BAHAGIAN 1 Acteoside Menekan Osteoklastogenesis Pengantara RANKL Dengan Menghalang Induksi C-Fos Dan Laluan NF- KB Serta Melemahkan Pengeluaran ROS
Mar 07, 2022
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3*
1 Institut Penyelidikan Perubatan Klinikal Universiti Kebangsaan Chonbuk, Institut Penyelidikan Bioperubatan Hospital Universiti Kebangsaan Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Korea Selatan, 2 Jabatan Ortodontik, Institut Biosains Mulut dan Pusat Pengajian Pergigian, Universiti Kebangsaan Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Selatan Korea, 3 Jabatan Sains Bahan Bioaktif, Pusat Penyelidikan Bahan Bioaktif, Universiti Kebangsaan Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Korea Selatan
Abstrak
Banyak kajian telah melaporkan bahawa sitokin radang adalah mediator penting untuk osteoklastogenesis, dengan itu menyebabkan penyerapan tulang yang berlebihan dan osteoporosis.Acteoside, sebatian aktif utama bagiRehmannia glutinosa, yang digunakan secara meluas dalam perubatan Oriental tradisional, mempunyai potensi anti-radang dan antioksidan. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawaacteosidedengan ketara menghalang pembezaan dan pembentukan osteoklas daripada makrofaj sumsum tulang (BMM) dan makrofaj RAW264.7 yang dirangsang oleh pengaktif reseptor ligan faktor nuklear-kappaB (NF-kB) (RANKL). Prarawatan acteoside juga menghalang penyerapan tulang oleh osteoklas matang dalam cara yang bergantung kepada dos.Acteoside(10 mM) melemahkan pengaktifan p38 kinase yang dirangsang RANKL, kinase terkawal isyarat ekstraselular, dan kinase terminal c-Jun N, dan juga menindas pengaktifan NF-kB dengan menghalang fosforilasi subunit p65 dan perencat kBa. Di samping itu, peningkatan pengantara RANKL dalam ekspresi c-Fos dan faktor nuklear bagi sel T yang diaktifkan, sitoplasma 1 (NFATc1) dan dalam penghasilan faktor nekrosis tumor-a, interleukin (IL)-1b , dan IL-6 nampaknya dihalang oleh prarawatan acteoside. Selanjutnya, lisanacteosidemengurangkan kehilangan tulang yang disebabkan oleh ovariektomi dan pengeluaran sitokin radang untuk mengawal tahap. Data kami mencadangkan bahawaacteosidemenghalang pembezaan dan kematangan osteoklas daripada prekursor osteoklastik dengan menekan pengaktifan RANKL yang disebabkan oleh kinase protein diaktifkan mitogen dan faktor transkripsi seperti NF-kB, c-Fos, dan NFATc1. Secara kolektif, keputusan ini mencadangkan bahawaacteosideboleh bertindak sebagai agen anti-resorptif untuk mengurangkan kehilangan tulang dengan menyekat pengaktifan osteoklas.
Untuk maklumat lanjut sila hubungi:emily.li@wecistanche.com
pengenalan
Tulang sentiasa diubah suai oleh aktiviti osteoklas dan osteoblas yang seimbang [1]. Osteoklas timbul daripada sel prekursor hematopoietik daripada keturunan monosit/makrofaj, manakala osteoblas adalah daripada keturunan mesenkim [2]. Pengaktifan abnormalosteoklas atau pengurangan osteoblastogenesis boleh mengganggu homeostasis tulang, akhirnya menyebabkan penyakit seperti osteoporosis, arthritis, dan kanser tulang [3,4]. Osteoporosis adalah penyakit tulang biasa yang membawa kepada peningkatan risiko patah tulang. Bentuk osteoporosis yang paling biasa adalah disebabkan oleh kekurangan estrogen pada wanita menopaus. Ubat-ubatan seperti kortikosteroid dan anti-epilepsi juga boleh menyebabkan ketidakseimbangan antara penyerapan dan pembentukan tulang, yang boleh mengakibatkan osteoporosis [5]. Banyak perencat anti-resorptif termasuk bifosfonat, calcitonin, estrogen, dan modulator reseptor estrogen terpilih telah digunakan untuk merawat osteoporosis. Inhibitor ini mengekalkan jisim tulang dengan menghalang fungsi osteoklas [6]. Terapi penggantian estrogen adalah rawatan yang paling popular untuk mencegah dan merawat osteoporosis selepas menopaus. Walau bagaimanapun, terapi penggantian estrogen jangka panjang boleh meningkatkan risiko kanser endometrium dan payudara. Oleh itu, ramai penyiasat telah menumpukan usaha mereka untuk membangunkan agen anti-resorptif baru yang tidak mempunyai kesan sampingan [7-10]. Oleh kerana osteoklas berfungsi dalam penyerapan tulang, khususnya menghalang osteoklas telah dianggap sebagai sasaran utama dalam banyak kajian. Osteoklas ialah sel gergasi multinuklear yang dibentuk oleh progenitor mononuklear bagi keluarga monosit/makrofaj melalui percambahan berurutan, pembezaan, dan gabungan sel prekursor hematopoietik [11]. Faktor perangsang koloni makrofaj (M-CSF) dan pengaktif reseptor ligan faktor nuklear (NF) -kB (RANK) (RANKL) adalah faktor penting untuk pembezaan osteoklas[12]. Selain itu, beberapa sitokin radang, seperti faktor nekrosis tumor (TNF) dan interleukin (IL)-1b, menyumbang kepada osteoklastogenesis dengan memodulasi induksi RANKL, osteoprotegerin dan M-CSF [7,13]. RANKL mengikat kepada reseptor RANK permukaan sel menghasilkan RANKL/RANK/TNFR
kompleks faktor berkaitan (TRAF) yang secara berurutan mengaktifkan NFkB dan kinase protein diaktifkan mitogen (MAPKs), termasuk cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase, dan kinase berkaitan isyarat ekstraselular (ERK) [14]. Pengaktifan ini memainkan peranan penting dalam pengantaraan pembezaan, pengaktifan dan kemandirian osteoklas.RANKL juga mengaktifkan ekspresi faktor transkripsi seperti faktor nuklear sel T yang diaktifkan, sitoplasma 1 (NFATc1) dan-Fos, yang penting untuk pembangunan osteoklas [ 7,9]. Oleh itu, isyarat RANKL dianggap sebagai sasaran utama agen anti-resorptif yang menyekat pengaktifan osteoklas dan tanpa tulang.Acteosideadalah sebatian aktif utama Rehmannia glutinosa, yang digunakan secara meluas dalam perubatan Oriental tradisional [15,16].Acteosideadalah antioksidan yang kuat dan mempunyai aktiviti anti-hepatotoksik, anti-radang, dan anti-nociceptive [17-20]. Kami sebelum ini mendapati bahawaacteosidemengurangkan aktiviti tyrosinase dan biosintesis melanin dengan mengawal isyarat ERK [21], melindungi daripada kerosakan gingival yang dimediasi spesies oksigen reaktif (ROS)[22], dan menyekat kerosakan sel yang dimediasi mikotoksin [23]. Kesan ini berkait rapat denganacteosidekeupayaan untuk mengalih keluar ROS dan mengawal selia isyarat pengantara MAPK. Khususnya, ROS dicadangkan untuk menjadi pengantara laluan isyarat yang disebabkan oleh RANKL dan peristiwa selular dalam osteoklas. Prarawatan dengan antioksidan menghalang pengaktifan NF-kB, ERK, dan IkBa yang disebabkan oleh RANKL, dengan itu menekan osteoklastogenesis [24]. Penemuan ini sangat mencadangkan bahawa, sebagai tambahan kepada aktiviti anti-radang, dan aktiviti antioksidan adalah penting untuk agen anti-resorptif, oleh itu.acteosideboleh menekan osteoklastogenesis yang disebabkan oleh RANKL. Dalam kajian ini, kami meneroka sama adaacteosidemempunyai kesan terapeutik terhadap kehilangan tulang. Kami meneliti kesan daripadaacteosidemengenai pembezaan osteoklas dan penyerapan tulang dan mekanisme selular yang berkaitan menggunakan sistem eksperimen in vitro dan in vivo.
Bahan dan Kaedah
Pernyataan Etika
Amalan penjagaan dan penggunaan haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Universiti Kebangsaan Chonbuk dalam Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal (No. Permit CBU 2010-0007). Semua eksperimen dalam kajian ini telah dijalankan mengikut garis panduan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Universiti.
