Bahagian 1: Farmakologi Rangkaian Bersepadu Dan Model Ikan Zebra Untuk Menyiasat Komponen Dwi-kesan Cistanche Tubulosa Untuk Merawat Kedua-dua Osteoporosis Dan Penyakit Alzheimer
Mar 30, 2022
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * dan Fei Li 1, 2, *
ABSTRAK
Kaitan etnofarmakologi:Osteoporosis (OP) dan penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit serentak geriatrik yang biasa, dan banyak kajian menunjukkan hubungan patogenesisnya. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) ialah ubat tradisional Cina yang digunakan secara meluas dan telah digunakan secara meluas untuk merawat OP dan AD. Walau bagaimanapun, bahan aktif untuk kedua-dua penyakit serentak secara serentak dan mekanisme asas adalah terhad.
Matlamat kajian:Kerja ini bertujuan untuk mewujudkan kaedah penyaringan rangkaian yang berkesan dan boleh dipercayai untuk mencari sebatian dwi-kesan dalam CT yang boleh melindungi AD dan OP secara serentak. Dan ia akan memberikan perspektif baharu tentang hubungan antara OP dan AD pada mekanisme molekul.
Bahan dan kaedah:Kesan dwi CT dianalisis secara sistematik dengan mengintegrasikan pelbagai pangkalan data dan analisis meluas pada tahap farmakologi rangkaian. Rangkaian interaksi sasaran dadah terkelas telah dibina untuk mendedahkan perbezaan kesan antara pelbagai jenis sebatian. Untuk membuktikan keberkesanan rangkaian ini, beberapa sebatian telah dipilih untuk mengesahkan dalam model OP Pra- teraruh dan model AD teraruh AlCl3-ikan zebra mengikut parameter topologi.
Kata kunci:Farmakologi Rangkaian; Osteoporosis;Penyakit Alzheimer; Cistanche tubulosa; Ikan Zebra.
Cistanche mempunyai fungsi anti-Alzheimer.
1. Pengenalan
Kecenderungan umur penduduk menyebabkan peningkatan prevalens osteoporosis (OP) dan penyakit Alzheimer (AD) selama ini (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Pada masa kini kedua-dua OP dan AD telah diiktiraf sebagai ancaman utama kepada kesihatan awam kerana mereka mungkin berkembang tanpa gejala dan membawa beban sosial yang besar (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Sebagai penyakit berkaitan usia, ia sering dilihat berlaku bersama dalam amalan klinikal dengan kadar hilang upaya dan kematian yang tinggi (Dengler-Crish dan Elefteriou, 2019). OP ialah penyakit rangka sistemik yang dicirikan oleh jisim tulang yang rendah dan seni bina mikro tisu tulang yang terjejas, dengan kerapuhan tulang yang dipertingkatkan dan peningkatan risiko patah tulang (Rizzoli, 2018). AD adalah degenerasi otak yang paling biasa yang dicirikan oleh kehilangan ingatan progresif dan fungsi kognitif lain (Bondi et al., 2017). Sehingga kini, masih tiada pilihan yang cukup berkuasa untuk mencegah atau menyembuhkan kedua-dua penyakit etiologi dan patogenesis kompleks mereka. Dan yang lebih teruk ialah pesakit lebih kerap mengalami kesan sampingan (Brown, 2017; Huang dan Mucke, 2012).
Berdasarkan teori pembezaan sindrom (Sucher, 2013), ubat-ubatan tradisional Cina (TCM) dengan pelbagai komponen yang menyasarkan lebih daripada satu mekanisme patofisiologi mempunyai keunggulan unik dalam rawatan beberapa penyakit kompleks yang biasa. Sebagai herba tonik buah pinggang, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) digunakan secara meluas terhadap kehilangan ingatan dan kelemahan atropik tulang oleh pakar perubatan tradisional Cina (Fu et al., 2018). Selain keberkesanan tradisionalnya, banyak kajian menunjukkan bahawa ia mempunyai pelbagai aktiviti farmakologi, seperti memperbaiki defisit kognitif dan tingkah laku (Wu et al., 2014), anti-radang (Fu et al., 2018), menggalakkan pembentukan tulang, dan menekan tulang. resorpsi (Li et al., 2013; Li et al., 2012), serta aktiviti antioksidan (Zhang et al., 2016). Tetapi kerumitan bahan aktif dan proses metaboliknya menimbulkan kesukaran dalam kedua-dua penerokaan sasaran dalam tisu manusia dan menerangkan mekanisme tindakan.
