Bahagian 1:Acteoside Menghalang Interleukin-1 -Proses Katabolik Teraruh Melalui Modulasi Protein Kinase Diaktifkan Mitogen Dan Laluan Isyarat Selular NFκB

Acteoside Bertindak balas Interleukin-1 -Proses Katabolik Teraruh melalui Modulasi Protein Kinase Diaktifkan Mitogen dan Laluan Isyarat Selular NFκB

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh ,6 Deuk-Sil Oh ,6 Hong-Sung Chun ,2 dan Jae-Sung Kim 1

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com

1Institut Sains Pergigian, Universiti Chosun, Gwangju 61452, Republik Korea

2Jabatan Sains Bioperubatan, Universiti Chosun, Gwangju 61452, Republik Korea

3Jabatan Bioperubatan, Kesihatan & Sains Konvergensi Kehidupan, BK21 Four, Kolej Farmasi, Universiti Kebangsaan Mokpo,

Jeonnam 58554, Republik Korea

Institut Perubatan 4Chung-Yeon, Gwangju 61949, Republik Korea

5Institut Penyelidikan dan Pembangunan, CY Pharma Co., Seoul 06224, Republik Korea

6Institut Sumber Hutan Jeollanamdo, Naju, Jeollanamdo, 58213, Republik Korea

Surat-menyurat harus ditujukan kepada Jae-Sung Kim; js_kim@chosun.ac.kr

Diterima 2 Julai 2020; Disemak pada 15 Februari 2021; Diterima pada 6 Mac 2021; Diterbitkan pada 25 Mac 2021

Editor Akademik: Joël R. Drevet

Hak Cipta © 2021 HyangI Lim et al. Ini ialah artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah CreativeCommonsAttributionLicense,

yang membenarkan penggunaan tanpa had, pengedaran,dan pembiakan dalam mana-mana medium, dengan syarat karya asal dipetik dengan betul.

cistanche boleh merawat penyakit buah pinggang meningkatkan fungsi buah pinggang

Osteoartritis (OA) adalah penyakit sendi degeneratif yang paling biasa dengan sakit sendi kronik yang disebabkan oleh degenerasi progresif rawan artikular pada sendi sinovial.Acteoside, glikosida caffeoylphenylethanoid, mempunyai pelbagai aktiviti biologi seperti kesan antimikrob, anti-radang, antikanser, antioksida, sitoprotektif, dan neuroprotektif. Selanjutnya, pentadbiran lisan daripadaacteosidepada dos yang tinggi tidak menyebabkan genotoksisiti. Oleh itu, tujuan kajian ini adalah untuk mengesahkan kesan antikatabolikacteosideterhadap osteoarthritis dan laluan isyarat antikataboliknya.Acteosidetidak mengurangkan daya maju sel fibroblas tikus L929 yang digunakan sebagai sel normal dan kondrosit tikus primer.Acteosidemengatasi kehilangan proteoglycan yang disebabkan oleh IL-1 -dalam kondrosit dan rawan artikular dengan menekan ekspresi dan pengaktifan enzim merendahkan rawan seperti matriks metalloproteinase- (MMP-) 13, MMP-1, dan MMP{{ 6}}. Tambahan pula,acteosidemenyekat ekspresi mediator inflamasi seperti sintase nitrik oksida yang boleh diinduksi, siklooksigenase-2, nitrik oksida dan prostaglandin E2 dalam kondrosit tikus primer yang dirawat dengan IL-1 . Selepas itu, ekspresi sitokin proinflamasi telah berkurangan sebanyakacteosidedalam kondrosit tikus primer yang dirawat dengan IL-1 . Selain itu, acteoside menindas bukan sahaja fosforilasi kinase protein diaktifkan mitogen dalam kondrosit tikus primer yang dirawat dengan IL-1 tetapi juga translokasi NFκB daripada sitosol ke nukleus melalui penindasan fosforilasinya. Pentadbiran oral 5 dan 10mg/kg acteoside melemahkan degenerasi progresif rawan artikular dalam model tetikus osteoartritis yang dihasilkan oleh ketidakstabilan meniskus medial. Penemuan kami menunjukkan bahawa acteoside adalah agen atau suplemen antikatabolik berpotensi yang menjanjikan untuk melemahkan atau mencegah degenerasi progresif rawan artikular.