Tikus, Bahan Kimia dan Barangan Makmal
Tikus ICR betina berusia empat minggu telah dibeli daripada OrientBio Inc. (Seoul, Korea) dan ditempatkan pada 2261uC dan kelembapan 5565 peratus pada kitaran terang/gelap 12 jam dengan akses percuma kepada makanan dan air. Acteoside (3,4-dihydroxy-b-phenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Gamb. S1) telah diasingkan daripada daun Rehmannia glutinosa. Acteoside telah dibubarkan dalam garam penampan fosfat (PBS) sebelum digunakan. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 dan M-CSF telah dibeli daripada sistem R&D (Minneapolis, MN, USA). Antibodi khusus untuk c-Fos,p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa dan b-actin diperoleh daripada Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antibodi untuk p-p38 dan p38 telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel (Danvers, MA, Amerika Syarikat). Kit EIA CalciumAssay dan Osteocalcin (OC) telah dibeli daripada Sistem BioAssay (Hayward, CA, Amerika Syarikat) dan Teknologi Bioperubatan (Stoughton, MA, Amerika Syarikat), untuk menentukan parameter biokimia serum. Kit ujian asid fosfatase (TRAP) tahan tartrat tikus (Sistem Immunodiagnostic, Scottsdale, AZ, Amerika Syarikat) juga digunakan untuk mengukur tahap TRAP5b serum. Melainkan dinyatakan sebaliknya, bahan kimia tambahan diperoleh daripada Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Amerika Syarikat), dan barangan makmal adalah daripada SPL Life Sciences (Pochun, Korea Selatan).
Kultur Sel
Sel sumsum tulang diperolehi daripada tibia dan femora tikus ICR betina berumur 6 minggu mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini [25]. Suspensi sumsum tulang telah diinkubasi dalam hidangan kultur 100-mm dengan kehadiran 50 ng/ml M-CSF. Selepas 3 hari, sel yang melekat digunakan sebagai makrofaj sumsum tulang (BMM) untuk mendorong pembezaan osteoklastik. Beberapa sel sumsum tulang juga diinkubasi selama 48 jam tanpa M-CSF, dan sel-sel yang melekat dibiakkan dalam medium pembezaan osteoblas, seperti yang diterangkan di tempat lain [25]. Sel makrofaj RAW264.7 telah dibiakkan dalam medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM) yang ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS), 2 mM L glutamin dan antibiotik. Sel-sel ini digunakan sebagai garis sel rakan sejawat untuk BMM untuk meneroka kesan acteoside pada osteoklastogenesis.
Pembezaan Osteoklastik dan Pewarnaan TRAP
BMM telah diprarawat dengan pelbagai kepekatan (0-50 mM) acteoside selama 2 jam sebelum dirangsang dengan RANKL 100 ng/ml. Media kultur digantikan dengan media segar pada hari ke-2 dan ke-5. Selepas 7 hari pengeraman, kultur telah ditetapkan dalam 4 peratus paraformaldehid penampan PBS dan diwarnai dengan TRAP menggunakan kit Aldrich sigma mengikut arahan pengilang. Sel-sel TRAP-positif dikira menggunakan mikroskop optik, dan sel yang mengandungi 3 atau lebih nukleus dianggap sebagai osteoklas. RAW 264.7 sel juga terdedah kepada 100 ng/ml RANKL selepas prarawatan dengan acteoside selama 2 jam, dan selepas 7 hari pengeraman, sel telah diproses untuk pewarnaan TRAP.
Pengukuran Daya Tahan Sel
Daya maju sel ditentukan menggunakan reagen garam tetrazolium (WST){1}} larut air. Secara ringkasnya, sel BMM atau RAW264.7 yang dikultur dalam medium pertumbuhan yang mengandungi 10 peratus FBS dan antibiotik telah dirawat dengan 10 mM acteoside atau sebatian fenolik seperti kuersetin, luteolin, apigenin atau epigallocatechin-3-gallate(EGCG). Reagen WST-8 telah ditambah ke dalam kultur selepas 48 jam pengeraman. Selepas mengeram selama 4 jam tambahan, penyerapan khusus WST{10}}diukur pada 450 nm menggunakan pembaca plat mikro (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).
Ujian Penyerapan Tulang
BMM (16105 sel/ml) digantung dalam a-MEM yang mengandungi 50 ng/ml M-CSF dan 100 ng/ml RANKL, kemudian dibahagikan pada24-plat perigi yang disalut dengan nanokristal kalsium fosfat(OAAS{{6} }; Substrat Ujian Aktiviti Osteoklas, Oscotec Inc., Choongnam, Korea Selatan) pada ketumpatan 26104 sel/cm2 dengan dan tanpa acteoside. Selepas mengeram selama 7 hari, sel-sel dikeluarkan dari plat dengan 5 peratus natrium hipoklorit, dan pembentukan lubang diperhatikan di bawah mikroskop optik. Kawasan resorbed juga diukur oleh penganalisis imej dan dinyatakan sebagai peratusan nilai kawalan.