Di atas semua, perbincangan yang boleh dipercayai mengenai sasaran terapeutik OP/AD adalah perlu. Terutamanya berdasarkan pemikiran "rawatan yang sama untuk penyakit yang berbeza" dalam TCM, dan metodologi "terapeutik berbilang komponen, rangkaian biologi" dalam farmakologi dalam rangkaian, percubaan untuk mencari sasaran umum yang ketara antara kedua-dua penyakit mungkin mempunyai kaedah yang sangat praktikal. bermakna dalam menyediakan panduan untuk pencegahan dan kawalan OP dan AD. Ikan zebra mempunyai persamaan yang kuat dalam fisiologi rangka mereka dengan mamalia dan gen yang sangat homolog dengan manusia. Ia adalah model haiwan yang tersedia dan menarik dalam vivo untuk penyelidikan OP dan AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Oleh itu, penyelidikan farmakologi rangkaian ini bertujuan untuk menyaring konstituen aktif dwi-kesan CT, meneroka sasaran potensi biasa OP dan AD, serta mendedahkan kemungkinan menggunakan CT untuk merawat dua penyakit secara serentak. Dalam kajian ini, maklumat sasaran bahan aktif CT, genom, dan maklumat proteomik OP dan AD masing-masing dikumpulkan daripada pangkalan data yang berbeza untuk mewujudkan rangkaian interaktif, dan analisis pengayaan telah dibina untuk menemui mekanisme sinergistik CT untuk merawat OP dan AD . Tambahan pula, kami masing-masing mendorong model ikan zebra OP dan AD, dan menangkap sebatian utama dalam rangkaian untuk mengesahkan keberkesanan dan sasarannya untuk dua penyakit.
Cistanche meningkatkan pertumbuhan sclerotin.
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1 Reagen
Piawaian kimia genistein (GE), quercetin (QU), asid abietik (AA), -sitosterol (BSS) (ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 98 peratus ) telah dibeli daripada Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Plat kultur diperoleh daripada Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, China). Prednisolone (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O telah dibeli daripada Aladdin Reagent Inc. Zebrafish alkaline phosphatase (ALP), tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), acetylcholinesterase (AChE), dan choline kit acetyltransferase (ChAT) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) telah dibekalkan oleh Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Trizol diperoleh daripada Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, China). Transtar Top Green qPCR SuperMix telah dibeli daripada TransGen Biotech. Co., Ltd. (Beijing, China).
ekstrak cistanche
2.2 Haiwan
Ikan zebra dewasa (tekanan AB, 4 bulan) dikekalkan pada 28 darjah di bawah kitaran cahaya/gelap 14/10 jam dalam akuarium yang dibekalkan dengan pertukaran air tawar. Mereka disimpan dua kali sehari dengan diet udang air garam yang baru menetas (Chen et al., 2018). Embrio yang biasanya disenyawakan dipilih dan dibiakkan hingga 3 hari selepas persenyawaan (dpf) dalam inkubator pertumbuhan ringan. Semua eksperimen haiwan adalah mengikut garis panduan institusi dan kerajaan untuk eksperimen haiwan.
2.3 Proses Farmakologi Rangkaian
2.3.1 Pengiraan Ruang Kimia dan Saringan Sebatian Calon
Semua data bahan kimia CT dikumpulkan dari Pangkalan Data dan Platform Analisis Farmakologi Sistem Perubatan Tradisional Cina. TCMSP ialah platform sistem farmakologi ubat herba Cina yang menangkap hubungan antara ubat, sasaran dan penyakit (Ru et al., 2014). Sementara itu, empat parameter berkaitan farmakologi penting dalam TCMSP telah diperoleh untuk analisis komponen utama (PCA), termasuk berat molekul (MW), pekali sekatan antara oktanol dan air (AlogP), kiraan penderma hidrogen (Hdon), dan kiraan penerima hidrogen ( Hacc). Taburan kimia CT telah dibina dengan parameter di atas menggunakan perisian SIMCA (Versi 14.1, Umetrics). Dan ubat molekul kecil yang diluluskan untuk AD/OP daripada DrugBank telah diproses dalam kursus yang sama. Bahan-bahan daripada CT telah ditapis mengikut keserupaan dadah (DL). DL ialah konsep kualitatif yang digunakan dalam reka bentuk ubat untuk anggaran bagaimana "seperti dadah" sebatian prospektif. Sifat penting ini digunakan sebagai kriteria pemilihan untuk sebatian "seperti ubat" dalam herba tradisional Cina dan ia membantu mengoptimumkan farmakokinetik dan sifat farmaseutikal (Tao et al., 2013). Berdasarkan cadangan dalam literatur dan TCMSP, kami memilih DL Lebih Besar daripada atau sama dengan 0.18 sebagai syarat penapis. Bahan-bahan yang mematuhi syarat telah dieksport untuk analisis seterusnya. Struktur 2-dimensi (2D) dan 3D mereka telah dicat oleh perisian ChemDraw Professional 16.0. Dan struktur 3D telah dioptimumkan oleh fungsi meminimumkan tenaga dalam Chem3D 16.0.