Sila klik di sini untuk Bahagian 2

1. Pengenalan

Osteoartritis (OA) adalah penyakit sendi degeneratif yang paling biasa dengan sakit sendi kronik yang disebabkan oleh degenerasi progresif rawan artikular pada sendi sinovial [1].

Disebabkan oleh peningkatan dalam jangka hayat, kelaziman OA dengan kehilangan mobiliti dan sakit sendi kronik yang disebabkan oleh degenerasi progresif rawan artikular pada sendi sinovial dianggarkan masing-masing 18 peratus dan 9.6 peratus pada wanita selepas menopaus dan lelaki [2]. ]. Walaupun kelaziman OA di seluruh dunia meningkat setiap tahun, etiologi patofisiologi OA masih tidak diketahui. Ia mungkin disebabkan oleh faktor risiko yang sangat kompleks dan pelbagai faktor seperti penuaan, jantina, warisan genetik, kecederaan sendi traumatik dan beban sendi mekanikal yang teruk. Tambahan pula, hubungan neuropatologi antara degenerasi progresif rawan artikular dan perkembangan sakit sendi kronik tidak diketahui [3]. Oleh itu, matlamat pengurusan klinikal untuk pesakit OA adalah mengekalkan mobiliti badan dan fungsi sendi mekanikal melalui kelegaan daripada sakit sendi kronik, menggunakan pendekatan farmakologi dan bukan farmakologi dan pembedahan penggantian sendi. Permintaan untuk pembangunan intervensi atau suplemen yang berkesan, dengan keselamatan biologi jangka panjang, untuk mencegah atau melemahkan OA bagi mengekalkan kualiti hidup melalui penyelenggaraan fungsi sendi mekanikal dalam populasi warga tua semakin meningkat.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1,acteoside(No. CAS 61276-17-3; C29H36O15) ialah glikosida caffeoylphenylethanoid yang diasingkan daripada beberapa tumbuhan herba seperti Verbascum chloride [4], Buddleja globosa [5], dan Plantago australis [6]. Acteoide mempunyai pelbagai aktiviti biologi seperti antimikrob [5], anti-radang [7], antikanser [8], antioksida [9], cytoprotective [9], dan kesan neuroprotektif [10]. Selanjutnya, pentadbiran lisan daripadaacteosidepada dos yang tinggi tidak menyebabkan genotoksisiti[11].

Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa acteoside dengan keselamatan biologi anti-radang mempunyai kesan antikatabolik yang berkaitan dengan perlindungan tulang rawan artikular terhadap degenerasi progresif rawan artikular melalui penindasan faktor katabolik seperti sitokin proinflamasi, mediator enzim-degradasi inflamasi sendi dan rawan. . Oleh itu, tujuan kajian ini adalah untuk menyiasatacteoside-kesan antikatabolik yang disebabkan dan laluan isyarat selularnya secara in vitro, menggunakan kondrosit primer yang diasingkan daripada rawan artikular sendi lutut tikus, dan in vivo, menggunakan model haiwan OA yang dihasilkan oleh ketidakstabilan pembedahan meniskus medial dalam sendi lutut tikus.

acteosidedalamcistanchebolehbertambah baikimuniti

2. Kaedah

2.1. Kultur sel.

Kondrosit tikus utama telah diasingkan daripada rawan artikular sendi lutut tikus (5-hari; Sprague–Dawley), mengikut protokol (CIA- CUC2019-A0027) yang diluluskan oleh Institusi Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Universiti Chosun, Gwangju, Republik Korea. Kondrosit tikus primer terpencil dikekalkan dalam Campuran Sederhana/Nutrien Dulbecco Modified Eagle's F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, USA), antibiotik (50U/mL penisilin dan 50ug/mL streptomycin), dan 50ug/mL asid askorbik. Talian sel L{13}} fibroblas tetikus biasa telah dibeli daripada American Type Culture Collection (ATCC). Menurut arahan yang diberikan daripada ATCC, sel L{14}} telah dibiakkan dalam medium penting minimum Eagle, mengandungi 10 peratus FBS dan ditanam dalam inkubator lembap pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2.

