Bahagian 1|Ekstrak Herba Cistanche Meningkatkan Penjanaan ATP Mitokondria dalam Hati Tikus Dan Sel H9c2

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung dan Kam Ming Ko

Jabatan Biokimia, Universiti Sains & Teknologi Hong Kong, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, China

Kata kunci: ATP,Cistanche deserticola, sel H9c2, jantung, mitokondria

Abstrak

Untuk menyiasat asas farmakologi "Yang- menyegarkan" tindakan Herbal Cistanche [seluruh tumbuhan keringCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], dalam perubatan Cina, kesan ekstrak metanol Herba Cistanche pada kapasiti penjanaan ATP mitokondria telah diperiksa menggunakan model jantung tikus ex vivo dan ujian sel H9c2 in situ. Rawatan dengan ekstrak Herba Cistanche meningkatkan kapasiti penjanaan ATP miokardium miokardium dalam cara yang bergantung kepada dos pada tikus, seperti yang dinilai oleh pengukuran in vitro. Rangsangan kapasiti penjanaan ATP dikaitkan dengan peningkatan selari dalam pengangkutan elektron mitokondria yang disokong oleh piruvat tetapi bukan suksinat. Rawatan Herba Cistanche juga meningkatkan aktiviti kompleks miokardium mitokondria I dan kompleks III, dengan tahap rangsangan pada aktiviti kompleks I menjadi lebih besar. Rawatan Herba Cistanche menghasilkan peningkatan dos dan masa yang bergantung kepada kapasiti penjanaan ATP mitokondria dalam sel H9c2. Hasilnya menunjukkan bahawa rawatan Herba Cistanche bolehmeningkatkan penjanaan ATP mitokondriadalam hati tikus ex vivo dan sel H9c2 in situ, mungkin melaluimeningkatkan fosforilasi oksidatif.

Cistanche boleh meningkatkan fungsi jantung, menurunkan tekanan darah, dan menurunkan lipid darah

pengenalan

"Yang invigoration," yang merangkumi peningkatan umum fungsi badan dalam perubatan Cina, melibatkan penggunaan tenaga dalam memacu pelbagai proses biokimia.

Dalam hal ini, ATP, yang merupakan mata wang universal tenaga dalam menyemarakkan fungsi selular, dijana terutamanya melalui fosforilasi oksidatif dalam mitokondria. Kami telah menyatakan bahawa herba "Yang mencergaskan".mempunyai keupayaan untuk meningkatkan kapasiti penjanaan ATP mitokondria(Ko et al., 2004). Ini disokong oleh penemuan kami baru-baru ini bahawa herba tonifikasi Cina "Yang-mencergaskan" tetapi tidak "berkhasiat Yin" boleh meningkatkan kapasiti penjanaan ATP miokardium dalam hati tikus ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, tumbuhan parasit keseluruhan kering (tidak termasuk bunga) Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), dikelaskan sebagai'Herba tonifying Yang-invigorating' dalam perubatan tradisional Cina (Chen, 1998), dan ia muncul sebagai ramuan paling popular dalam beberapa formulasi paten Cina yang digunakan untuk Yang-invigoration'. Di China dan Jepun, Herba Cistanche digunakan secara meluas untuk rawatan pelbagai gejala kekurangan Yang. Kajian farmakologi menunjukkan bahawa Herba Cistanche bolehmenghilangkan radikal bebas(Xiong et al., 1996),menghasilkan sedatif(Lu, 1998),anti penuaan(Lee et al., 1990),kesan antinociceptive dan anti-radang(Lin et al., 2002), danmeningkatkan fungsi imun(Wu et al., 2005). Bahan aktif utama Herba Cistanche ialahglikosida fenilethanoid(Ouyang et al., 2003), yang didapati mempunyaiantibakteria, antistress, dan antioksidasifat (Xiong et al., 1998), serta kesan anti-apoptosis pada neuron berbudaya (Tian & Pu, 2005). Dalam kajian semasa, untuk menyiasat asas farmakologi tindakan Herba Cistanche yang mencergaskan Yang, kesan rawatan Herba Cistanche pada kapasiti penjanaan ATP dalam mitokondria yang diasingkan daripada hati tikus ex vivo dan kardiomiosit H9c2 berbudaya in situ telah diperiksa. Untuk meneroka mekanisme biokimia yang mendasari tindakan peningkatan penjanaan ATP, kesan rawatan Herba Cistanche pada pengangkutan elektron mitokondria dan aktiviti I-IV yang kompleks juga diperiksa dalam hati tikus.

