Bahagian 1: Efflux Magnesium Daripada Sel Drosophila Kenyon Adalah Kritikal Untuk Memori Jangka Panjang Normal Dan Dipertingkatkan Diet

untuk maklumat lanjut:Ali.ma@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk Bahagian 2

Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D Jovanoski1, Hiroaki Miki2, Scott Waddell1*

1Pusat Litar dan Tingkah Laku Neural, The University of Oxford, Bangunan Tinsley, Oxford, United Kingdom; 2Jabatan Peraturan Selular, Institut Penyelidikan Penyakit Mikrob, Universiti Osaka, Suita, Jepun

Abstrak Makanan tambahan magnesium (Mg2 plus) boleh meningkatkaningatanpada tikus muda dan tua.Ingatan-peningkatan kapasiti sebahagian besarnya dikaitkan dengan peningkatan ketumpatan sinaptik hippocampal dan ekspresi tinggi subunit NR2B reseptor glutamat jenis NMDA. Di sini kami menunjukkan bahawa pemakanan Mg2 plus juga meningkatkan jangka panjangingatandalam Drosophila. Normal dan Mg2 plus - lalat yang dipertingkatkaningatankelihatan bebas daripada reseptor NMDA dalam badan cendawan dan sebaliknya memerlukan ekspresi pengangkut Mg2 plus -efflux jenis CNNM yang dipelihara yang dikodkan oleh gen tidak dilanjutkan (uex). UEX mengandungi domain homologi pengikat nukleotida kitaran yang diduga dan mutasinya memisahkan peranan penting untuk uex daripada fungsi dalamingatan. Selain itu, penyetempatan UEX dalam sel Kenyon badan cendawan (KCs) diubah dalamingatan-lalat yang rosak menyimpan mutasi dalam gen berkaitan cAMP. Pengimejan berfungsi menunjukkan bahawa efluks yang bergantung kepada UEX diperlukan untuk penyelenggaraan berirama perlahan KC Mg2 plus . Kami mencadangkan bahawa efluks Mg2 plus neuron terkawal adalah penting untuk normal dan Mg2 plus -dipertingkatkan.ingatan.

Klik untukKedai vitamin Cistanche dan Cistanche untuk ingatan

pengenalan

Magnesium (Mg2 plus) memainkan peranan penting dalam metabolisme selular dan dianggap sebagai faktor bersama penting untuk lebih daripada 350 enzim (Romani dan Scarpa, 2000; Vink dan Nechifor, 2011). Akibatnya, perubahan Mg2 ditambah homeostasis dikaitkan dengan pelbagai keadaan klinikal, termasuk yang mempengaruhi sistem saraf, seperti glaukoma (DeToma et al., 2014), penyakit Parkinson (Hermosura et al., 2005; Hermosura dan Garruto, 2007; Lin et al., 2014; Shindo et al., 2016), penyakit Alzheimer (Andra´si et al., 2000; Andra´si et al., 2005; Cilliler et al., 2007; Durlach et al. ., 1997; Glick, 1990; Lemke, 1995; Chui et al., 2011; Vural et al., 2010), kebimbangan (Sartori et al., 2012), kemurungan (Whittle et al., 2011; Murck, 2002; Murck, 2013; Rasmussen et al., 1990; Ghafari et al., 2015), dan ketidakupayaan intelek (Arjona et al., 2014).

Mungkin mengejutkan, meningkatkan otak Mg2 plus melalui diet boleh meningkatkan keplastikan neuron daningatanprestasi tikus muda dan tua, diukur dalam pelbagai tugas tingkah laku (Slutsky et al., 2010; Landfield dan Morgan, 1984; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Di samping itu, peningkatan Mg2 ditambah mengurangkan defisit kognitif dalam model tikus penyakit Alzheimer (Li et al., 2013) dan meningkatkan kepupusan kenangan ketakutan (Abumaria et al., 2011). Kesan yang nampaknya bermanfaat ini telah membawa kepada cadangan bahawa diet Mg2 plus mungkin mempunyai nilai terapeutik untuk pesakit dengan pelbagaiingatan-masalah berkaitan (Billard, 2011).

