BAHAGIAN 1 Echinacoside Menggerakkan Vasorelaksasi Arteri Pulmonari Tikus Dengan Membuka Saluran NO-cGMP-PKG-BKCa Dan Mengurangkan Tahap Ca2 plus Intraselular

Bagaimanakah echinacoside mendorong kelonggaran vena?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Jabatan Farmakologi, Pusat Pengajian Sains Hayat dan Biofarmaseutik, Universiti Farmaseutikal Shenyang, Shenyang 110016, China; 2 Pusat Penyelidikan Perubatan Altitud Tinggi, Kolej Perubatan Universiti Qinghai, Xining 810001, China; 3 Pusat Pengajian Farmasi, Universiti Qinghai untuk Warganegara, Xining 810007, China; 4 Biro Pemeriksaan Keluar Masuk Qinghai dan Kuarantin, Xining 810001, China

Matlamat:Vasokonstriksi pulmonari yang berterusan seperti yang dialami pada altitud tinggi boleh menyebabkan hipertensi pulmonari (PH). Tujuan utama kajian ini adalah untuk menyiasat kesan vasorelaxant daripadaechinacoside(ECH), glikosida phenylethanoid daripada herba Tibet Lagotis brevituba Maxim danCistanche tubulosa, pada arteri pulmonari dan mekanisme potensinya.

Kaedah:Cincin arteri pulmonari yang diperoleh daripada tikus Wistar jantan digantung di dalam ruang organ yang diisi dengan larutan Krebs-Henseleit, dan ketegangan isometrik diukur menggunakan transduser daya. Paras Ca2 tambah intraselular diukur dalam sel otot licin arteri paru-paru tikus berkultur (PASMC) menggunakan Fluo 4-AM.

Keputusan: ECH(30–300 μmol/L) mengendurkan arteri pulmonari tikus yang diprakontrakkan oleh noradrenalin (NE) dalam cara yang bergantung kepada kepekatan, dan kesan ini boleh diperhatikan dalam kedua-dua cincin endothelium dan endothelium-denuded utuh, tetapi dengan tindak balas maksimum yang jauh lebih rendah dan EC50 yang lebih tinggi dalam cincin berlubang endothelium. Kesan ini telah disekat dengan ketara oleh L-NAME, TEA, dan BaCl2. Walau bagaimanapun, IMT, 4-AP dan Gli tidak menghalangECH-kelonggaran yang disebabkan. Di bawah keadaan bebas Ca2 tambah ekstraselular, penguncupan maksimum dikurangkan kepada 24.54 peratus ±2.97 peratus dan 10.60 peratus ±2.07 peratus dalam gelang yang dirawat dengan 100 dan 300 μmol/L ECH, masing-masing. Di bawah keadaan kemasukan kalsium ekstraselular, pengecutan maksimum dikurangkan kepada 112.42 peratus ±7.30 peratus , 100.29 peratus ±8.66 peratus dan 74.74 peratus ±4.95 peratus dalam gelang yang dirawat dengan 30, 100, dan 300 μmol/L ECH, masing-masing. Selepas sel dimuatkan dengan Fluo 4-AM, purata intensiti pendarfluor adalah lebih rendah dalam sel yang dirawat denganECH(100 μmol/L) berbanding dengan NE.

Kesimpulan: ECHmenekan pengecutan arteri pulmonari tikus yang disebabkan oleh NE melalui mengurangkan tahap Ca2 plus intraselular, dan mendorong kelonggarannya melalui laluan NO-cGMP dan pembukaan saluran K plus (BKCa dan KIR).

Kata kunci:herba Tibet;echinacoside; hipertensi pulmonari; altitud yang tinggi; vasorelaksasi; TIDAK; BKCa; KIR; cincin arteri; sel otot licin arteri pulmonari.

Untuk maklumat lanjut sila hubungi:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola mempunyai banyak kesan, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