2.2. Ujian Daya Tahan Sel.

Ujian dimetil thiazolyl diphenyl tetrazolium salt (MTT) telah dilakukan untuk menilai daya maju sel L929 sel fibroblast tikus yang digunakan sebagai sel normal dan kondrosit tikus primer yang dirawat dengan acteoside. Secara ringkas, sel L929, dan kondrosit tikus primer dibiakkan pada ketumpatan sel 8×105 sel/mL dalam plat kultur selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan 2.5, 5, 10, 25, 50, dan 100μMacteosideuntuk 24j. Selepas rawatan dengan larutan MTT, kedua-dua sel L929 dan kondrosit dibiakkan lagi selama 4 jam. Selepas pengeraman, kristal MTT yang terbentuk digantung sepenuhnya dalam dimetil sulfoksida dan diukur untuk penyerapan pada 570nm menggunakan spektrometer (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek®, Winooski, VT, USA) untuk menilai daya maju sel.

2.3. Ujian Hidup/Mati Sel.

Kemandirian sel dilakukan menggunakan kit ujian Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), yang terdiri daripada calcein-AM hijau untuk melabelkan sel hidup (dengan pendarfluor hijau) dan homodimer etidium-1 untuk pelabelan mati sel (dengan pendarfluor merah). Secara ringkas, kedua-dua sel L929 dan kondrosit tikus primer dibiakkan pada ketumpatan sel 8×105 sel/mL pada slaid ruang (sistem Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Sigma- Aldrich; Merck KGaA) selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan 50 dan 100μM acteoside selama 24 jam. Selepas penanaman, ujian survival sel dilakukan mengikut arahan pengilang. Selepas itu, sel-sel berwarna telah diimej menggunakan mikroskop pendarfluor (Eclipse TE200; Instrumen Nikon, Melville, NY).

2.4. Ujian Dimethylmethylene Blue (DMMB).

Ujian DMMB telah dilakukan untuk menilai perubahan kandungan proteoglycan dalam kondrosit tikus primer yang dirawat dengan acteoside selama 21 hari dengan kehadiran atau ketiadaan IL-1 . Untuk mengekalkan ciri-ciri kondrosit tikus primer selama 21 hari, kondrosit tikus primer (2×106 sel) digantung dalam 1mL 1.2 peratus alginat dan kemudian dikapsulkan dengan menitiskan ampaian sel/alginat kepada larutan 105mM CaCl2. Kondrosit tikus utama yang terkandung dalam alginat dibiakkan selama 24 jam dalam DMEM/F12 (mengandungi 10 peratus FBS, 50U/mL penisilin, 50ug/mL streptomycin, dan 50ug/mL asid askorbik) dan kemudian disesuaikan selama 24 jam dalam DMEM/F12. mini-insulin–transferrin–selenium (mini-ITS) dan 50ug/mL asid askorbik. Selepas itu, kondrosit dirawat dengan 50 atau 100μMacteosidedalam kehadiran atau ketiadaan 1ng/mL IL-1 selama 21 hari. Pada hari ke-21, kondrosit tikus utama dikumpulkan untuk penilaian kandungan proteoglycan menggunakan ujian DMMB, seperti yang diterangkan sebelum ini [12]. Di samping itu, untuk mengukur kandungan proteoglycan setiap sel dan menilai percambahan kondrosit tikus utama, nombor sel diukur dengan ujian DNA menggunakan PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), mengikut arahan pengilang. kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 7 hari. Pada penghujung tempoh kultur, sampel telah dikumpul dan diikat dalam 4 peratus paraformaldehid selama 72 jam untuk analisis histologi.

