Dalam kajian ini, galactan exopolysaccharide (EPS) daripadaCistancheKR780676 telah dinilai untuk potensinya untukmengurangkan tekanan oksidatifmenggunakan ujian in vitro dan kajian in vivo, saccharomyces cerevisiae (jenis liar) danantioksidan(sod14, sod24, tsa14, cta2 dan ctt12)anti-apoptosis(pep4 dan fs14) dananti penuaan(sod24, tsa1, dan ctt12)) mutan penghapusan gen isogenik. Galactan mempamerkan DPPH yang kuat danaktiviti penghapusan nitrik oksidadengan nilai lCso masing-masing 450 dan 138 ug/mL. Dalam model mutan yis, tegasan oksidatif yang dijana oleh H,0. telah disingkirkan secara meluas oleh galaktan dalam medium seperti yang disahkan menggunakan ujian titik diikuti oleh pewarnaan DCF-DA pendarfluor dan kajian mikroskopik. Rawatan Galactan mengakibatkan pengurangan ROS yang dihasilkan dalam sel mutan yis seperti yang ditunjukkan oleh penurunan intensiti pendarfluor. Tambahan pula, galactan mempamerkan perlindungan terhadap kerosakan oksidatif melalui perencatan apoptosis yang disebabkan oleh H, O, dalam strain mutan yis (pep4 dan fs1) ​​yang membawa kepada peningkatan kadar kelangsungan hidup dengan meneutralkan tekanan oksidatif. Dalam ujian jangka hayat kronologi, sel WT yang dirawat dengan galactanEPS menunjukkan peningkatan 8 peratus dalam daya maju manakala mutan sod2 menunjukkan 10-15 peratus peningkatan yang menunjukkan kesan anti-penuaan yang ketara. Galactan dari W. confuse KR780676 mempunyai potensi besar untuk digunakan sebagai antioksidan semulajadi untuk aplikasi teknologi nutraseutikal, farmaseutikal dan makanan. Mengikut pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama mengenai penilaian mendalam sifat antioksidan in vivo EPS abakteria dalam sistem model pemadaman yis.

Klik untuk Menjadikan Cistanche Kaya Dengan EPS

Pengoksidaan adalah proses penting untuk mengekalkan proses biologi dan juga untuk penghasilan tenaga dalam semua organisma hidup. Radikal spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies nitrogen reaktif (RNS) dihasilkan daripada katabolisme normal molekul oksigen dan nitrogen masing-masing. Tekanan oksidatif yang teruk membawa kepada pelbagai keadaan degeneratif seperti kerosakan DNA, degenerasi selular dan karsinogenesis. Ini boleh mengakibatkan banyak masalah kesihatan sepertipenuaan, penyakit jantung, kanser, sirosis, aterosklerosis, kencing manisdan rheumatoid arthritis2-6, Antioksidan ialah molekul yang menghilangkan radikal bebas yang dijana dalam makanan atau sistem hidup dan membawa kepada pencegahan keadaan kesihatan yang berkaitan dengan kerosakan oksidatif-9. Walaupun banyak antioksidan sintetik tersedia sebagai pemusnah radikal yang kuat, sesetengah daripadanya telah dikaitkan dengan beberapa kesan sampingan yang tidak diingini. Memandangkan ini, terdapat peningkatan minat dan permintaan untuk antioksidan semula jadi dalam industri makanan dan farmasi. Kebanyakan polisakarida berasaskan tumbuhan dan cendawan telah dilaporkan sebagai agen pelindung yang ketara terhadap ROS11–21. Pelbagai eksopolisakarida mikrob (EPS) termasuk daripada bakteria asid laktik (LAB) juga telah dilaporkan untuk sifat antioksidannya yang besar. Ini dianggap sebagai alternatif yang lebih selamat daripada yang sintetik. Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, banyak EPS daripada LAB telah dikaji untuk potensi antioksidannya dan pencegahan kerosakan oksidatif22,23. Potensi antioksidan dan peranan perlindungan Weissella EPS juga telah dilaporkan daripada pelbagai EPS yang diasingkan daripada banyak strain Weissella seperti Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 dan W. cibaria SJ1424–29. Sifat antioksidan in vivo boleh dikaji menggunakan pelbagai sistem model seperti garisan sel30, C. elegans31, yis32, dan tikus33. Sebelum ini, pelbagai sebatian telah disaring untuk sifat antioksidannya yang berpotensi menggunakan sistem model mutan penghapusan gen yis Saccharomyces cerevisiae32,34–37.