Analisis Western Blot
Lisat protein keseluruhan disediakan dalam penimbal lisis seperti yang diterangkan di tempat lain [26]. Protein sitosolik dan nuklear telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini [25]. Jumlah ekstrak protein yang sama dipisahkan oleh 12–15 peratus SDS-PAGE dan disapu pada membran polivinil difluorida. Blot telah disiasat dengan antibodi primer semalaman pada 4uC sebelum inkubasi dengan antibodi sekunder dalam menyekat penimbal selama 1 jam. Tompok telah dibangunkan dengan chemiluminescence yang dipertingkatkan (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) dan terdedah kepada filem X-ray (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
Ujian Aktiviti MAPK
Sel telah diprarawat dengan acteoside selama 2 jam dan kemudian dirangsang dengan RANKL untuk tambahan-30 min. Aktiviti MAPK ditentukan menggunakan kit ujian imunometrik, seperti kit ujian p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), kit ujian enzim p-ERK (Reka Bentuk Ujian), dan kit ELISA sandwic p-SAPK/JNK ( Teknologi Isyarat Sel, MA, Amerika Syarikat). Semua prosedur mengikut arahan pengilang, dan penyerapan diukur oleh pembaca plat mikro.
Ujian Anjakan Mobiliti Elektroforetik(EMSA)
Tindak balas pengikatan DNA-protein dilakukan selama 30 min pada suhu bilik, dengan 10–15 mg protein dalam 20 ml penimbal yang mengandungi 1 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml poli (dI-dC), 5 peratus gliserol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM oligonukleotida berlabel [a-32P] dCTP dan serpihan Klenow daripada DNA polimerase. Sampel telah diasingkan pada 6 peratus gel poliakrilamida, yang telah dikeringkan dan didedahkan kepada filem sinar-X (Eastman Kodak Co.) selama 12-24 jam pada 270uC. Urutan primer oligonukleotida khusus untuk NF-ialah 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 dan 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.
Ujian Luciferase NF-kB
Makrofaj RAW264.7 dalam 24-plat perigi dialihkan dengan0.8 mg kB-luciferase vektor wartawan menggunakan 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. Pada 24 jam selepas pemindahan, sel-sel telah dirangsang dengan RANKL dengan kehadiran dan ketiadaanacteosideselama 24 jam. Sel telah digantung semula dalam penampan lisis wartawan 100 ml (Promega, Madison, WI, Amerika Syarikat). Jumlah sampel protein yang sama diletakkan ke dalam 96-plat mikro telaga dan dicampur dengan substrat luciferase. Luminescence diukur dengan menggunakan mikroplate luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman). Dalam eksperimen ini, peptida perencat NF-B telap (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) digunakan sebagai perencat kB positif.
Pengukuran Sitokin
BMM atau sel RAW264.7 telah dirangsang dengan RANKL dengan kehadiran acteoside dalam 24-plat kultur telaga. Selepas 48 jam pengeraman, supernatan kultur dikumpulkan dan dinilai oleh ELISA menggunakan kit TNF-a-, IL-1b- dan IL-6-khusus OptEIATM mengikut arahan pengilang.
Reverse transcription-polimerase chain reaction (RT-PCR) Masa Nyata
Ekspresi mRNA penanda osteoklastik, seperti c-Fos, NFATc1, dan TNF-a, ditentukan oleh RT-PCR masa nyata. Secara ringkasnya, jumlah RNA telah diekstrak daripada makrofaj dengan Trizolreagent mengikut arahan pengilang (Invitrogen). cDNA telah disintesis dengan 1 mg jumlah RNA menggunakan SuperScriptReverse Transcriptase II dan primer (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) telah digunakan untuk mengesan pengumpulan produk PCR semasa berbasikal dengan sistem pengesanan jujukan ABI 7500 (AppliedBiosystems). Selepas denaturasi pada 95uC selama 10 minit, PCR adalah
Pengukuran ROS Intraselular
Penyelesaian stok 29,79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Jerman) telah disediakan dalam DMSO dan disimpan pada suhu 220uC dalam gelap. Secara ringkasnya, BMM (106 sel/ml dalam 6-plat telaga) telah dikultur dengan 50 ng/MLM-CSF selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan pelbagai kepekatan (0–10 mM) acteoside 2 jam sebelum rangsangan dengan 100 ng/mlRANKL. Selepas 1 jam inkubasi bersama, sel-sel ini kemudiannya diinkubasi dengan 25 mM DCFH-DA selama 30 minit. Pendarfluor hijau 29,79-dichlorofluorescein (DCF) telah direkodkan pada 515 nm (FL 1) menggunakan sistem FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, Amerika Syarikat) dan 10,000 peristiwa telah dikira setiap sampel.