2.6. Analisis Histologi.

Analisis histologi menggunakan safranin-O dan pewarnaan hijau cepat telah dilakukan untuk mengesahkan kehilangan proteoglikan dalam rawan artikular yang dirawat dengan 100μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 7 hari. Secara ringkas, sampel rawan artikular tetap telah dinyahkalsifikasi dalam asid ethylenediaminetetraacetic dan kemudian dibenamkan dalam parafln. Selepas itu, blok paraffin yang disediakan mengandungi rawan artikular dihiris secara bersiri kepada ketebalan 5μm dan diletakkan pada slaid. Safranin-O dan pewarnaan hijau cepat kemudiannya dilakukan untuk menilai kehilangan proteoglikan dalam bahan tanah rawan artikular. Di samping itu, pewarnaan hematoxylin dan eosin dilakukan untuk memerhatikan morfologi umum rawan artikular.

2.7. Western Blotting.

Western blotting dilakukan untuk menyiasat ekspresi faktor katabolik termasuk MMP-13, MMP-1, MMP-3, inducible nitric oxide synthase (iNOS) dan cyclooxygenase-2 (COX -2) dan pengubahan molekul isyarat selular seperti kinase protein diaktifkan mitogen dan faktor nuklear-kappa B (NFκB). Secara ringkas, kondrosit primer tikus dirawat dengan 50 atau 100μM acteoside dengan ada atau tiada 10ng/mL IL-1 selama 24 jam. Selepas itu, kondrosit utama tikus dituai melalui sentrifugasi dan dilisiskan menggunakan penimbal lisis (Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. Selain itu, untuk mengesahkan translokasi nuklear NFκB, kondrosit utama tikus dirawat dengan 50 atau 100μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 24 jam. Selepas itu, pecahan sitosol dan nuklear telah diekstrak menggunakan reagen pengekstrakan Nuklear dan Sitoplasma NE-PER™ (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) mengikut arahan pengilang. Kepekatan jumlah protein yang diekstrak daripada kondrosit tikus primer ditentukan menggunakan kit ujian protein asid bicinchoninic (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) mengikut arahan pengilang. Di samping itu, medium terkondisi telah dikumpulkan untuk mengesan tahap enzim pengurai rawan yang dirembes daripada kondrosit. Jumlah protein dan medium terkondisi yang sama telah dielektroforesis pada elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa. Selepas itu, western blotting dilakukan menggunakan anti-bodi primer yang disasarkan terhadap MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phospho-ERK1/2, jumlah -ERK1/2, phospho-p38, total-p38, phospho-JNK, jumlah JNK, phospho-NFκB, jumlah NFκB, - actin, dan lamin B. Jalur imunoreaktif telah divisualisasikan menggunakan sistem chemiluminescence yang dipertingkatkan (Thermo Sci- entific, Rockford). , IL, USA) mengikut arahan pengilang dan kemudian diimejkan oleh peranti Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Israel).

2.8. Tindak Balas Rantaian Polimerase Kuantitatif (qPCR) dan PCR Masa Nyata Kuantitatif (qRT-PCR).

Kondrosit tikus utama telah dirawat dengan 50 atau 100μMacteosidedengan ada atau tiada 10ng/mL IL-1 selama 24j. Selepas itu, jumlah RNA telah diasingkan daripada kondrosit tikus utama menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. Jumlah kepekatan RNA diukur menggunakan NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Untuk mensintesis cDNA, RNA 1ug telah ditranskripsi terbalik menggunakan sistem transkripsi-PCR terbalik ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. qPCR cDNA telah dilakukan menggunakan 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Republik Korea) dan primer khusus pada Peranti Sikler Termal PCR TaKaRa (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Jepun). Selepas itu, produk PCR dielektroforesis pada gel agarose untuk menentukan tahap ekspresi gen sasaran. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) telah digunakan sebagai kawalan endogen. Di samping itu, untuk qRT-PCR, cDNA telah dikuatkan menggunakan sistem PCR Masa Nyata Eco™ (illumine Inc., San Diego, CA, USA). -Aktin digunakan sebagai kawalan endogen. Urutan primer yang digunakan dalam qPCR dan qRT-PCR diringkaskan dalam Jadual 1 dan 2, masing-masing.

