keterlarutan indirubin dalam air yang rendah [44]. Banyak indirubin, kerana pengikatan kompetitif dengan ATP, bertindak sebagai perencat dwi kinase bergantung kepada siklik (CDK) dan kinase glikogen sintase{{10}} (GSK-3 ), mempamerkan lebih daripada {{ 12}}selektiviti lipat ke atas CDK5 [12]. Selain itu, 6-BIO mempamerkan perencatan terpilih GSK yang ketara-3 dengan nilai IC50 0.005 μM [12]. Menurut laporan oleh beberapa kumpulan, 6-BIO menghalang sepenuhnya pembiakan sel MCF-7 dan menyekat penghijrahan sebanyak kira-kira 75 peratus pada kepekatan 10 μM dan menghalang fosforilasi PDK1. Ini menunjukkan bahawa 6-BIO telah dimasukkan ke dalam poket pengikat PDK1 untuk membentuk tiga ikatan hidrogen dengan sisa di kawasan engsel, dan poket pengikat mudah menampung atom Br tambahan dalam 6-BIO [45]. Dengan ciri-ciri ini, 6-BIO sedang dikaji sebagai ubat baharu untuk mengawal selia proses selular seperti keradangan berkaitan penuaan, tekanan oksidatif, kemandirian sel, percambahan dan apoptosis dalam kanser, diabetes dan penyakit degeneratif [46,47 ]. Walau bagaimanapun, kajian mengenai peraturan gen dan mekanisme molekul yang berkaitan denganbuah pinggangselfibrosisadalah terhad. Oleh itu, kami berusaha untuk menyiasat sama ada 6-BIO dilemahkanbuah pinggangfibrosisdengan menghalang peraturan gen PAI-1 dan CTGF dalambuah pinggangsel, dengan itu mengurangkan pengumpulan ECM.

Beberapa kajian telah menggunakan model UUO untuk melaporkan korelasi antara pengumpulan ECM dan kronikbuah pinggangpenyakit yang disebabkan oleh interstisial tiubfibrosis[43]. Selain itu, PAI{1}} dan CTGF yang diekspresikan berlebihan dilaporkan dikaitkan dengan pengumpulan ECM yang tinggi semasa perkembangan penyakit kronik.buah pinggangpenyakit. Oleh itu, mengenal pasti molekul terapeutik yang menghalang isyarat dan transkripsi gen yang dikaitkan dengan pengumpulan ECM yang dipertingkatkan adalah penting untuk menghalang dengan berkesan.buah pinggangfibrosis. Oleh itu, dalam kajian ini, kami menilai 6-BIO, salah satu perencat glikogen sintase kinase 3 (GSK-3 ), dalambuah pinggangfibrosis.

Kami mengkaji kesan protein PAI-1 dan CTGF padabuah pinggangselfibrosisdan mengesahkan bahawa ungkapan mereka dikawal oleh faktor transkripsi biasa, AP-1 dan SP-1. Faktor transkripsi, AP-1, ialah heterodimer yang terdiri daripada protein kepunyaan JUN (C-JUN, JUNB dan JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1 dan Fra{ {6}}), ATF (faktor transkripsi pengaktifan), dan keluarga JDP (protein dimerisasi JUN) [48]. Ia mengawal beberapa proses selular seperti percambahan sel, kematian,