Induksi Osteoporosis Akibat Ovariektomi
Tikus ICR betina (berusia 6 minggu) digunakan untuk kajian ini. Tikus menerima pembedahan palsu (Sham, n=10) atau pembedahan ovariectomized (OVX, n=20) di bawah bius. Seminggu selepas pembedahan, tikus OVX dibahagikan secara rawak kepada 2 kumpulan 10 tikus setiap satu: OVX dua hala dan OVX dua hala ditambah dengan 200 ml PBS yang mengandungi 1 mM acteoside secara lisan (kumpulan AC). Lisanacteosidetelah ditadbir sekali setiap 3 hari selama 8 minggu selepas pembedahan, dan jumlah PBS yang sama telah diberikan kepada kumpulan Sham dan OVX. Selepas 1 hari pemberian terakhir, tikus dikorbankan dan kemudian parameter biokimia dalam serum dan 3-struktur tulang dimensi dianalisis.
Penentuan Parameter Biokimia Serum
Sampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung dan serum dikumpulkan dengan sentrifugasi. Sampel serum disimpan pada 280uC untuk analisis parameter biokimia. Tahap serum IL-1b dan IL-6 dianggarkan dengan menggunakan kit ELISA seperti yang diterangkan di atas, manakala aktiviti alkali fosfatase (ALP) ditentukan dengan menggunakan ujian kolorimetrik biokimia yang mengukur jumlah p -nitrophenol dihasilkan daripada substrat p-nitrophenol fosfat, seperti yang diterangkan di tempat lain [27]. Untuk menganggarkan biomarker pembentukan dan penyerapan tulang, paras serum OC, kalsium, dan TRAP5b juga ditentukan mengikut arahan pengeluar.
Analisis Struktur Tulang dan Parameter Morfometrik
Femora tikus (kumpulan Sham, OVX, dan AC) dibedah dan diisi dengan garam fisiologi untuk ujian mekanikal. Kekuatan mekanikal femur diukur seperti yang diterangkan di tempat lain [28]. Beban patah direkodkan sebagai daya puncak dalam newton pada titik pertengahan aci patah tulang paha kanan. Di samping itu, tulang paha ringan setiap haiwan dianalisis secara histomorfometrik menggunakan sistem tomografi mikrokomputer (mikro-CT) (sistem sinar-X mikrofokus SkyScan 1076, Kontich, Belgium). Secara ringkasnya, tulang dalam simpanan formaldehid 4 peratus telah dikeringkan secara cetek pada tisu kertas sebelum dibalut dengan plastik ''cling-film'' atau dalam parafilem, untuk mengelakkan pengeringan semasa pengimbasan. Setiap tulang yang dibalut plastik diletakkan di dalam tiub busa plastik/polistirena yang dipasang secara menegak secara mendatar dalam ruang sampel pengimbas 1076 untuk pengimejan mikro-CT. Pengimbasan telah dijalankan menggunakan voltan sumber 100 kV dan arus punca 140 mA dengan resolusi 35 mm. Model tiga dimensi tulang trabekular femur telah dibina semula menggunakan SkyScan CT Analyzer versi 1.11. Parameter struktur seperti ketumpatan mineral tulang trabekular(BMD, g/cm3), peratus isipadu tulang (isipadu tulang (BV)/isipadu tisu (TV), peratus ), ketebalan (Tb.Th, mm), pemisahan (Tb.Sp , mm), dan nombor (Tb.N, 1/mm) kemudiannya diukur.