Walaupun terdapat sejumlah besar tapak berpotensi Mg2 plus tindakan di dalam otak, iaingatan-meningkatkan harta dalam tikus sebahagian besarnya telah dikaitkan dengan peningkatan ketumpatan sinaptik hippocampal dan aktiviti reseptor glutamat N-metil-D-aspartat (NMDARs). Tambahan Mg2 ekstraselular menyekat liang saluran NMDAR dan dengan itu menghalang laluan ion-ion lain (Mayer et al., 1984; digest Pepatah pepatah 'anda adalah apa yang anda makan' dengan sempurna meringkaskan konsep bahawa diet kita boleh mempengaruhi kedua-dua mental dan kesihatan fizikal. Kami tahu bahawa makanan yang baik untuk jantung, seperti kekacang, ikan berminyak dan beri, juga baik untuk otak. Kami juga tahu bahawa vitamin dan mineral penting untuk kesihatan yang baik secara keseluruhan. Tetapi adakah bukti bahawa meningkatkan pengambilan vitamin atau mineral tertentu boleh membantu meningkatkan kuasa otak anda?

Walaupun ia mungkin terdengar hampir terlalu bagus untuk menjadi kenyataan, terdapat beberapa bukti bahawa ini berlaku untuk sekurang-kurangnya satu mineral, magnesium. Kajian ke atas tikus telah menunjukkan bahawa menambahkan suplemen magnesium ke dalam makanan meningkatkan prestasi haiwan melakukan tugas ingatan. Kedua-dua haiwan muda dan tua mendapat manfaat daripada magnesium tambahan. Malah tikus tua dengan keadaan yang serupa dengan penyakit Alzheimer menunjukkan kurangingatanrugi apabila diberi suplemen magnesium. Tetapi bagaimana dengan spesies lain?

Wu et al. kini menunjukkan bahawa suplemen magnesium juga meningkatkan prestasi ingatan dalam lalat buah. Satu kumpulan lalat diberi makan dengan tepung jagung standard selama beberapa hari, manakala kumpulan lain menerima tepung jagung yang ditambah dengan magnesium. Kedua-dua kumpulan kemudiannya dilatih untuk mengaitkan bau dengan ganjaran makanan. Lalat yang telah menerima magnesium tambahan menunjukkan lebih baikingatanuntuk bau apabila diuji 24 jam selepas latihan.

Wu et al. menunjukkan bahawa magnesium bertambah baikingatandalam lalat melalui mekanisme yang berbeza daripada yang dilaporkan sebelum ini untuk tikus. Dalam tikus, magnesium meningkatkan tahap protein reseptor untuk bahan kimia otak yang dipanggil glutamat. Dalam lalat buah, sebaliknya, lalatingatanrangsangan bergantung kepada protein yang mengangkut magnesium daripada neuron. Lalat mutan yang kekurangan pengangkut ini menunjukkan gangguan ingatan. Tidak seperti lalat biasa, mereka yang tidak mempunyai pengangkut tidak menunjukkan peningkatan ingatan selepas makan makanan yang diperkaya dengan magnesium. Keputusan menunjukkan bahawa pengangkut boleh membantu menyesuaikan tahap magnesium di dalam sel otak sebagai tindak balas kepada aktiviti saraf.

Manusia menghasilkan empat varian pengangkut magnesium ini, setiap satu dikodkan oleh gen yang berbeza. Salah satu pengangkut ini telah pun terlibat dalam perkembangan otak. Penemuan Wu et al. mencadangkan bahawa pengangkut juga boleh bertindak dalam otak dewasa untuk mempengaruhi kognisi. Kajian lanjut diperlukan untuk menguji sama ada menyasarkan pengangkut magnesium akhirnya boleh menjanjikan rawataningatankemerosotan.