Kajian ini tertumpu kepadapotensi antioksidan galaktan EPSdihasilkan oleh terikan probiotik Cistanche KR780676 daripada makanan ditapai tradisional India (adunan Idli)38,39. Dalam kertas ini, EPS galaktan disaring untuk potensi antioksidan in vitro menggunakan DPPH, nitrik oksida, dan ujian penghapusan radikal hidroksil dan antioksidan in vivo,anti-apoptosisdansifat anti-penuaanmenggunakan sistem model mutan penghapusan gen yis.

Bahan dan kaedah

Semua bahan kimia termasuk suplemen media diperoleh daripada Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., India, dan DCF-DA (2,7 Dichlorodihydrofuorescein diacetate) daripada Sigma.

Budaya mikrob.CistancheKR780676 yang diasingkan daripada makanan ditapai berasid India (adli Idli), dilaporkan menghasilkan galaktan EPS telah digunakan dalam kajian ini 38.

Pengesanan pengeluaran EPS. Pengeluaran EPS W. confusa diperhatikan dari peringkat koloni. Secara ringkas, terikan telah dibiakkan pada agar MRS (ditambah dengan 2 peratus sukrosa). Selepas 48 jam pada 30 darjah, rupa koloni berlendir/lendir diperhatikan. Pengeluaran EPS galaktan telah disahkan selanjutnya di bawah analisis mikroskop elektron pengimbasan (SEM).

Pengekstrakan EPS. Proses pengekstrakan EPS dilakukan mengikut kaedah yang diterangkan dalam Kavitake et al.38. Inokulum segar (10 peratus ) W. confusa telah ditambah kepada 2 peratus medium MRS dipertingkatkan sukrosa pada 30 darjah selama 48 jam dalam keadaan statik. Suspensi telah diempar dengan cara ini (12,000×g selama 15 min) untuk mengasingkan biojisim dan selanjutnya dirawat dengan asid trichloro asid untuk menghapuskan gugusan protein. Galaktan-EPS dimendakkan menggunakan etanol sejuk ais (tiga kali ganda isipadu), disentrifugasi (19,200×g selama 15 minit) dan EPS terhasil dilarutkan dalam air Milli-Q. EPS mentah telah didialisis pada 12-14 kDa (48 jam, 4 darjah) dan dikeringkan beku dengan lyophilization selama 48 jam.

Sifat antioksidan in vitro EPS galaktan. Ujian DPPH untuk galactan telah dilaksanakan mengikut laporan awal oleh Ye et al.9 dan peratus aktiviti scavenging ( peratus ) dikira dengan persamaan berikut.

di mana Ao dan As ialah penyerapan kawalan (kosong, tanpa EPS) dan sampel masing-masing. Ujian penghapusan radikal nitrik oksida (NO) untuk galaktan telah dilakukan mengikut Sreejayan et al.40 dan dikira seperti persamaan berikut,

di mana Ao ialah penyerapan kawalan (kosong, tanpa EPS) dan As ialah penyerapan dengan kehadiran EPS. Aktiviti pengurangan kuasa diukur untuk EPS galaktan seperti yang dilaporkan oleh Ye et al.9 . Serapan telah dibaca pada 700 nm dan potensi reduktif ditunjukkan oleh kapasiti penyerapan yang tinggi bagi campuran tindak balas. Asid askorbik (Vc) digunakan sebagai kawalan positif. Aktiviti penghapusan radikal hidroksil EPS galaktan dinilai seperti yang diterangkan oleh Yang et al.41. Penyerapan dibaca pada 536 nm dan peratusan penghapusan dikira sebagai:

di mana Sampel ialah penyerapan sampel, Kosong ialah penyerapan tanpa ketiadaan sampel dan larutan H2O2, dan kawalan ialah penyerapan tanpa kehadiran sampel.

Sifat antioksidan in vivo EPS galaktan dalam strain mutan yis.

Ragi, S. cerevisiae, BY4741 jenis liar (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆), dan strain mutan penghapusan gen diperoleh daripada Thermo Fisher Scientific, Amerika Syarikat. Strain yis telah ditanam dalam medium yis peptone dextrose (YPD) ditambah dengan atau tanpa 200 µg/mL Geneticin (G418 sulfate) untuk pemilihan mutan. Medium pepejal YPD disediakan dengan penambahan 2 peratus agar Bacto ke dalam medium cecair YPD42.