2.3.2 Pengumpulan Sasaran Berkaitan OP dan AD
Semua persatuan gen untuk OP dan AD dikumpulkan secara bebas daripada DisGeNET dan GeneCards. Pangkalan data DisGeNET ialah salah satu platform penemuan gen dan varian terbesar yang tersedia secara umum yang berkaitan dengan penyakit manusia (Pinero et al., 2017). GeneCards ialah pangkalan data bersepadu gen manusia yang merangkumi maklumat genomik, transkriptomi, proteomik, genetik, klinikal dan fungsian (Safran et al., 2010).
2.3.3 Pengumpulan Sasaran Kompaun dan Ramalan Docking Songsang
Pangkalan data GeneCards dan pangkalan data Swiss TargetPrediction telah digabungkan untuk meramalkan sasaran bahan aktif yang berkaitan dalam CT. GeneCards menunjukkan sasaran aktif sebatian yang diketahui, manakala pangkalan data TargetPrediction Swiss boleh menganggarkan sasaran makromolekul yang paling berkemungkinan bagi molekul kecil (Daina et al., 2019). Sebelum ramalan, struktur molekul calon telah ditukar daripada format mol2 kepada format SMILES dengan menggunakan Open Babel (Versi 2.4.1).
2.3.4 Analisis Interaksi Protein-protein
Pangkalan data STRING telah digunakan untuk menemui interaksi antara kumpulan sasaran kongsi CT-OP-AD. Selepas mencari di bawah corak "Homo sapiens", rangkaian interaksi protein-protein (PPI) telah divisualisasikan oleh perisian Cytoscape (Versi 3.7.2). STRING ialah pangkalan data PPI yang diketahui dan diramalkan, yang diperoleh daripada ramalan konteks genomik, eksperimen makmal berkemampuan tinggi, ekspresi bersama (dipelihara), perlombongan teks automatik dan pengetahuan terdahulu dalam pangkalan data (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche baik untuk penyakit Alzheimer.
2.3.5 Analisis Pengayaan Laluan GO dan KEGG
Analisis pengayaan Gene Ontology (GO) dilakukan pada perisian Funrich. FunRich (Versi 3.1.3) ialah perisian berfungsi yang digunakan terutamanya untuk analisis pengayaan gen dan protein (Pathan et al., 2015). Pangkalan data manusia ConsensusPathDB digunakan untuk menjalankan analisis pengayaan laluan. Senarai gen yang diperoleh telah diserahkan kepada pangkalan data dengan tetapan "p-value cutoff" sebagai 0.01. Selepas mendapat keputusan, hanya laluan yang berkaitan dengan OP dan/atau AD ini dipilih dan dibahagikan kepada kumpulan mengikut kategori fungsi KEGG. CPDB ialah rangkaian interaksi lancar yang mengandungi protein-protein binari dan kompleks, genetik, metabolik, isyarat, pengawalseliaan gen, dan interaksi sasaran dadah, serta laluan biokimia dalam Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Prosedur Eksperimen untuk Model OP Zebrafish
2.4.1 Pengumpulan Model
Larva ikan zebra dibahagikan kepada beberapa kumpulan: kumpulan kawalan, kumpulan model, model tambah kumpulan Ed, model tambah kumpulan sebatian, setiap satunya mengandungi 3{1}} larva. Kumpulan kawalan dikekalkan dalam medium dengan 0.2 peratus DMSO. Kumpulan model telah dirawat dengan Pra (25 µM) daripada 3 dpf hingga 8 dpf. Model ditambah kumpulan Ed telah dirawat bersama dengan Pra dan Ed (30 µg/mL).