pengenalan

Vasokonstriksi pulmonari yang berterusan seperti yang dialami pada ketinggian tinggi boleh menyebabkan hipertensi pulmonari (PH) dan hipertrofi medial[1], yang telah dikenal pasti sebagai punca utama hipertrofi ventrikel kanan dan kegagalan jantung[2]. Individu yang tinggal di altitud tinggi, sama ada sementara atau kekal, mungkin mengalami hipertensi pulmonari ringan hingga sederhana, dan mereka yang lebih terdedah kepada hipoksia mungkin mengalami vasokonstriksi pulmonari yang berlebihan, yang membawa kepada pelbagai penyakit ketinggian tinggi yang dikaitkan dengan morbiditi dan kematian yang ketara, seperti edema pulmonari ketinggian tinggi dan penyakit jantung[3].Echinacoside(ECH) (Rajah 1) ialah aphenylethanoid glycosideterdapat dalam pelbagai jenis herba Cina seperti herba Tibet Lagotis brevituba Maxim danCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim ialah spesies Lagotis spp kepunyaan Scrophulariaceae dan tumbuh secara meluas pada ketinggian lebih 3000 meter di Dataran Tinggi Qinghai-Tibet.ECHmempunyai pelbagai ciri farmakologi yang diingini, seperti sifat antioksidatif, anti-radang, neuroprotektif, hepatoprotektif, dan oksida nitrik (NO) radikal [6]. Ia juga boleh menimbulkan kelonggaran yang bergantung kepada endothelium dalam cincin aorta toraks tikus dan menyembuhkan penyakit kardiovaskular [7]. Walau bagaimanapun, sepanjang pengetahuan kami, belum ada kajian yang menyiasat kesannya terhadap nada vaskular dalam arteri pulmonari. Tujuan kajian ini adalah seperti berikut: (1) untuk meneroka sama ada ECH mendorong in vitro vasorelaxation dalam arteri pulmonari tikus yang diprakontrakkan dengan noradrenalin (NE), dan sama ada kesan ini, jika ada, bergantung kepada endothelium atau bertindak secara langsung ke atas otot licin vaskular. ; (2) untuk menyiasat kesan ECH pada kemasukan kalsium ekstraselular dan pelepasan kalsium intrasel dalam sel otot licin arteri paru-paru tikus (PASMC); dan (3) untuk mengenal pasti laluan yang mungkin dan saluran K tambah yang terlibat dalam kelonggaran akibat ECH.

Bahan dan kaedah

Reagen

ECH telah disediakan oleh Dr. Peng-fei TU dari Universiti Peking (Beijing, China), dengan ketulenan lebih daripada 98 peratus seperti yang ditentukan oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi. Dimetil sulfoksida (DMSO) telah dibeli daripada Solar Science & Technology Co, Ltd (Beijing, China); NE, asetilkolin (ACh, Lebih besar daripada atau sama dengan 99 peratus ), indometasin (IMT), Nω -Nitro-L-arginine metil ester hidroklorida (L-NAME), tetraetilammonium klorida (TEA), barium klorida (BaCl2), {{ 9}}aminopyridine ({{10}}AP), dan glibenclamide (Gli) daripada Sigma Chemical Co (St Louis, MO, Amerika Syarikat); medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (DMEM), serum lembu janin (FBS), dan trypsin daripada Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, USA) dengan glukosa tinggi. antibodi aktin otot licin primer anti-tikus (-SMA) dan antibodi sekunder anti-tikus kambing daripada Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, China); Penunjuk Kalsium Fluo (Fluo 4-AM) daripada Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, Amerika Syarikat); dan semua garam tak organik daripada Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Beijing, China). IMT telah dibubarkan dalam DMSO dan 5 peratus NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM dan ECH telah dilarutkan dalam DMSO dan semua reagen lain telah dilarutkan dalam larutan Krebs-Henseleit (KH) atau PBS. Eksperimen awal menunjukkan bahawa DMSO kurang daripada 0.1 peratus (v/v) tidak mempunyai kesan ke atas perkembangan ketegangan cincin arteri pulmonari terpencil.

Haiwan eksperimen

Semua prosedur dan protokol telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Kolej Perubatan Universiti Qinghai. Tikus Wistar jantan, berumur 6–8 minggu, berat badan 250–300 g, dibeli dari Pusat Haiwan Universiti Lanzhou (Lanzhou, China) dan dikekalkan mengikut diet makmal standard dan air paip secara ad libitum pada suhu ambien 22± 2 darjah dan kelembapan relatif 45 peratus –55 peratus sepanjang eksperimen.

Perfusi arteri pulmonari in vitro

Penyediaan cincin arteri pulmonari tikus

Tikus seberat 250–300 g telah dibius dengan suntikan intraperitoneal natrium pentobarbital (40 mg/kg), dan kemudian jantung dan paru-paru mereka dikeluarkan dan direndam serta-merta dalam larutan KH sejuk ais yang mengandungi (dalam mmol/L) : 118 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4·7H2O, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, dan 11.1 glukosa (pH 7.4). Arteri intrapulmonari (diameter 0.7–1.5 mm) dibedah bebas daripada tisu penghubung di sekeliling dan adventitia dan kemudian dipotong menjadi cincin dengan panjang kira-kira 2–3 mm. Cincin itu digantung di dalam ruang organ yang diisi dengan 10 mL larutan KH pada 37 darjah dan digas dengan 95 peratus O2–5 peratus CO2 [8], dan ketegangan isometrik diukur menggunakan transduser daya (JH-2, Space Medico -Institut Kejuruteraan, Beijing, China)