Kesan EPS pada pertumbuhan yis. Kultur jenis liar yis (WT) yang berkembang pesat (kira-kira 1× 104 sel) telah dirawat dengan kepekatan berbeza (0–400 ug/mL) EPS dalam plat microwell dan volum akhir dibuat sehingga 200 μL dengan kuah YPD. Kultur diinkubasi selama 18 jam pada 30 darjah diikuti dengan pencairan bersiri dan merebak pada plat agar YPD. Plat telah diinkubasi pada 30 darjah selama 2 hari dan unit pembentuk koloni (CFU) dikira dan daya maju dinyatakan sebagai peratus CFU43.

Pengukuran biomarker tekanan oksidatif. Sel WT yis yang tumbuh secara eksponen telah dirawat terlebih dahulu dengan atau tanpa 300 ug/ml EPS selama 2 jam. Sepuluh sel telah terdedah kepada 1 mM H2O2 selama 1 jam pada 30 darjah dalam inkubator shaker dan diproses untuk pengukuran aktiviti SOD dan tahap peroksidasi lipid mengikut kaedah yang diterangkan dalam laporan terdahulu44-46

Sifat antioksidan EPS dalam mutan penghapusan gen S. cerevisiae.

Kultur yis WT dan strain mutan kekurangan antioksidan yang berkembang pesat (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆, dan yhb1∆) dirawat dengan 300 ug/mL EPS selama 2 jam diikuti dengan pendedahan 1 mM H2O2 selama 1 jam. Sel yang dicairkan secara bersiri disebarkan pada plat agar YPD, diinkubasi selama 2 hari pada 30 darjah, dan daya maju dikira. Untuk ujian titik, kultur dicairkan secara bersiri dalam 10-lipatan, 4 μL daripadanya dikesan pada plat agar YPD dan diinkubasi pada suhu 30 darjah selama 2 hari dan diambil gambar43,47. Pengesanan dan pengukuran ROS. Strain mutan WT dan kekurangan antioksidan yang berkembang pesat (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, dan ctt1∆) telah dirawat terlebih dahulu dengan atau tanpa EPS selama 2 jam dan terdedah kepada 1 mM H2O2 selama 1 jam pada 30 darjah. Pelet sel selepas sentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 minit dibasuh dua kali dengan penimbal PBS, digantung semula dalam 200 μL PBS, dan diinkubasi dengan 20 μM DCF-DA dalam gelap selama 15-20 minit pada suhu bilik. Sejurus selepas pengeraman, sel telah dibasuh dua kali dengan PBS, dipasang pada slaid dan diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor Olympus Ix71 di bawah 40 × objektif menggunakan penapis biru. Untuk kuantifikasi ROS, sel bernoda DCF DA telah digantung semula dalam 200 μL PBS selepas dicuci dan keamatan pendarfluor DCF diukur menggunakan spektrofluorometer pada maksimum pengujaan dan panjang gelombang pelepasan 495/529 nm. Unit pendarfluor telah diplot terhadap setiap budaya yang dirawat dan tidak dirawat dan dibandingkan48,49.

Aktiviti anti-apoptosis galaktan.

Ujian titik dan CFU. Sel-sel mutan WT dan anti-apop-totik-defisit (pep4∆ dan fs1∆) yang tumbuh secara eksponen telah dirawat dengan EPS dan diinkubasi bersama-sama dengan kawalan yang tidak dirawat selama 2 jam. Untuk kiraan CFU, kultur telah dirawat atau tidak dirawat dengan EPS selama 2 jam dan diinkubasi dengan 0.5 mM H2O2 selama 1 jam. Setiap budaya yang dicairkan secara bersiri disebarkan pada plat agar YPD, dan diinkubasi pada 30 darjah selama 2 hari dan daya maju sel diwakili sebagai peratus CFU. Untuk ujian titik, kultur dibenarkan untuk pencairan bersiri diikuti dengan tompok pada plat agar YPD dengan atau tanpa 1 mM H2O2. Plat diinkubasi pada suhu 30 darjah selama 2 hari dan diambil gambar47.