2.9. Gelatin Zimografi.

Zimografi gelatin dilakukan untuk menilai pengaktifan MMP dalam kondrosit tikus primer. Secara ringkas, kondrosit tikus primer dirawat dengan 50 atau 100μM acteoside dengan ada atau tiada 10ng/mL IL-1 selama 24 jam. Selepas itu, isipadu medium terkondisi yang sama telah dielektroforesis pada gel poliakrilamida 10 peratus yang dikopolimerkan dengan gelatin kulit babi 0.2 peratus (1mg/mL). Selepas elektroforesis, gel diinkubasi dalam penampan semula zimogram (50mM Tris–HCl (pH7.6), 10mM CaCl2, 50mM NaCl dan 0.05 peratus Brij-35) pada 37 darjah selama 72j. Selepas penyatuan semula MMP, gel telah diwarnakan dengan 0.1 peratus Coomassie Brilliant Blue R250. Jalur gelatinolitik didedahkan sebagai jalur jelas pada latar belakang berwarna biru muda yang diwarnai seragam dan kemudian diimej menggunakan kamera digital.

2.10. Pengukuran Nitrik Oksida (NO).

Kondrosit tikus utama dirawat dengan 50 atau 100μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 24 jam. Selepas itu, 50μL medium terkondisi telah bertindak balas dengan 50μL setiap sulfanilamide dan N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride. Penyerapan kemudiannya diukur pada panjang gelombang 540nm menggunakan spektrofotometer (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA).

2.11. Ujian Prostaglandin E2 (PGE2).

Kondrosit tikus utama telah dirawat dengan 50 atau 100μMacteosidedengan ada atau tiada 10ng/mL IL-1 selama 24j. Selepas itu, kepekatan PGE2 diukur menggunakan kit ujian parameter PGE2 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) mengikut arahan pengilang.

2.12. Susunan Sitokin.

Kondrosit tikus utama dirawat dengan 50μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 24 jam. Selepas itu, jumlah protein telah diekstrak dan dikira seperti yang diterangkan sebelum ini [13]. Seterusnya, tatasusunan sitokin telah dilakukan untuk menyiasat perubahan dalam pengeluaran sitokin, mengikut arahan pengeluar (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA).

2.13. Ujian Translokasi Nuklear.

Kondrosit tikus utama dirawat dengan 50 dan 100ug/mLacteosidedengan kehadiran 10ng/mL IL-1 . Selepas 30 minit, kondrosit tikus primer difiksasi dengan 1 peratus paraformaldehid, telap dalam 0.2 peratus Triton X-100, dan dicuci secara meluas dengan garam terbu- pung fosfat. Isyarat tidak spesifik telah disekat menggunakan serum kambing biasa. Selepas beberapa kali cucian, kondrosit diinkubasi dengan antibodi anti-NFκB arnab diikuti dengan pengeraman dengan FITC-konjugasi kambing anti-arnab IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) semalaman pada 4 darjah. Selepas itu, sel-sel berwarna telah diimej menggunakan sistem mikroskop pengimbasan confocal laser (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman) di cawangan Gwangju Institut Sains Asas Korea (Gwangju, Republik Korea).