Ujian Pembezaan dan Mineralisasi Osteogenik
Sel sumsum tulang yang dikultur dalam {{{{10}}}}plat kultur telaga telah dirawat dengan DAG (10 nM deksametason, 50 mM asid askorbik dan 20 mM b-gliserofosfat) dengan kehadiran 10 mM acteoside. Selepas 2 minggu pembezaan, sel-sel telah ditetapkan dengan etanol ais-sejuk70 peratus (vol/vol) selama 1 jam dan diwarnai dengan 0.2 peratus alizarin merah Sin air suling selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas sel dikeringkan dan dikeringkan di udara, plat kultur sel dinilai oleh mikroskop cahaya menggunakan mikroskop terbalik (Nikon TS100, Jepun). Untuk mengukur jumlah pewarna merah, noda telah dicairkan dengan 10 peratus asetil piridinium klorida dengan menggoncang selama 20 minit dan penyerapan diukur pada 560 nm. Jumlah kalsium yang disimpan dalam lapisan sel juga diukur menggunakan Kit Kalsium (Wako Chemical Inc. Osaka, Jepun) mengikut arahan pengilang. Selain itu, ekspresi penanda mRNA khusus tulang, seperti faktor transkripsi berkaitan runt-2(Runx2), osterix, bone sialoprotein (BSP) dan OC ditentukan oleh RT-PCR masa nyata. Primer oligonukleotida penanda ini direka bentuk dengan saiz produk kurang daripada 200 bp menggunakan Perisian PrimerExpress 3.0 (Biosistem Gunaan) seperti yang diterangkan di tempat lain[27].
Analisis statistik
Melainkan dinyatakan sebaliknya, semua data dinyatakan sebagai min6 sisihan piawai (SD) bagi 3 atau lebih eksperimen bebas. ANOVA sehala telah digunakan untuk berbilang perbandingan menggunakan perisian SPSS versi 12.0 Nilai-p ,0.05 dianggap signifikan secara statistik.
Keputusan
Acteoside Menghalang Pembentukan Osteoklas oleh Macrophagesin dengan Cara Bergantung Dos
Untuk mengesahkan kesan acteoside pada pembezaan BMM ke dalam osteoklas, sel-sel telah dikultur dengan pelbagai kepekatan (0-20 mM) acteoside selama 7 hari dengan kehadiran 50 ng/ml M CSF dan 100 ng/ml RANKL . Acteoside mengurangkan bilangan osteoklas dalam cara yang bergantung kepada dos. Apabila sel telah diprarawat dengan 10 mM acteoside selama 2 jam, bilangan osteoklas menurun sebanyak 43 peratus berbanding sel yang ditambah dengan M-CSFand RANKL (Rajah 1A). Rajah 1B menunjukkan pembezaan osteoklas pengantara RANKL dan perencatannya dengan rawatan gabungan dengan acteoside. Selaras dengan keputusan ini, prarawatan acteoside mengurangkan pembezaan sel RAW264.7 yang dirangsang RANKL dan pembentukan osteoklas (Rajah 1C dan D). Apabila potensi anti osteoklastik acteoside pada BMM dibandingkan dengan potensi anti-osteoklas beberapa sebatian fenolik pada kepekatan yang sama (10 mM), luteolin menunjukkan aktiviti tertinggi (Rajah 2A). Walau bagaimanapun, luteolin, quercetin, atau apigenin itu sendiri mengurangkan daya maju sel (Rajah 2B). Semua sebatian menghalang pembezaan osteoklastik oleh makrofaj RAW264.7 dengan aktiviti relatif berikut: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=acteoside (Gamb. 2C). Luteolin, quercetin, atau apigenin sendiri juga menunjukkan daya maju sel yang berkurangan (Rajah 2D). Sebaliknya, rawatan kuersetin hanya menyebabkan pengurangan daya maju yang ketara dalam kedua-dua sel BMM dan RAW264.7, apabila sel-sel ini terdedah kepada 10 mM setiap sebatian selama 2 hari dengan 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, atau kedua-duanya (data tidak ditunjukkan). Apabila kepekatan sebatian ini diperlukan untuk menghalang 50 peratus daripada
pembentukan osteoklas dalam BMM (IC50) dikira menggunakan lengkung aktiviti kepekatan, IC50 acteoside, quercetin, luteolin, apigenin, dan EGCG ialah 5.1, 2.3, 2.6, 4.8, dan 6.6 mM, masing-masing (Rajah 2E). Keputusan ini adalah serupa dengan kes yang RAW264.7 makrofaj telah diperiksa. Data ini mencadangkan bahawa luteolin dan quercetin mempunyai aktiviti anti-klastogenik yang lebih tinggi daripada acteoside. Sebaliknya, quercetin pada IC50 juga mempunyai kesan toksik ringan pada sel (data tidak ditunjukkan).