Pengesanan penanda anti-apoptosis EPS

menggunakan strain mutan yis. Untuk mengesahkan lagi tindakan menyelamat EPS pada sel yis daripada kematian sel apoptosis yang disebabkan oleh hidrogen peroksida dalam yis, WT dan strain mutan kekurangan anti-apoptosis (pep4∆ dan fs1∆) telah diperiksa untuk penanda apoptosis. Sel WT, pep4∆, dan fs1∆ yang berkembang pesat telah dirawat atau tidak dirawat dengan 300 µg/mL EPS selama 2 jam dan kemudian didedahkan kepada 1 mM H2O2 selama 1 jam. Kedua-dua sel yang dirawat dan tidak dirawat telah diwarnai dengan oren acridine dan etidium bromida (AO/EB) dan diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor untuk pemeluwapan kromatin50,51. Untuk pewarnaan DAPI, sel yang dirawat dan tidak dirawat telah ditetapkan dengan 4 peratus paraformaldehid dan diinkubasi dengan 1 ug / mL DAPI selama 5-10 minit dalam gelap pada suhu bilik. Sel telah dipasang pada slaid selepas dibasuh dengan PBS dan diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor Olympus IX71 (penapis UV, objektif 40 ×) untuk pemecahan nuklear52,53.

Kesan anti-penuaan EPS oleh ujian jangka hayat kronologi.

Kultur mutan jenis liar yis dan kekurangan antioksidan (sod2∆, tsa1∆, dan ctt1∆) telah ditanam untuk mencapai fasa pegun dan diinkubasi dengan atau tanpa EPS untuk ujian jangka hayat kronologi (CLS). Kebolehmandirian setiap strain dikira pada selang masa berbeza dari 0 hingga 30 hari. Daya maju sel dinyatakan sebagai peratus CFU untuk kedua-dua kultur yang dirawat dan tidak dirawat54,55. Analisis statistik. Semua eksperimen telah dijalankan dalam tiga kali ganda (± SD) dan dianalisis secara statistik menggunakan perisian IBM SPSS 20 dalam model ANOVA sehala. Ujian perbandingan HSD Tukey (m.s<0.05) was used to measure the significance level. 

Keputusan dan perbincangan Bakteria asid laktik (LAB) yang diasingkan daripada makanan yang ditapai telah mendapat perhatian besar ahli teknologi makanan sejak beberapa tahun kebelakangan ini kerana sifat probiotiknya yang terbukti. Antara bakteria yang diasingkan daripada makanan yang ditapai India ialah Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. dan Weisella spp yang kurang diterokai. Seperti LAB berfaedah yang lain, terikan Cistanche KR780676 yang diasingkan daripada adunan idli yang ditapai dalam makmal kami telah dilaporkan bertindak sebagai calon probiotik yang berpotensi39. Laporan terdahulu, galaktan ini telah dicirikan sebagai homopolisakarida linear dan juga disaring untuk sifat fizikokimia, fungsian dan pengemulsinya38,56–58. Kami juga telah melaporkan bahawa sel dan supernatan sel W. confusa KR780676 menunjukkan aktiviti anti-oksidan yang kuat39. Pengeluaran EPS dari W. confusa KR780676 diperhatikan pada plat agar MRS yang diperkaya dengan sukrosa 2 peratus, diinkubasi selama 48 jam (Rajah 1A-i), yang mendedahkan koloni berlendir Weissella dan ia disahkan selanjutnya dalam imej SEM (koloni Weissella) menunjukkan kehadiran EPS galaktan bersama sel (Rajah 1A-ii). Pengeluaran EPS langkah demi langkah ditinjau secara keseluruhan dengan perwakilan bergambar dalam Rajah 1B.