2.14. Penjanaan Haiwan Osteoartritis.

Untuk menjana haiwan osteoartritis, meniskus medial (DMM) telah tidak stabil melalui pembedahan pada sendi lutut BALB/c tikus (purata berat badan 19:3±0:5g) mengikut garis panduan IACUC (CIACUC{{4} }A0029). Haiwan yang disebabkan oleh OA telah dirawat secara lisan dengan 5 dan 10mg/kg acteoside diselesaikan dalam 5 peratus etanol (kumpulan eksperimen; n =5) atau kenderaan (5 peratus etanol) (kumpulan DMM; n =5) setiap hari lain selama 8 minggu. Pada akhir tempoh kultur, sendi lutut dibedah dan dibetulkan menggunakan 5 peratus paraformaldehid selama 7 hari untuk melakukan penilaian histologi. Selepas safranin-O dan tisu pengimejan pewarnaan hijau cepat rawan artikular diperiksa mengikut gred Mankin [14, 15].

2.15. Analisis statistik.

Data eksperimen dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai dan dibandingkan menggunakan analisis varians, diikuti dengan perbandingan berbilang post hoc (ujian Tukey) menggunakan perisian SPSS versi 25 (IBM Corp.) Semua data, kecuali kajian haiwan, diperolehi daripada tiga eksperimen bebas.

acteosidedalamcistanche

3. Keputusan

3.1. Acteoside Tidak Mempengaruhi Daya Tahan Sel L929 dan Kondrosit Tikus Utama.

Talian sel fibroblast tikus L929 yang digunakan sebagai sel normal telah dirawat dengan 2.5, 5, 10, 25, 50, dan 100μM acteoside selama 24 jam. Selepas itu, ujian MTT dilakukan untuk menilai sitotoksisiti acteoside pada sel L929. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2(a), daya maju relatif sel L929 ditentukan sebagai 94:8±8 peratus, 93:6±7 peratus, 100 ± 5 peratus, 103:9± 5 peratus, 126:1±8 peratus , dan 122:7±4 peratus pada 2.5, 5, 10, 25, 50, dan 100μM acteoside, masing-masing, berbanding dengan kawalan (100:02 ± 3 peratus ). Tambahan pula, untuk mengesahkan sitotoksisiti acteoside pada kondrosit tikus primer, ujian MTT dilakukan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2(b). Daya maju kondrosit tikus utama yang dirawat dengan 2.5, 5, 10, 25, 50, dan 100μM acteoside ditentukan sebagai 114 ± 4 peratus, 117:8±6 peratus, 123:9± 5 peratus, 132:6±4 peratus, 153:1± 7 peratus , dan 142:1±6 peratus , masing-masing berbanding dengan kawalan (100:4±5 peratus ). Tambahan pula, untuk mengesahkan kesan acteoside terhadap daya maju kedua-dua sel L929 dan kondrosit tikus primer, ujian Sel Hidup/Mati telah dilakukan seperti ditunjukkan dalam Rajah 2(c). Bilangan sel mati yang diwarnakan sebagai pendarfluor merah tidak meningkat untuk kedua-dua sel L929 dan kondrosit tikus primer yang dirawat dengan 50 dan 100μM acteoside selama 24 jam. Data ini secara konsisten menunjukkan bahawa dos yang ditentukan bagiacteosidetidak menjejaskan daya maju sel L929 dan kondrosit tikus primer. Oleh itu, 50μM acteoside dan 100μM acteoside, yang merupakan dos tidak toksik dalam kedua-dua sel L929 dan kondrosit tikus primer, telah digunakan untuk mengesahkan kesan antikataboliknya secara in vitro menggunakan kondrosit tikus primer.