ActeosideMenghalang Penyerapan Tulang oleh MacrophagesActeoside juga menghalang penyerapan tulang pengantara RANKL dalam cara yang bergantung kepada dos, seperti yang diukur oleh sistem model in vitro (Rajah 3A). Penyerapan tulang telah dihalang dengan ketara apabila BMM diinkubasi dengan 1 mM acteoside (Rajah 3B). Rawatan acteoside 10 mM hampir melemahkan sepenuhnya pembentukan pit yang disebabkan oleh RANKL oleh BMM. Begitu juga, acteoside mengurangkan penyerapan tulang dalam sel RAW264.7 yang dirangsang RANKL (Rajah S2A dan B). keupayaanacteosideuntuk menghalang penyerapan tulang bergantung pada masa rawatan berbanding dengan rangsangan RANKL. Acteoside(10 mM) ditambah 4 hari selepas rangsangan RANKL tidak mengurangkan pembentukan pit dalam BMM, sedangkan ia menekan bilangan osteoklas yang terbentuk (Rajah 3C). Keputusan yang berbeza ini sebahagiannya disebabkan oleh kawasan lubang yang telah terbentuk selepas 4 hari pembentukan rangsangan RANKL (Rajah 3D).
ActeosideDown-Regulates Early RANKL SignalingPathways
RANKL mendorong pengaktifan 3 MAPK dan NF-kB yang terkenal dalam prekursor osteoklas, dan pengaktifan ini diperlukan untuk pembezaan osteoklas awal. Untuk memahami kemungkinan mekanisme yang mana acteoside menghalang osteoklastogenesis, kami menyiasat kesan acteoside pada MAPK dan pengaktifan NF-B dalam makrofaj. BMM dan sel RAW264.7 telah dirawat terlebih dahulu dengan 10 mM acteoside selama 2 jam dan kemudian dirangsang dengan RANKL 100 ng/ml selama 30 minit. Fosforilasi MAPK telah diperiksa dengan analisis blotting dan imunometrik Barat. RANKL teraruh fosforilasi p38, ERK, dan JNK dalam BMM (Rajah 4A) dan sel RAW264.7 (Rajah 4B). Acteoside menghalang peningkatan yang disebabkan oleh RANKL ini dalam p-p38, p-ERK dan p-JNK. Keputusan ini disokong oleh analisis imunometrik, yang mana prarawatan dengan 10 mM acteoside dengan ketara menghalang tahap MAPK terfosforilasi dalam makrofaj ini (Rajah 4C). Rawatan RANKL meningkatkan pengikatan DNA NF-kB, manakala acteoside menghalang pengaktifan NF-kB-DNA yang disebabkan oleh RANKL (Rajah 5A). Perencatan ini lebih menonjol dalam BMM daripada dalam sel RAW264.7. Acteoside juga mengurangkan fosforilasi p65 dan IkBa yang dirangsang RANKL dalam BMM dan sel RAW264.7 (Rajah 5B dan C). Menambah 10 mMacteoside hampir sepenuhnya menghalang kedua-dua degradasi dan pengaktifan IkBa dalam BMM (Rajah 5B). Untuk mengesahkan lagi bahawa pengaktifan NF kB terlibat dalam tindakan acteoside, konstruk promoter-luciferase kB telah dipindahkan secara sementara ke dalam sel RAW264.7. Sel yang diinkubasi dengan RANKL 100 ng/ml mempunyai 3-aktiviti promoter kB kali ganda lebih tinggi, yang telah dilemahkan dengan ketara oleh 10 mM acteoside (Rajah 5D).
Acteoside Menekan Pengeluaran sitokin radang dan Ekspresi TNF-a, c-Fos dan NFATc1in RANKL-Stimulated Macrophages
TNF-a, IL-1b, dan IL-6 adalah penting dalam pembentukan dan fungsi osteoklas, yang dimediasi oleh isyarat NF-kB dalam makrofaj yang dirangsang oleh RANKL. RANKL merangsang pengeluaran sitokin ini, dan pengeluaran ini dikurangkan dengan ketara oleh 10 mM prarawatan acteoside dalam BMM (Rajah 6A). Begitu juga, acteoside melemahkan pengeluaran sitokin yang disebabkan oleh RANKL, kecuali IL-6, dalam makrofaj RAW264.7 (Rajah S3). Untuk memahami mekanisme molekul tindakan acteoside dalam osteoklastogenesis, kami selanjutnya mengkaji kesan acteoside pada ekspresi TNF-a, c-Fos, dan NFATc1. RANKL mengawal selia ekspresi mRNA faktor-faktor ini dalam sel BMM dan RAW264.7 (Rajah 6B dan C). Prarawatan dengan 10 mM acteoside dengan ketara menghalang ekspresi yang disebabkan oleh RANKL bagi faktor-faktor ini dalam kedua-dua
BMM dan sel RAW264.7. Prarawatan acteoside juga sangat mengurangkan tahap protein c-Fos dan NFATc1 dalam BMM yang dirangsang RANKL (Rajah 6D). Keputusan ini mencadangkan bahawaacteosidemengawal selia RANKL yang mendorong perantara pembentukan osteoklas pada tahap gen dan protein.