Sifat antioksidan in vitro EPS galaktan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, aktiviti scavenging DPPH diperhatikan bergantung kepada kepekatan, aktiviti scavenging meningkat dengan kepekatan galaktan. Kepekatan berkesan separuh maksimum (IC50) asid askorbik ialah 8.8 µg/mL, manakala EPS galaktan ialah 450 µg/mL. 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) ialah radikel bebas yang stabil yang menyahlokasi elektron tidak berpasangan terhadap molekul secara keseluruhan, sekali gus menghalang molekul daripada dimerisasi dan menghasilkan warna ungu dalam59. Apabila larutan DPPH ditambah kepada kepekatan yang berbeza (50 hingga 500 µg/mL) galaktan, ia menimbulkan pengurangan warna ungu apabila kepekatan meningkat. Antioksidan apabila bertindak balas dengan elektron DPPH, warna ungu dalam DPPH bertukar kepada warna ungu muda; dan keamatan warna bergantung kepada aktiviti antioksidan substrat60. Galactan menunjukkan 60 peratus potensi penghapusan DPPH yang lebih tinggi daripada EPS daripada bakteria endofit Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Nitrik oksida terhasil apabila natrium nitroprusside terurai dalam larutan akueus pada pH 7.2. Nitrat dan nitrit dihasilkan dalam keadaan aerobik apabila nitrik oksida mengikat dengan oksigen61. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2B, galaktan mempunyai potensi untuk mengurangkan penjanaan nitrik oksida daripada natrium nitroprusside kerana kepekatan berkesan separuh maksimum (IC50) ialah 138 µg/mL, manakala asid askorbik piawai ialah 11 µg/mL. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2C, aktiviti kuasa pengurangan EPS dikaitkan secara positif dengan kepekatannya dalam susunan yang semakin meningkat. Piawai (asid askorbik) menunjukkan kapasiti pengurangan yang lebih tinggi daripada EPS galaktan yang selaras dengan Ye et al.9 . Aktiviti pengurangan kuasa galaktan menunjukkan potensi aktiviti antioksidan. Apabila kalium ferricyanide [K3Fe (CN)6] ditambah dalam galaktan EPS, antioksidan yang terdapat di dalamnya berkurangan menjadi kalium ferricyanide [K4Fe(CN)6]

Rajah 2. Sifat antioksidan in vitro galaktan. (A) Aktiviti scavenging radikal DPPH, (B) Ujian oksida nitrik, (C) Ujian kuasa mengurangkan dan (D) Aktiviti scavenging radikal hidroksil EPS galaktan.

Aktiviti penghapusan radikal hidroksil galaktan ditunjukkan dalam Rajah 2D. Galactan menunjukkan 41.93 peratus sebagai aktiviti tertinggi, manakala 58.10 peratus mengikut piawai pada kepekatan yang sama (1 mg/mL). Aliran keputusan adalah selaras dengan laporan sebelumnya untuk EPS daripada Lactobacillus plantarum C88 (85.21 peratus untuk kepekatan 4 mg/mL EPS)62 dan Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68.55 peratus untuk kepekatan 1 mg/mL EPS)63. Berbanding dengan standard, galactan menunjukkan kecekapan 72.16 peratus manakala EPS daripada Lactobacillus plantarum C8862 dan Paenibacillus polymyxa EJS-363 masing-masing menunjukkan kecekapan 95.19 dan 68.55 peratus.

Sifat antioksidan in vivo EPS galaktan dalam model yis. Laporan terdahulu telah menunjukkan sifat biologi yang menggalakkan kesihatan berbeza seperti anti-proliferatif, anti-ulser, penurun kolesterol, antioksidan, anti-radang dan aktiviti imunomodulator EPS yang diperolehi daripada LAB64. Dalam pandangan ini, menjadi penting untuk menilai kesan antioksidan terperinci oleh EPS yang boleh menyokong potensi prebiotik dan/atau probiotik mereka, terutamanya untuk mengekalkan homeostasis usus dengan mengurangkan tekanan oksidatif. Jentera anti-oksida selular memainkan peranan penting dalam mengurangkan ROS yang tidak dapat dielakkan yang dihasilkan melalui laluan metabolik selular yang penting. Ketidakseimbangan antara pertahanan antioksidan semula jadi sel dan ROS yang dihasilkan boleh menjadi sangat memudaratkan sel. Tekanan oksidatif yang teruk menyebabkan potensi kerosakan pada komponen penting selular, protein, asid nukleik dan molekul lipid yang seterusnya menjejaskan banyak laluan isyarat penting, dan mendorong apoptosis. Pengambilan diet antioksidan telah ditunjukkan untuk mengurangkan kekerapan penanda kerosakan selular seperti tahap ROS, kerosakan DNA pengantara ROS, apoptosis dan transformasi selular yang seterusnya mengakibatkan penurunan insiden gangguan berkaitan umur65 EPS Mikrob seperti xanthan dan levans. telah menunjukkan aktiviti anti-oksidan dalam ujian in vitro (ujian radikal DPPH dan hidroksil)5 dan terhadap sel kanser gastrik manusia BGC-823, masing-masing66. Sebelum ini, Dalam kajian ini, kami menilai kesan antioksidan, antiapoptosis dan antipenuaan yang dikenakan oleh galaktan EPS yang diasingkan daripada W. confusa KR780676 menggunakan yis Saccharomyces cerevisiae BY4741 sebagai organisma model.