2.4.2 Pewarnaan Merah Alizarin
Selepas 5 hari kultur dengan sebatian yang berbeza, larva dibius, diperbaiki, dan dilunturkan secara bergilir. Alizarin red digunakan untuk mengotorkan tulang kepala ikan zebra. 1 peratus KOH dan gliserol (nisbah 3:1, 1:1 dan 1:3) digunakan masing-masing untuk membuang lebihan. Akhirnya, stereomikroskop (Olympus SZX16) digunakan untuk menangkap imej pewarnaan ikan zebra di bawah kedudukan meniarap. Kawasan pewarnaan dan ketumpatan optik bersepadu (IOD) telah dikira oleh Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 Penentuan Aktiviti ALP dan TRAP
Larva ikan zebra pada 3 dpf telah disubkultur dalam 6-plat perigi dan diinkubasi dengan Pre dalam keadaan ada atau tiada sebatian selama 5 hari. Kemudian mereka dikumpulkan untuk mengukur aktiviti ALP. Aktiviti ALP ditentukan dengan menggunakan kit ALP ELISA zebrafish berdasarkan protokol pengeluar. Kaedah untuk menilai aktiviti TRAP adalah sama seperti ALP.
2.5 Prosedur Eksperimen untuk Model Ikan Zebra AD
2.5.1 Pengumpulan Model
Larva ikan zebra dibahagikan kepada beberapa kumpulan: kumpulan kawalan, kumpulan model, model tambah kumpulan DPZ, model tambah kumpulan sebatian, setiap satunya mengandungi 30 larva. Kumpulan kawalan dikekalkan dalam medium dengan 0.2 peratus DMSO. Kumpulan model telah dirawat dengan AlCl3 (150 µM, pH 5.8) daripada 3 dpf hingga 6 dpf. Model ditambah kumpulan DPZ telah dirawat bersama dengan AlCl3 dan DPZ (8 μM).
2.5.2 Analisis Tingkah Laku
Selepas 3 hari penghantaran ubat, pergerakan larva direkodkan oleh penganalisis tingkah laku ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Semua eksperimen telah disiapkan dalam 60 minit pada 28˚C, mengandungi 3 kitaran fasa terang/gelap (10 minit setiap satu untuk terang dan gelap). Menurut kaedah dalam laporan sebelumnya, kelajuan purata (AS), perubahan kelajuan (∆S), kadar pemulihan diskinesia (DRR, persamaan a), dan kecekapan tindak balas (RE, persamaan b) dipilih sebagai kecekapan ubat anti-AD indeks penilaian dalam model ini (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/sec)=D / T, DRR ( peratus )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
di mana D ialah jarak pergerakan ikan zebra selama 60 minit, T ialah masa eksperimen.
RE ( peratus )=100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
di mana ∆S ialah perubahan kelajuan ikan zebra dalam kitaran terang/gelap.
2.5.3 Pengukuran Aktiviti AChE dan Chat
Larva ikan zebra pada 3 dpf telah disubkultur dalam 6-plat perigi dan diinkubasi dengan AlCl3 dalam keadaan ada atau tiada sebatian selama 3 hari. Kemudian mereka dikumpulkan untuk aktiviti AChE. Aktiviti AChE dikesan dengan menggunakan kit AChE ELISA ikan zebra berdasarkan protokol pengeluar. Kaedah untuk menilai aktiviti ChAT adalah sama seperti AChE.
2.6 Analisis PCR Masa Nyata Kuantitatif
Larva ikan zebra dibahagikan kepada kumpulan OP dan AD. Kumpulan OP terdiri daripada kumpulan kawalan, kumpulan Pra, dan kumpulan sebatian Pra tambah, dikultur dari 3 dpf hingga 8 dpf. Kumpulan AD termasuk kumpulan kawalan, kumpulan AlCl3, dan kumpulan sebatian AlCl3 ditambah, dibiakkan dari 3 dpf hingga 5 dpf. Setiap kumpulan mengandungi 30 larva. Jumlah RNA masing-masing diekstrak daripada sampel larva ikan zebra ini oleh Trizol. Sampel RNA telah ditranskripsikan secara terbalik kepada cDNA mengikut arahan pengeluar kit cDNA. Tahap ekspresi mRNA dikesan oleh PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata (Roche LightCycler96). Keputusan telah dinormalkan kepada ungkapan -aktin dan dikira dengan kaedah perbandingan (2−∆∆Ct). Primer hadapan dan belakang yang digunakan telah disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, China) dan disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1.
cistanche dan serbuk Tongkat alimembantu meningkatkan imuniti.
Untuk maklumat lanjut, sila klik di sini.
2.7 Analisis Statistik
GraphPad Prism versi 8.00 telah digunakan untuk analisis statistik deskriptif. Data dinyatakan sebagai min ± SD dan dianalisis dengan kaedah ANOVA untuk menguji kebolehubahan antara setiap percubaan dengan mengambil kira P Kurang daripada atau sama dengan 0.05 sebagai signifikan.