Bekkers dan Stevens, 1993; Jahr dan Stevens, 1990; Nowak et al., 1984). Yang penting, depolarisasi neuron sebelum ini, didorong oleh reseptor pemancar lain, diperlukan untuk melepaskan blok Mg2 plus pada NMDAR dan membenarkan kemasukan Ca2 plus berpagar glutamat. Oleh itu, NMDAR memainkan peranan penting dalam keplastikan neuron sebagai pengesan kebetulan Hebbian yang berpotensi. Ketinggian akut kepekatan tambahan Mg2 ekstraselular ([Mg2 tambah ]e) dalam julat fisiologi (0.8-1.2 mM) boleh menentang induksi potensiasi jangka panjang yang bergantung kepada NMDAR (Dunwiddie dan Lynch, 1979; Malenka et al., 1992; Malenka dan Nicoll, 1993; Slutsky et al., 2004). Sebaliknya, peningkatan [Mg2 plus ] e selama beberapa jam dalam budaya neuron membawa kepada peningkatan arus pengantara NMDAR dan memudahkan ekspresi LTP (Slutsky et al., 2004). Kesan peningkatan peningkatan [Mg2 plus] e juga diperhatikan dalam vivo dalam otak tikus yang diberi makan dengan Mg2 plus -L-threonate (Slutsky et al., 2010). Litar neuron hippocampal menjalani keplastikan homeostatik (Turrigiano, 2008) untuk menampung peningkatan [Mg2 plus] e dengan mengawal selia ekspresi NMDAR yang mengandungi subunit NR2B (Slutsky et al., 2004; Slutsky et al., 2010). Ketumpatan sinaps hippocampal yang lebih tinggi dengan NR2B yang mengandungi NMDAR dipercayai dapat mengimbangi peningkatan kronik dalam [Mg2 tambah ]e dengan meningkatkan arus NMDAR semasa tembakan pecah. Untuk menyokong model ini, tikus yang direka bentuk secara genetik untuk mengekspresikan NR2B secara berlebihan mempamerkan LTP hippocampal dan tingkah laku yang dipertingkatkan.ingatan(Tang et al., 1999).

Penciumaningatandalam Drosophila melibatkan mekanisme heterosinaptik yang didorong oleh menguatkan neuron dopaminergik, yang mengakibatkan kemurungan presinaptik sambungan kolinergik antara sel Kenyon badan cendawan yang diaktifkan bau (MB) dan neuron keluaran badan cendawan hiliran (MBON) (Schwaerzel et al., 2003). Aso et al., 2010; Aso et al., 2012; Claridge-Chang et al., 2009; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Plac¸ais et al., 2013; Owald et al. ., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Oswald dan Waddell, 2015). Di samping itu, maklumat penciuman disampaikan kepada KC melalui penghantaran kolinergik daripada neuron unjuran penciuman (Yasuyama et al., 2002; Leiss et al., 2009). Walaupun dapat dibayangkan bahawa glutamat dihantar ke rangkaian MB melalui laluan yang belum dikenal pasti, pada masa ini tiada lokasi yang jelas untuk keplastikan yang bergantung kepada NMDAR dalam seni bina yang diketahui bagi lapisan input atau output kolinergik (Barnstedt et al., 2016). ). Lalat itu, oleh itu, menyediakan model yang berpotensi untuk menyiasat mekanisme lain yang melaluinya pemakanan Mg2 plus mungkin meningkatingatan.

Kesan pengukuhan dopamin bergantung pada reseptor dopamin jenis Dop1R D1-(Kim et al., 2007; Qin et al., 2012; Handler et al., 2019), yang digabungkan secara positif dengan pengeluaran cAMP (Tomchik dan Davis, 2009; Boto et al., 2014). Selain itu, kajian awal di Drosophila mengenal pasti dunce dan rutabaga yang dikodkan cAMP phosphodiesterase dan jenis I Ca2 plus -stimulated adenylate cyclase, masing-masing, menjadi penting untuk penciuman.ingatan(Dudai et al., 1976; Byers et al., 1981; Dudai and Zvi, 1984; Chen et al., 1986; Livingstone et al., 1984; Levin et al., 1992). Kajian dalam sel mamalia telah menunjukkan bahawa hormon atau agen yang meningkatkan tahap cAMP selular sering menimbulkan penyemperitan Na plus yang bergantung kepada Mg2 plus ke dalam ruang ekstraselular (Romani dan Scarpa, 1990b; Romani dan Scarpa, 1990a; Romani dan Scarpa, 2000; Vink dan Nechifor, 2011; Vormann dan Gu¨nther, 1987). Walau bagaimanapun, tidak jelas sama ada penyemperitan Mg2 plus memainkan sebarang peranan dalam pemprosesan memori.