Kesan EPS pada pertumbuhan yis. Sel yis jenis liar yang dirawat dengan kepekatan EPS yang berbeza tidak menunjukkan sebarang kecacatan pertumbuhan yang mengesahkan bahawa galaktan tidak menyebabkan sebarang sitotoksisiti atau kecacatan pertumbuhan pada mana-mana kepekatan antara 0 hingga 400 ug/mL (Rajah 3A). ). Sel-sel yang dirawat dengan 300 ug/mL atau kepekatan galaktan yang lebih tinggi menunjukkan pertumbuhan yang ketara lebih tinggi menunjukkan bahawa galaktan mempunyai aktiviti rangsangan pertumbuhan yis.

Kepekatan galaktan 300 ug/mL digunakan untuk eksperimen seterusnya dengan strain yis. Galactan mengurangkan aktiviti enzim SOD. Berikutan aktiviti antioksidan in vitro yang kuat yang ditunjukkan oleh galaktan EPS, selanjutnya tertakluk kepada pemeriksaan kesannya terhadap aktiviti SOD dalam sel WT yis. Keputusan kami (Rajah 3B) menunjukkan bahawa tekanan oksidatif yang disebabkan oleh rawatan H2O2 menyebabkan peningkatan mendadak dalam aktiviti SOD bagi sel WT yang dirawat H2O2-berbanding dengan sel yang tidak dirawat. Sebaliknya, pra-rawatan galaktan sel WT diikuti dengan pendedahan kepada H2O2 mengakibatkan pengurangan sebanyak dua kali ganda dalam aktiviti SOD berbanding sel yang dirawat oleh H2O2 sahaja yang menunjukkan galaktan membantu sel yis dalam menguruskan oksidatif yang disebabkan oleh radikal superoksida. tekanan47,67.

Tekanan oksidatifdisebabkan oleh rawatan peroksida mengaktifkan enzim superoksida dan perubahan dalam tahap aktiviti SOD adalah ukuran langsung tahap tekanan oksidatif selular. Dalam kajian ini, kaedah pengurangan NBT digunakan, di mana, NBT adalah penunjuk pengeluaran radikal superoksida. Perencatan pengurangan NBT adalah ukuran langsung SOD. Oleh kerana SOD bersaing dengan NBT untuk radikal superoksida yang dihasilkan dengan mendedahkan riboflavin kepada cahaya yang boleh dilihat dengan kehadiran oksigen dan metionin, yang merupakan penderma elektron. Superoksida mengurangkan NBT kepada produk warna biru, formazan yang boleh diukur secara kolorimetrik pada 560 nm.

Laporan sebelumnya menunjukkan bahawa LAB EPS telah memberikan kesan antioksidan dalam cara yang bergantung kepada kepekatan dalam ujian in vitro, dan dalam garisan sel kanser kolon dan model in vivo. Keupayaan EPS untuk mengais ROS mungkin dikaitkan dengan kumpulan kimia mereka yang pelbagai68. Lain-lain EPS (500 µg/ml) daripada Bacillus amyl liquefacient telah terbukti sangat mempengaruhi aktiviti SOD dan melindungi sel HepG2 daripada tekanan oksidatif yang disebabkan oleh H2O2 68. Begitu juga, EPS daripada L. plantarum menunjukkan kesan yang bergantung kepada kepekatan pada aktiviti SOD dalam sel Caco2 terhadap tekanan oksidatif akibat H2O2-69. Keputusan kami, selaras dengan laporan ini menunjukkan bahawa pra-rawatan EPS galactan menghilangkan radikal superoksida yang disebabkan oleh rawatan H2O2 dalam sel WT yis.