Bahan-bahan berkesan Cistanche boleh menghilangkan pelbagai radikal bebas oksigen aktif

Bahan dan Kaedah

Bahan kimia, kultur sel dan bahan herba

ATP, ADP dan 3-[4,5-dimethylthiozol-2-yl]-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) telah dibeli daripada Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Penyelesaian Luciferase (ATPlite) diperoleh daripada PerkinElmer (Boston, MA, USA). Medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM) dan serum bovine fetal (FBS) telah dibeli daripada GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Talian sel H9c2 telah dibeli daripada ATTC (Rockville, MD, Amerika Syarikat). Herba Cistanche dibekalkan oleh peniaga herba tempatan (Lee Hoong Kee). Herba itu telah disahkan oleh pembekal, dan spesimen baucar (HKUSTY00301) telah disimpan di Jabatan Biokimia, Universiti Sains & Teknologi Hong Kong (HKUST).

Perahan herba

Herba Cistanche (100g) dipotong menjadi kepingan kecil dan kemudian diekstrak dengan memanaskan di bawah refluks dalam 300 mL metanol pada 65◦C selama 2 jam. Prosedur itu diulang dua kali. Ekstrak terkumpul telah dikeringkan dengan menyejat pelarut di bawah tekanan yang dikurangkan, dan ekstrak metanol Herba Cistanche diperoleh pada hasil 39 peratus (b/b). Analisis kimia menunjukkan bahawa ekstrak metanol Herba Cistanche mengandungi jumlah saponin, jumlah flavonoid, jumlah lignan, dan polisakarida masing-masing pada kepekatan 1.62 peratus (b/b), 0.08 peratus, 0.15 peratus, dan 75.6 peratus.

Penjagaan haiwan

Tikus Sprague-Dawley jantan dewasa (8–10 minggu; 250–300g) dikekalkan di bawah 12-h kitaran gelap/cahaya dalam bilik terkawal udara/kelembapan pada suhu kira-kira 22◦C dan membenarkan makanan dan air secara ad libitum di Kemudahan Penjagaan Haiwan di HKUST. Protokol eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Amalan Penyelidikan di HKUST.

Rawatan dadah

Haiwan dibahagikan secara rawak kepada kumpulan, dengan lima hingga enam haiwan dalam setiap satu. Dalam kumpulan rawatan, tikus diberikan secara intragastrik dengan ekstrak metanol Herba Cistanche (dilarutkan/digantung dalam air) pada peningkatan dos harian ({{0}}.031–0.5 g/kg) selama 3 hari. Haiwan kawalan menerima air sahaja. Dua puluh empat jam selepas dos terakhir, jantung diperoleh daripada haiwan phenobarbital-bius dan tertakluk kepada analisis biokimia.

Penyediaan pecahan mitokondria dan pengukuran kapasiti penjanaan ATP (ATP-GC) ex vivo

Sampel tisu ventrikel kiri jantung telah dipotong dan dibilas dengan penimbal isotonik sejuk ais (0.32 M sukrosa, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7.4). Fraksi mitokondria jantung telah disediakan dengan sentrifugasi pembezaan dalam penimbal isotonik pada 4◦C. Homogenat jantung 10 peratus (w/v) telah disediakan dengan menghomogenkan tisu ventrikel cincang dengan homogenizer kaca Teflon pada 4000 rpm untuk 20-30 pukulan lengkap. Homogenat telah disentrifugasi pada 600 × g selama 10 minit untuk mengeluarkan nukleus dan serpihan sel. Supernatan itu kemudiannya disentrifugasi pada 8000 × g selama 30 minit untuk mengendapkan mitokondria (Evan, 1992). Pelet digantung semula dalam 1 mL penimbal isotonik dan membentuk semula pecahan mitokondria. ATP-GC mitokondria haiwan yang tidak dirawat diukur dengan kaedah Leung et al. (2005)

Polisakarida cistanche boleh melambatkan kemerosotan fisiologi organ dan kemerosotan morfologi sel