pembezaan, dan vaskularisasi. Kajian terdahulu melaporkan bahawa aktiviti AP-1 meningkat dalam hati dan paru-paru dengan pengaktifan kolagen dan fibroblas jenis VI [49,50]. Dua komponen utama AP-1, C-JUN dan C-FOS bertindak balas kepada pelbagai rangsangan, seperti sitokin, faktor pertumbuhan dan tekanan [51]. Kami melihat peningkatan fosforilasi C-JUN dan C-FOS dalam model tikus UUO dan sel HK-2 dan NRK49F yang dirawat TGF (Rajah 2D dan 4D). C-JUN dan C-FOS membentuk heterodimer dan mengikat pada tapak pengikatan AP{16}} dalam DNA, dengan itu bertindak sebagai faktor transkripsi untuk mengawal selia ekspresi gen lain. Di samping itu, fosforilasi ERK1 / 2 dan JNK mengaktifkan C-FOS dan C-JUN, masing-masing. Dalam kajian kami, fosforilasi ERK1 / 2 dan JNK, serta C-JUN dan C-FOS dalam nukleus telah meningkat dengan ketara sebagai tindak balas kepada rawatan dengan TGF . Walau bagaimanapun, 6-rawatan BIO telah membalikkan kesan ini dengan ketara. Kajian kami menunjukkan bahawa 6-BIO menghalang fosforilasi ERK1/2 dan JNK dengan cekap dan mengurangkan aktiviti faktor transkripsi AP-1, dengan itu menghalang fosforilasi C-JUN dan C-FOS yang merupakan hilirannya pengesan. Perencatan SP-1 dalam astrosit hepatik mengenakan ananti fibrotikkesan [52]. Kajian lain menunjukkan bahawa SP-1 memainkan peranan penting dalamfibrosis[52,53]. Oleh itu, kami menilai sama ada 6-BIO boleh menghalang faktor transkripsi SP-1. Kami memerhatikan bahawa ekspresi protein SP-1 meningkat sebagai tindak balas kepada rawatan TGF serta dalam model UUO, manakala ia menurun selepas 6-rawatan BIO. Selain itu, ungkapan nuklear SP-1 yang diakibatkan oleh TGF telah ditindas oleh 6-rawatan BIO. Akibatnya, aktiviti penganjur PAI-1 dan CTGF, yang mempunyai tapak pengikat AP-1 dan SP-1, turut dikurangkan dengan rawatan dengan 6-BIO (Rajah 6 ). Oleh itu, penemuan ini mencadangkan bahawa penurunan dalam aktiviti promoter PAI-1 dan CTGF sebanyak 6-rawatan BIO menurunkan ekspresi protein PAI-1 dan CTGF, dan mengurangkan pengumpulan ECM, sekali gus mengurangkanbuah pinggangselfibrosis.

5. Kesimpulan

6-Rawatan BIO menurunkan PAI-1 dan ungkapan CTGF dalam model UUO dan TGF dirawatbuah pinggangsel. Selain itu, 6-BIO menghalang pengaktifan yang disebabkan oleh TGFSMADdan isyarat MAPK, sambil turut menghalang aktiviti AP-1 dan SP-1, dua daripada beberapa faktor transkripsi yang mengikat penggalak gen PAI-1 dan CTGF. Perencatan AP-1 dan SP-1 nampaknya merupakan salah satu mekanisme utama yang 6-BIO menghalangbuah pinggangfibrosis. Oleh itu, keputusan kami mencadangkan bahawa 6-BIO mungkin menjadi agen terapeutik yang berpotensi melawanbuah pinggangpenyakit.

penyata sumbangan pengarang CRedit

Jung Sun Park: Pengkonsepan, Metodologi, Penyusunan data, Penulisan − penyediaan draf asal, Penulisan − semakan & penyuntingan, Visualisasi, Pemerolehan pembiayaan. Dalam Ae Jung: Kurasi data, Penulisan − semakan & penyuntingan. Hong Sang Choi: Penyusunan data, Penulisan − semakan & penyuntingan. Dong-Hyun Kim: Metodologi, Penyusunan data. Hoon In Choi: Metodologi, Penyusunan data. Eun Hui Bae: Penulisan − ulasan & penyuntingan, Penyeliaan. Seong Kwon Ma: Penulisan − ulasan & penyuntingan,

6. Rujukan

Sumber daripada Jung Sun Park et, al on Biomedicine & Pharmacotherapy 145 (2022) 112402