Di sini kami menunjukkan bahawa Drosophila jangka panjangingatan(LTM) boleh dipertingkatkan dengan pemakanan tambahan Mg2 ditambah. Kami mendapati bahawa gen yang tidak dilanjutkan (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010), yang menyandikan ortolog lalat berfungsi protein Cyclin M2 Mg2 plus -efflux transporter (CNNM) mamalia, adalah penting untukingatan-meningkatkan sifat Mg2 plus . Fungsi UEX dalam MB KC diperlukan untuk LTM dan pemulihan fungsi uex mendedahkan MB menjadi tapak utama peningkatan memori bergantung kepada Mg2. Mengubah metabolisme cAMP secara kronik dengan memperkenalkan mutasi dalam gen dnc atau rut mengubah penyetempatan selular UEX. Selain itu, mengubah domain homologi pengikat nukleotida kitaran terpelihara (CNBH) dalam UEX melepaskan peranan penting untuk uex daripada fungsinya dalam ingatan. Mg2 plus efflux dipacu UEX diperlukan untuk penyelenggaraan berirama perlahan tahap KC Mg2 plus yang mencadangkan peranan berpotensi untuk pemprosesan Mg2 plus fluks dalam memori.

Keputusan

Pemberian Mg2 plus meningkatkan LTM lalat jenis liar

Kajian terdahulu melaporkan bahawa memberi makan tikus dengan makanan yang mengandungi kepekatan tinggi Mg2 plus -meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan mereka (Slutsky et al., 2010; Landfield dan Morgan, 1984; Abumaria et al., 2011; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Oleh itu, kami menguji sama ada kesan serupa wujud pada lalat dengan memberi mereka makanan yang mengandungi kepekatan Mg2 plus yang tinggi sebelum latihan. Anehnya, lalat jenis liar yang diberi makan selama 4 hari sebelum latihan dengan makanan yang ditambah dengan magnesium klorida (MgCl2) tambahan menunjukkan prestasi memori 24 jam yang dipertingkatkan dengan ketara. Peningkatan ingatan bergantung pada kepekatan dan adalah maksimum apabila makanan ditambah dengan 80 mM MgCl2 (Rajah 1A). Prestasi ingatan serta-merta tidak dipertingkatkan dengan jelas (Rajah 1B). Kesan peningkatan MgCl2 juga diperhatikan pada lalat yang diberi magnesium sulfat (MgSO4) tetapi bukan kalsium klorida (CaCl2) (Rajah 1C). Di samping itu, memberi makan lalat selama 4 hari dengan makanan yang mengandungi antara 5 dan 80 mM strontium klorida (SrCl2) mengakibatkan tahap kematian yang tinggi dan lalat yang terselamat daripada pemberian 5 mM SrCl2 tidak menunjukkan peningkatan prestasi ingatan serta-merta atau 24 jam (data tidak ditunjukkan) . Oleh itu, kesan peningkatan ingatan boleh dikaitkan secara khusus dengan suplemen pemakanan Mg2 plus divalen.

Memori yang dipertingkatkan Mg2 plus adalah bebas daripada NMDAR dalam badan cendawan

Oleh kerana ingatan yang dipertingkatkan magnesium-L-threonate pada tikus dikaitkan dengan pengawalseliaan NMDAR yang mengandungi subunit NR2B hippocampal (Slutsky et al., 2010), kami menguji perubahan dalam ekspresi reseptor glutamat dalam lalat yang diberi MgCl2. Analisis RT-qPCR tidak mendedahkan perbezaan yang ketara dalam banyaknya mRNA untuk reseptor NMDA (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA), atau jenis kainate (GluRIIA) dalam kepala yang diambil daripada lalat yang diberi makan selama 4 hari dengan 80 mM MgCl2 berbanding yang diberi makan dengan 1 mM MgCl2 (Rajah 1D).

Kami seterusnya secara langsung menguji sama ada memori dipertingkatkan Mg2 plus memerlukan fungsi NMDAR, dengan mengetuk ekspresi gen Nmdar1 atau Nmdar2 menggunakan gangguan RNA dipacu UAS transgenik

Rajah 1. Pemakanan tambahan Mg2 ditambah meningkatkan daya ingatan jangka panjang Drosophila. (A) Lalat jenis liar telah dilatih dan diuji untuk ingatan selera 24 jam selepas 1-5 hari ad libitum memakan makanan yang ditambah dengan Mg2 plus. Memori telah dipertingkatkan dengan ketara dalam lalat yang diberi makan selama 4 hari dengan 80 mM MgCl2, berbanding dengan yang diberi makan dengan 1 mM. 80 mM MgCl2 menghasilkan prestasi yang lebih tinggi sedikit daripada 50 mM atau 100 mM dan oleh itu dianggap optimum (asteris menandakan p<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

Versi dalam talian artikel ini termasuk tambahan angka berikut untuk angka 1:

Tambahan Rajah 1. Pengurangan reseptor glutamat N-metil-D-aspartat (NMDAR) dalam badan cendawan tidak menjejaskan ingatan yang dipertingkatkan Mg2 plus.