Acteoside Mengurangkan Penjanaan ROS Intraselular dalam BMM dengan Cara Bergantung Dos
Oleh kerana diketahui bahawa pengeluaran ROS intraselular berkorelasi dengan osteoklastogenesis yang dirangsang RANKL, kami menyiasat sama ada acteoside menghalang pengeluaran ROS semasa pembezaan osteoklas yang dimediasi RANKL menggunakan pewarna sensitif pengoksidaan, DCFH-DA. Analisis sitometri aliran menunjukkan bahawa isyarat pendarfluor min khusus untukDCF dalam BMM nampaknya dianjak ke kanan selepas rangsangan denganRANKL, berbanding dengan sel kawalan yang tidak dirawat (Rajah 7A). Peralihan ini adalah serupa dengan kes makrofaj RAW264.7 diperhatikan selepas rangsangan RANKL (data tidak ditunjukkan). Merawat BMM dengan acteoside mengurangkan keamatan isyarat DCF dalam cara yang bergantung kepada dos. Prarawatan dengan 10 mM acteoside hampir sepenuhnya mengurangkan tahap ROS intraselular yang dihasilkan semasa pembezaan osteoklas kepada tahap kawalan yang tidak dirawat (Rajah 7B).
Pentadbiran Acteoside Oral Menghalang Perubahan Penanda Biokimia Osteoporotik dan Kehilangan Tulang dalam Tikus Ovariectomized
Untuk meneroka kesan acteoside pada kehilangan tulang, kami menyediakan model haiwan osteoporotik melalui ovariektomi. Tiada perbezaan ketara dalam berat badan antara OVX dan Shammice semasa tempoh percubaan (data tidak ditunjukkan). Kumpulan tersebut mempunyai paras serum IL-1b dan IL-6 yang jauh lebih tinggi daripada kumpulan Sham (Rajah 8). Peningkatan yang disebabkan oleh ovariektomi dalam sitokin radang ini telah dilemahkan oleh pentadbiran acteoside oral (kumpulan AC). Tahap serum penanda pusing ganti tulang seperti ALP, kalsium, TRAP5b, dan OC telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan OVX. Daripada penanda osteoporotik ini, peningkatan tahap kalsium, TRAP5b, dan OC dalam tikus OVX nampaknya dihalang oleh rawatan acteoside, manakala tahap serum ALP tidak diubah oleh rawatan. Purata beban patah maksimum ke tengah aci femoral kanan adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan OVX berbanding kumpulan Sham (Rajah 9A). Rawatan acteoside meningkatkan sandaran patah maksimum kepada kumpulan Sham. Apabila tulang kortikal femur dibedah dan diperhatikan oleh mikroskop optik, ciri osteoporotik yang ditunjukkan dalam kumpulan OVX telah hampir hilang sepenuhnya dalam tikus AC (Rajah 9B). Untuk mengesahkan kesan acteoside pada model osteoporosis yang disebabkan oleh OVX, BMD dan parameter morfologi tulang dalam trabekular femur proksimal cahaya dianalisis oleh mikro-CT. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 9C, perubahan seni bina trabekular femoral ditemui pada tikus OVX, manakala perubahan ini dikurangkan dengan rawatan dengan acteoside. Keputusan daripada analisis mikro-CT mendedahkan bahawa BMD, ukuran kekuatan tulang, telah dikurangkan secara mendadak dalam OVXmice (Rajah 9D). Berbanding dengan kumpulan Sham, tikus OVX juga menunjukkan perubahan ketara dalam BV/TV, Tb. Sp, dan Tb. N, tetapi bukan Tb.Th. Rawatan acteoside oral tikus OVX dengan ketara menghalang perubahan dalam BMD serta BV/TV dan Tb.N.