Penilaian aktiviti cincin kapal dan penilaian fungsi endothelial

Cincin kapal dibenarkan untuk mengimbangi selama 2 jam di bawah ketegangan basal 400 mg, pada masa itu larutan KH ditukar setiap 15 minit; kemudian 1 μmol/L NE ditambah ke dalam ruang untuk menilai aktiviti setiap gelang dengan mengesan peratusan penguncupan. Sebelum dan selepas protokol eksperimen, peratusan penguncupan diukur (Rajah 2A dan 2B). Endothelium dibuang dalam beberapa gelang dengan menggosok permukaan intimal dengan wayar keluli halus, dan integriti dinilai secara kualitatif oleh tahap kelonggaran yang disebabkan oleh ACh (10 μmol/L) dalam peratusan nada kontraktil yang disebabkan oleh NE (1). μmol/L). Jika kelonggaran dengan ACh lebih besar daripada 80 peratus , endothelium kekal dalam keadaan baik; jika kelonggaran kurang daripada 30 peratus, endothelium telah musnah (Rajah 2A dan 2B)[9].

Pengasingan dan budaya PASMC tikus

Arteri pulmonari distal telah diasingkan daripada lobus pulmonari tikus, dan endothelium dan adventitia dikeluarkan dengan berhati-hati. Selepas tisu dicincang menjadi kepingan {{0}}mm, ia dimasukkan ke dalam kelalang serta-merta, dikekalkan pada 37 darjah dan 5 peratus CO2 dalam inkubator lembap selama lebih kurang empat jam, dan kemudian dikultur dengan DMEM glukosa tinggi ditambah dengan 20 peratus FBS, 100 U/mL penisilin, dan 100 U/mL streptomycin selama lebih kurang lima hari. Separuh daripada media kultur digantikan dengan media segar apabila sel muncul. Apabila sel mencapai 80 peratus pertemuan, mereka dituai dengan 0.125 peratus tripsin dan disemai ke dalam kelalang (nisbah 1:2) yang mengandungi DMEM glukosa tinggi ditambah dengan 10 peratus FBS, 100 U/mL penisilin, dan 100 U/mL streptomycin . Sel dengan tiga hingga lapan petikan digunakan untuk semua eksperimen.

Pengenalpastian PASMC oleh imunohistokimia

PASMC positif untuk pewarnaan imunokimia apabila ciri "bukit dan lembah" yang tipikal diperhatikan. Sel telah disemai dalam 6-plat perigi dengan penutup kaca. Apabila sel mencapai 80 peratus pertemuan, ia difiksasi dalam 4 peratus paraformaldehid, disekat dengan 3 peratus hidrogen peroksida selama 15 minit, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer anti tikus tikus -SMA semalaman pada 4 darjah . Selepas dibasuh tiga kali dalam PBS selama 10 minit, sel diinkubasi dengan antibodi sekunder anti-tikus kambing pada suhu bilik selama 45 minit, dibasuh semula tiga kali dalam PBS selama 10 minit, dan divisualisasikan dengan diaminobenzidine.

Pengesanan kepekatan kalsium intraselular dalam PASMC tikus

PASMC telah disemai dalam {{0}}plat perigi dengan penutup kaca. Apabila sel mencapai 8{18}} peratus pertemuan, media kultur digantikan dengan DMEM tanpa serum. Dua puluh empat jam kemudian, sel telah dimuatkan dengan 7 μmol/L Fluo 4-AM pada 37 darjah selama 30 min dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2. Sisa pewarna telah dibasuh dengan larutan Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) yang mengandungi yang berikut (dalam mmol/L): 1.26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5.33 KCl, 0.44 KH2PO4, 4.17 NaHCO3, 137.93 NaCl, 0.34 Na2HPO4, dan 5.56 D-Glucose, tanpa merah fenol. Sel yang dimuatkan dengan Fluo 4-AM telah terdedah kepada satu daripada tiga keadaan rawatan: (1) kumpulan kawalan (kumpulan con), di mana sel diinkubasi dengan DMEM tanpa serum; (2) kumpulan NE, di mana sel diinkubasi dengan DMEM bebas serum ditambah dengan 1 μmol/L NE selama 10 minit; dan (3) kumpulan NE ditambah ECH (100 μmol/L) (kumpulan NE ditambah ECH100), di mana sel diinkubasi dengan DMEM bebas serum ditambah dengan 1 μmol/L NE selama 10 minit dan 100 μmol/L ECH selama 20 min. Keamatan pendarfluor diperhatikan dan difoto oleh mikroskop pendarfluor (IX71, Olympus, Tokyo, Jepun)[11]. Enam bidang penglihatan (200×) dikumpulkan untuk setiap sampel. Kepekatan kalsium intraselular dikira dengan mengukur keamatan pendarfluor purata menggunakan perisian Image Pro-Plus 6.0.