(RNAi) membina (Dietzl et al., 2007; Perkins et al., 2015). Daripada dua garisan bebas UAS-Nmdar1R-NAi dan empat baris UAS-Nmdar2RNAi yang kami uji, hanya satu baris Nmdar1RNAi (BDSC 25941), apabila didorong dalam semua neuron oleh neuron Synaptobrevin (nSyb) -GAL4, menunjukkan penurunan prestasi memori 24 jam dengan ketara, kerana berbanding dengan lalat kawalan heterozigot (Rajah 1—tambahan angka 1A). Sebaliknya, ungkapan yang lebih selektif bagi UAS-Nmdar1RNAi ini dalam ab KC yang berkaitan dengan LTM menggunakan c739-GAL4 tidak menjejaskan prestasi memori 24 jam dengan ketara (Rajah 1—tambahan angka 1B). Lebih-lebih lagi, lalat yang mengekspresikan Nmdar1RNAi dalam neuron ab mengekalkan ingatan Mg2 ditambah yang teguh (Rajah 1-angka tambahan 1C). Keputusan ini menunjukkan bahawa memori yang dipertingkatkan Mg2 plus tidak mengubah ekspresi reseptor glutamat, atau memerlukan fungsi NMDAR dalam ab KCs.

Kepekatan Mg2 tambah dalam neuron ab dinaikkan dalam lalat yang diberi makan Mg2 tinggi yang tinggi Kami menggunakan MagFRET, sensor pendarfluor Mg2 plus yang dikodkan secara genetik pertama (Lindenburg et al., 2013), untuk menguji sama ada pemberian Mg2 plus mengubah kepekatan Mg2 plus intrasel ([Mg2 tambah ]i). Kami membina lalat yang menyimpan transgen UAS-MagFRET-1 dan menggabungkannya dengan c739-GAL4 untuk menyatakan MagFRET- 1 dalam ab KCs. Kami membandingkan isyarat FRET dalam otak tetap dari c739; UAS-MagFRET-1 diberi makan sama ada 1 mM atau 80 mM MgCl2 makanan selama 4 hari. Isyarat MagFRET adalah jauh lebih tinggi dalam kedua-dua cagaran a dan b bagi ab KC lalat yang diberi makan dengan 80 mM, berbanding dengan yang diberi makan dengan 1 mM (Rajah 1E). Keputusan ini menunjukkan bahawa pemberian Mg meningkatkan neuron [Mg2 plus ]i. Memandangkan pertalian MagFRET-1 (Kd=148 mM) dan ~50 peratus peningkatan isyarat FRET apabila pengikatan Mg2 ditambah (Lindenburg et al., 2013), kami menganggarkan bahawa ~8 peratus peningkatan isyarat MagFRET yang diukur dalam lalat yang diberi 80 mM MgCl2 sepadan kira-kira dengan peningkatan 50 mM ab KC [Mg2 tambah ]i secara purata.

Pengangkut Mg2 plus jenis CNNM yang dikodkan tidak dilanjutkan mempunyai peranan dalam ingatan

Kami mengenal pasti unextended (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) sebagai LTM pencium selera yang mengubah gen, diperkukuh dengan ganjaran sukrosa. Lalat dengan sisipan uexMI01943 MiMIC (Venken et al., 2011) menunjukkan kecacatan yang kuat dalam ingatan 24 jam, tetapi prestasi mereka sejurus selepas latihan tidak dapat dibezakan daripada kawalan jenis liar. Analisis lebih terperinci tentang lalat uexMI01943 mendedahkan pereputan ingatan yang stabil yang mula-mula menjadi jauh berbeza dengan lalat jenis liar 12 jam selepas latihan (Rajah 2A). Tiada kecacatan ingatan yang nyata dalam heterozigot uexMI01943/ plus lalat, menunjukkan bahawa alel seks yang diduga ini adalah resesif.

uex menarik perhatian kami kerana ia adalah ortolog lalat tunggal bagi empat gen CNNM manusia yang mengekodkan pengangkut Mg2 plus (Ishii et al., 2016), dan ia juga mengandungi domain CNBH yang diduga yang berkaitan secara struktur dengan mereka dalam berpagar nukleotida kitaran. saluran (Zagotta et al., 2003; Flynn et al., 2007; Kesters et al., 2015). Penjajaran jujukan 834 asid amino UEX dengan CNNM1-4 mendedahkan pemuliharaan jujukan yang tinggi terutamanya dengan CNNM2 dan CNNM4 dalam domain DUF21, CBS dan CNBH (Rajah 2—tambahan angka 1A–C). Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa UEX mempunyai potensi untuk menghubungkan kesan peningkatan memori Mg2 plus pemakanan dengan keplastikan neuron yang bergantung kepada cAMP.