3.2. Acteoside Mengatasi IL-1 -Kehilangan Proteoglycan Terinduksi dalam Kondrosit Tikus Utama.

Kondrosit tikus utama yang tertanam dalam manik alginat dirawat dengan 50 dan 100μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 1ng/mL IL- 1 selama 21 hari. Selepas itu, ujian DMMB dilakukan untuk menilai perubahan dalam kandungan proteoglikan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3(a). Kandungan proteoglycan relatif ditentukan sebagai 88:3±18:1 peratus dan 86:8±16:3 peratus dalam kondrosit tikus utama yang dirawat dengan 50 dan 100μM acteoside, masing-masing, berbanding dengan kawalan (103:8± 32:3 peratus ). Walaupun kandungan proteoglycan relatif telah dikurangkan oleh acteoside, keputusan ini tidak signifikan. Walau bagaimanapun, kandungan proteoglycan relatif berkurangan dengan ketara sebanyak 37:1± 14:7 peratus dalam kondrosit tikus utama yang dirawat dengan 1ng/mL IL-1 , tetapi 50 dan 100μM acteoside telah mengurangkan kandungan proteoglycan secara signifikan sebanyak 1257 ± . peratus dan 64 ± 14:5 peratus , masing-masing, dengan kehadiran 1ng/mL IL-1 . Selepas itu, untuk mengesahkan sama ada acteoside menyekat kehilangan proteoglycan yang disebabkan IL{36}}, rawan artikular yang dibedah daripada sendi lutut tikus dirawat dengan 100μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 7 hari. Selepas itu, penilaian histologi menggunakan pewarnaan H&E dan safranin-O dan pewarnaan hijau cepat telah dilakukan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3(b). Perubahan morfologi tidak diperhatikan menggunakan pewarnaan H&E; bagaimanapun, pewarnaan safranin-O dan hijau cepat mendedahkan bahawa proteoglycan yang diwarnakan sebagai warna merah tidak berubah dalam rawan artikular yang dirawat dengan 100μM acteoside berbanding dengan yang dalam kawalan. Walau bagaimanapun, kehilangan proteoglycan yang teruk disebabkan oleh 10ng/mLIL-1 dalam rawan artikular, dan 100μM acteoside secara signifikan menekan kehilangan proteoglikan dalam rawan artikular yang dirawat dengan 10ng/mL IL- 1 . Secara kolektif, data ini secara konsisten menunjukkan bahawa acteoside mempunyai kesan antikatabolik yang melambatkan degenerasi rawan artikular melalui mengatasi kehilangan proteoglikan akibat IL-1 -.

acteosidedalamcistanchemempunyai kesan yang baik terhadapantioksidan

3.3. Acteoside Mempunyai Kesan Anticatabolic Yang Menindas Ekspresi MMP dan Pengaktifan dalam Kondrosit Tikus Utama yang Dirawat dengan IL-1 .

Untuk menyiasat sama ada kesan antikatabolik yang disebabkan oleh acteoside dikaitkan dengan penindasan ekspresi dan pengaktifan MMP, kondrosit tikus primer dirawat dengan 50 dan 100μM acteoside dengan kehadiran atau ketiadaan 10ng/mL IL-1 selama 24 jam. Selepas itu, perubahan dalam MMP telah disiasat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4(a), walaupun ekspresi enzim merendahkan rawan seperti MMP-13, MMP-1 dan MMP-3 telah meningkat dengan ketara dalam media terkondisi tikus primer kondrosit yang dirawat dengan 10ng/mL IL-1 , ia dikurangkan sebanyakacteosidedalam cara yang bergantung kepada dos. Tambahan pula, keputusan kedua-dua qPCR (Rajah 4(b)) dan qRT-PCR (Rajah 4(c)) mendedahkan bahawa IL-1 telah meningkatkan tahap mRNA MMP dengan ketara seperti MMP-13, MMP{ {6}} dan MMP-3 dalam kondrosit tikus utama. Walau bagaimanapun, mereka mengurangkan dos bergantung pada kondrosit tikus utama yang dirawat dengan 50 dan 100μM acteoside. Selain itu, 50 dan 100μM acteoside berkesan menekan pengaktifan MMP dalam kondrosit utama tikus yang dirawat dengan 10ng/mL IL-1 (Rajah 4(d)). Diambil bersama, data ini secara konsisten menunjukkan bahawa acteoside mempunyai kesan antikatabolik yang menyekat ekspresi dan pengaktifan enzim yang merendahkan tulang rawan.