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai min ± SD. Apabila perbezaan ketara yang sesuai dinilai oleh ujian Dunnett atau ujian Student-Newman-Keuls untuk pelbagai perbandingan selepas analisis varians sehala (ANOVA). Tahap kebarangkalian P<0.05 was="" considered="">

Keputusan Kesan vasorelaxant ECH pada arteri pulmonari terpencil

Pada permulaan eksperimen, penambahan kumulatif ECH dari 30 hingga 300 μmol/L tidak mempunyai kesan yang ketara pada ketegangan basal arteri pulmonari. Selepas vasokonstriksi yang disebabkan oleh NE mencapai dataran tinggi, ECH ditambah secara kumulatif (30-300 μmol / L) kepada endothelium utuh (E tambah, Rajah 2C) atau cincin terlucut endothelium (E-, Rajah 2C). Dalam cincin endothelium yang utuh, penambahan kumulatif ECH melebarkan pembuluh darah dengan cara yang bergantung kepada kepekatan, dengan maksimum

peratusan kelonggaran ibu sebanyak 89.22 peratus ±0.32 peratus pada 300 μmol/L dan EC50 sebanyak 51.60±0.57 μmol/L (Rajah 2A dan 2C). Begitu juga, dalam gelang terlucut endothelium, ECH juga melebarkan saluran dalam cara yang bergantung kepada kepekatan, tetapi dengan tindak balas maksimum yang jauh lebih rendah iaitu 67.72 peratus ±1.69 peratus (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Kesan ECH pada pelepasan kalsium intraselular dan kemasukan kalsium ekstraselular

Cincin berlubang endothelium terdedah kepada 1 μmol/L NE sehingga penguncupan maksimum dicapai. Di bawah keadaan bebas Ca2 tambah ekstraselular, gelang telah diseimbangkan dalam larutan KH bebas Ca2 tambah yang mengandungi 0.2 mmol/L EGTA sebelum permulaan eksperimen. Selepas tiga kali cucian dengan Ca2 plus - dan larutan KH bebas EGTA, gelang telah diinkubasi dengan ECH (30, 100, dan 300 μmol/L) selama 20 minit dan kemudian didedahkan semula kepada 1 μmol/L NE. Cincin yang dihasilkan

penguncupan yang tidak berterusan yang kembali dengan pantas ke garis dasar, berbanding dengan penguncupan awal yang disebabkan oleh NE, yang berfungsi sebagai rujukan. Penguncupan maksimum kawalan ialah 33.27 peratus ±2.94 peratus (Rajah 3A dan 3E) tetapi telah dikurangkan dengan ketara kepada 24.54 peratus ±2.97 peratus dan 10.60 peratus ±2.07 peratus dalam gelang yang diprarawat dengan 100 dan 300 μmol/L ECH, masing-masing.<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Peranan perencat yang berbeza dalam vasorelaxation arteri pulmonari tikus yang disebabkan oleh ECH

Vasorelaxation arteri pulmonari tikus yang disebabkan oleh ECH telah disiasat dengan kehadiran atau ketiadaan perencat berikut: L-NAME (enhibitor eNOS), IMT (inhibitor siklooksigenase), TEA (Ca2 konduktans besar ditambah -diaktifkan perencat saluran K ditambah), BaCl2 ( penerus masuk K tambah perencat saluran), 4-AP (bergantung voltan K tambah perencat saluran) dan Gli (ATP sensitif K tambah perencat saluran). Cincin telah dikontrak secara maksimum dengan 1 μmol/L NE, dan kemudian L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L), atau Gli (10 μmol/L) telah ditambah, masing-masing. Setelah dataran tinggi baru dicapai, ECH ditambah secara kumulatif dari 30 hingga 300 μmol/L. Lengkung kepekatan-tindak balas dengan kehadiran perencat yang berbeza ditunjukkan dalam Rajah 4. Kesan vasorelaxant ECH pada cincin arteri pulmonari yang mengecut dengan 1 μmol/L NE telah disekat dengan ketara oleh L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L), dan BaCl2 (1 mmol/L), dengan kelonggaran maksimum masing-masing 64.41 peratus ±3.20 peratus , 84.38 peratus ±0.70 peratus dan 75.27 peratus ±0.93 peratus (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Pengenalpastian PASMC tikus

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 peratus ) (Rajah 6A). Myofilamen berwarna coklat jelas diperhatikan dalam sitoplasma pada pembesaran tinggi (Rajah 6B).

Cistancheechinacosideboleh tahanapoptosis

Kesan ECH pada kepekatan kalsium intraselular dalam PASMC tikus

NE (1 μmol/L) dengan ketara meningkatkan kepekatan kalsium intraselular (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">