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >230 kb lebih jauh. Kami mula-mula mengesahkan lokasi MiMIC dengan PCR songsang (Attrill et al., 2016). Yang penting, tiada sisipan MiMIC tambahan dikesan dalam lalat ini. Kami seterusnya menguji sama ada uexMI01943 bertanggungjawab terhadap kecacatan ingatan dengan mengalih keluar elemen MiMIC dengan tepat oleh pengasingan pengantaraan transposase Minos (Arca` et al., 1997; Rajah 2— tambahan angka 2A dan B). Pengalihan keluar MiMIC dalam lalat uexMI01943.ex1 dan uexMI01943.ex2 memulihkan prestasi memori 24 jam normal, menunjukkan bahawa sisipan MiMIC diperlukan untuk uexMI01943ingatankecacatan (Rajah 2C).

Kedua-dua qRT-PCR mRNA dan analisis western blot bagi ekstrak protein daripada kepala lalat gagal mendedahkan perbezaan ketara dalam ekspresi uex/UEX dalam lalat uexMI01943. Oleh itu, kami menggunakan CRISPR untuk memperkenalkan kodon henti ke dalam ekson pengekodan kelima lokus uex (Rajah 2B dan Rajah 2—tambahan rajah 2C). Lalat homozigot untuk mutasi uexD yang terhasil tidak berdaya maju sebagai orang dewasa, mati pada peringkat larva. Sebaliknya, lalat uexMI01943/uexD heterozigot berdaya maju, tetapi lalat 24 jamingatantelah terjejas dengan ketara (Rajah 2D). Data ini menunjukkan bahawa uex ialah gen penting dan bahawa uexMI01943 ialah alel hipomorfik uex yang berdaya maju.

Kami juga menguji aversiveingatanprestasi lalat mutan uexMI01943. Lalat uexMI01943 homozigot dipamerkan serta-mertaingatanyang tidak dapat dibezakan daripada kawalan heterozigot dan jenis liar (Rajah 2E). Walau bagaimanapun, ingatan 24 jam mereka, terbentuk berikutan sama ada lima percubaan latihan jarak aversif (Tully et al., 1994; Jacob dan Waddell, 2020), atau satu percubaan latihan yang difasilitasi puasa (Hirano et al., 2013), telah terjejas dengan ketara. (Rajah 2E). Eksperimen ini mencadangkan bahawa lalat uexMI01943 secara amnya terjejas dalam keupayaan mereka untuk membentuk LTM. Melainkan dinyatakan sebaliknya, semua analisis seterusnya bagiingatandalam kajian ini menggunakan pelaziman ganjaran gula berselera.

Rajah 2. lalat mutan uexMI01943 mempunyai kerosakan jangka panjangingatan(LTM). (A) Pengekalan ingatan selera telah diuji pada pelbagai masa selepas latihan. Lalat homozigot untuk uexMI01943 menunjukkan kecacatan yang ketara dalam ingatan dari 12 jam selepas latihan, berbanding dengan prestasi lalat kawalan heterozigot uexMI01943/ plus dan jenis liar (p<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">ingatankecacatan uexMI01943 (m.s<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

Gambar 2 diteruskan

berbanding dengan prestasi heterozigot uexMI01943/ plus dan lalat kawalan jenis liar (p<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">ingatantidak terjejas dalam lalat mutan homozigot uexMI01943.

Versi dalam talian artikel ini termasuk data sumber dan tambahan angka berikut untuk rajah 2:

Data sumber 1. Jadual kawalan ketajaman deria gula dan olfaktori untuk semua eksperimen tingkah laku dalam manuskrip ini.

Tambahan Rajah 1. Pemuliharaan UEX dengan ortolognya.

Tambahan Rajah 2. Skim pembinaan untuk pengasingan uex Mino dan penciptaan alel uexD.