Pengukuran pengangkutan elektron mitokondria

Pengukuran pengangkutan elektron dalam mitokondria terpencil, yang berdasarkan pengurangan MTT, seperti [1] yang dibentuk seperti yang diterangkan oleh Cohen et al. (1997). Mitokondria disediakan pada kepekatan protein 1 mg/mL dengan penimbal pengeraman (25{16}} mM sukrosa, 5{18}} mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4) . Satu aliquot (40 µL) mitokondria dicampur dengan 100 µL setiap satu daripada 15 mM piruvat atau 0.5 mM suksinat dan 0.42 mg/mL MTT. Campuran tindak balas telah diinkubasi pada suhu 37◦C selama 10 minit dengan goncangan lembut. Selepas pengeraman, campuran tindak balas ditamatkan dengan penambahan 100 µL penimbal lisis (10 peratus , b/v, natrium dodesil sulfat, dan 45 peratus dimetilformamida, diselaraskan kepada pH 4.7 dengan asid asetik glasier). Selepas berdiri selama 5 minit, bacaan penyerapan campuran tindak balas diambil dengan pembaca plat mikrotiter (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat) dan dilaporkan sebagai perbezaan antara 570 nm dan 630 nm. Data dinyatakan sebagai peratusan nilai min bagi kumpulan kawalan (iaitu, Herba Cistanche-tidak dirawat).

Kultur sel

Sel H9c2, garisan sel kekal yang diperoleh daripada myoblast jantung (Hescheler et al., 1991), telah dibiakkan sebagai monolayers dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus (v/v) FBS. Medium mengandungi glukosa (4.5 g/L) dan glutamin (4.5 mM), ditambah dengan NaHCO3 (17 mM), penisilin (100 IU/mL), dan streptomycin (100µg/mL). Semua sel telah ditanam di bawah atmosfera 5 peratus (v/v) CO2 di udara pada suhu 37◦C. Medium digantikan dengan medium segar setiap 2 atau 3 hari. Stok sel telah ditanam dalam kelalang kultur 75 cm2 dan dibelah sebelum bercantum pada nisbah subkultur 1:10. Untuk ujian ATP-GC, sel H9c2 telah disemai pada ketumpatan 2.5 × 104 sel/telaga ke dalam 24-plat perigi. Selepas lampiran sel, ekstrak Herba Cistanche (larut dalam garam penampan fosfat; PBS) digunakan dalam medium, dan sel-sel diinkubasi untuk tempoh yang semakin meningkat (2-16 jam) masa. Sel kawalan (tidak dirawat) diberi PBS sahaja.

Pengukuran ATP-GC in situ

Selepas tempoh pengeraman yang dinyatakan dengan ekstrak HerbaCistanche pada kepekatan meningkat (5{{10}}–300µg/mL), ujian ATP-GC telah dilakukan. Medium telah disedut dan sel telah dirawat dengan digitonin (50µg/mL) dalam penimbal inkubasi (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0.1 mM MgCl2,0.5 peratus BSA, pH 7.4) selama 373 minit ◦C. Selepas menyedut digitonin, glutamat (5 mM), malat (5 mM), dan ADP (60μM) telah ditambah kepada sel untuk penjanaan ATP mitokondria, yang dipantau pada selang masa yang semakin meningkat antara 0 hingga 15 minit. Tindak balas telah ditamatkan dengan penambahan 60 µL asid perklorik (30 peratus , w/v), dan campuran tindak balas kemudiannya disentrifugasi pada 600 × g selama 10 minit pada 4◦C. Satu aliquot (120 µL) supernatan telah dicampur dengan 90 µL 1.4 M KHCO3 untuk peneutralan. Campuran telah disentrifugasi sekali lagi pada 600 × g pada 4◦C, dan supernatan diukur untuk kandungan ATP seperti yang dinyatakan sebelum ini. ATP-GC bagi sel yang tidak dirawat dianggarkan dengan mengira kawasan di bawah lengkung graf (AUC1) yang memplot ATP yang dijana (protein nmol/mg) melawan masa (0-15 min) dan dinyatakan dalam unit sewenang-wenangnya. Untuk sel yang dirawat HerbaCistanche, nilai AUC1 bagi meningkatkan masa inkubasi (3, 5, 7, 10, dan 15 min) telah dinormalisasi kepada nilai kawalan min masing-masing daripada sampel yang tidak dirawat dan dinyatakan sebagai kawalan peratus. Kemudian, kawasan di bawah lengkung (AUC2) graf yang memplot nilai kawalan peratus terhadap masa pengeraman (3-15 min) telah dikira dan dinyatakan dalam unit sewenang-wenangnya. Data kumpulan yang dirawat Herba Cistanche dinyatakan sebagai peratusan kawalan daripada persamaan:

[AUC2(HerbaCistanche − dirawat)/AUC2(tidak dirawat)]×100 peratus

Pengukuran kompleks I–IV dan sintaseaktiviti sitrat

Aktiviti rantai pengangkutan elektron (ETC) kompleks I-III mitokondria diukur dengan kaedah spektrofotometri menggunakan substrat khusus kompleks (NADH untuk kompleksI, suksinat untuk kompleks II, dan decylubiquinol untuk kompleksIII) seperti yang diterangkan (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005;Mark et al., 2001). Aktiviti IV kompleks diukur menggunakan kit ujian cytochrome c oxidase dari Sigma. Aktiviti sintase sitrat mitokondria diukur dengan kaedah Srere (1969).

Ujian protein

Kepekatan protein pecahan mitokondria dan sellisat ditentukan menggunakan ujian protein BioRad menggunakan albumin serum lembu sebagai piawai ({{0}}.038–0.600mg/mL).

Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai min ± ralat standard bagi min (SEM). Mereka dianalisis dengan analisis varians sehala (ANOVA). Perbandingan berbilang post hoc telah dilakukan dengan LSD. nilai P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Keputusan

Kesan rawatan Herba Cistanche pada miokardium mitokondria ATP-GC dalam tikus

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, rawatan dengan ekstrak Herba Cistanche pada dos sehingga 0.5 g/kg meningkatkan ATP-GC miokardium miokardium dalam cara yang bergantung kepada dos pada tikus, dengan tahap rangsangan ialah 89 peratus pada dos daripada 0.5 g/kg.

Kesan rawatan Herba Cistanche pada pengangkutan elektron mitokondria dalam hati tikus

Tahap pengangkutan elektron dalam mitokondria terpencil diukur dengan memantau pengurangan MTT. Substrat yang digunakan untuk ujian adalah sama ada piruvat atau suksinat.

Rajah 1. Kesan rawatan Herba Cistanche terhadap kapasiti penjanaan ATP mitokondria dalam hati tikus ex vivo

Setiap bar mewakili tema ± SEM, dengan n {{0}}. Haiwan dirawat secara lisan dengan HerbaCistanche pada dos harian yang ditunjukkan selama 3 hari. Kapasiti penjanaan ATP diukur seperti yang diterangkan dalam "Bahan dan Kaedah." Data dinyatakan dalam peratus kawalan berkenaan dengan nilai (AUC2) bagi kumpulan kawalan yang tidak dirawat masing-masing. ∗Sangat berbeza daripada kumpulan kawalan masing-masing yang tidak dirawat; jauh berbeza daripada kumpulan yang dirawat Herba Cistanche pada 0.5 g/kg.

Rajah 2. Kesan rawatan Herba Cistanche terhadap pengangkutan elektron mitokondria dalam hati tikus

Setiap bar mewakili min ± SEM, dengan n {{0}}. (a) Pengangkutan elektron mitokondria yang disokong piruvat (b) yang disokong suksinat diukur dengan pengurangan MTT, seperti yang diterangkan dalam "Bahan dan Kaedah." Data dinyatakan dalam peratusan nilai kawalan yang dirawat [disokong piruvat: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0.0001 (SEM), n {{ 10}}; disokong suksinat: lelaki, 0.255 ±0.015, n=5]. ∗Sangat berbeza daripada kumpulan kawalan yang tidak dirawat; berbeza dengan ketara daripada kumpulan 0.5 g/kg.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a, rawatan Herba Cistanche bergantung kepada dos meningkatkan tahap pengangkutan elektron mitokondria yang disokong oleh piruvat dalam hati tikus, dengan rangsangan optimum yang boleh diperhatikan pada dos 0.5 g/kg. Bagaimanapun, tiada perubahan ketara dalam tahap pengangkutan elektron mitokondria yang disokong oleh suksinat dikesan dalam hati tikus yang dirawat Herba Cistanche (Rajah 2b).

Untuk Bahagian 2,sila klik di sini.