EPS mengurangkan peroksidasi lipid selular. Malondialdehid (MDA) ialah biomarker peroksidasi lipid selular yang paling banyak dikaji yang menunjukkan tahap tekanan oksidatif. MDA ialah dialdehid yang stabil dari segi kimia, sangat reaktif dan boleh mengikat dengan mudah kepada protein, asid nukleik dan lipoprotein. Ia sangat mutagenik dan boleh menjejaskan sifat biokimia biomolekul ini yang memudaratkan pelbagai laluan isyarat70. Peningkatan tahap MDA adalah penunjuk kerosakan tisu yang disebabkan oleh ROS dan tahap peningkatannya dikesan dalam beberapa patologi manusia46. Dalam kajian ini, untuk mengkaji bagaimana pra-rawatan EPS mempengaruhi peroksidasi lipid yang disebabkan oleh H2O2 dalam sel WT yis, tahap MDA dianggarkan. Keputusan menunjukkan lebih kurang 1.5- pengurangan tahap MDA dalam sel pra-rawatan EPS, berbanding dengan yang terdedah kepada H2O2 sahaja seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3C.

Sebelum ini, EPS daripada L. plantarum C88 telah ditunjukkan untuk mengurangkan tahap MDA yang disebabkan oleh rawatan H2O2, dalam cara yang bergantung kepada dos (50-200 ug/ml) dalam sel Caco2, menunjukkan bahawa kecederaan membran yang disebabkan oleh peroksida pada sel usus. boleh dikurangkan dengan suplemen EPS69 (zhang 2013). Selanjutnya, 500 ug/mL EPS daripada B. amyloliquefaciens telah mengurangkan dengan ketara MDA{12}}H2O dalam sel HepG271. Keputusan kami pada tahap MDA tercetus H2O2-dalam sel yis dan pengurangan ketara berikutan pra-rawatan sel dengan EPS galaktan menunjukkan bahawa rawatan dengan EPS galaktan mengurangkan peroksidasi lipid akibat ROS selular dan seterusnya, boleh melindungi sel daripada kerosakan tisu yang disebabkan oleh radikal peroksida dan membantu dalam mengekalkan integriti selular

eksperimen. *mewakili P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galactan melindungi mutan gen antioksidan yis di bawah tekanan oksidatif. Untuk menilai keupayaan antioksidan galaktan, mutan yis kekurangan gen antioksidan yang berbeza (yang tidak mempunyai pelbagai gen tindak balas tekanan oksidatif) telah dirawat dengan galaktan dan kemudian didedahkan kepada dos sub-mematikan H2O2 42. SOD (sod1∆ dan sod2∆), katalase (cta1∆ dan ctt1∆), thioredoxin peroxidase (tsa1∆), glutathione reductase (glr1∆), dan nitric oxide oxidoreductase (yhb1∆) mutan apabila dirawat dengan H2O2. menunjukkan kemandirian yang rendah (sod1∆ 10.8 peratus, sod2∆ 13.17 peratus, tsa1∆ 13.55 peratus, cta1∆ 15.34 peratus, ctt1∆ 17.06 peratus, glr1∆ 27.37 peratus dan yhb) 33.T∆ yhb Sebaliknya, dengan pra-rawatan galaktan, toleransi terhadap tekanan oksidatif meningkat dalam semua mutan kekurangan gen antioksidan dan daya majunya meningkat dengan ketara (sod1∆ 78.43 peratus , sod2∆ 59.96 peratus , cta1∆ 87 peratus , ctt1∆ 187 peratus , tsa ∆ 72.73 peratus , glr1∆ 75.26 peratus dan yhb1∆ 82.41 peratus ) seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A. Keputusan ini menunjukkan bahawa galactan boleh menghilangkan radikal bebas yang disebabkan oleh H2O2 dengan berkesan dalam mutan yang tidak mempunyai gen tindak balas tekanan oksidatif khusus dan melindungi sel daripada tekanan oksidatif. Perlindungan yang sama diperhatikan dalam ujian tempat, di mana galactan menyelamatkan mutan daripada tekanan oksidatif dan meningkatkan daya maju seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4B.

Sel-sel telah berkembang dengan sistem pertahanan antioksidan enzimatik untuk menahan tekanan oksidatif endogen yang disebabkan oleh ROS yang dihasilkan melalui pelbagai tindak balas fisiologi, yang sebaliknya akan mempunyai kesan yang merosakkan ke atas kesejahteraan sel. Laporan terdahulu dan keputusan kami dalam kajian ini mencadangkan bahawa EPS dapat menghilangkan ROS dan meningkatkan daya maju sel. Keputusan kami dengan strain mutan tindak balas tegasan oksidatif yis mencadangkan bahawa rawatan EPS galactan menghilangkan kedua-dua radikal superoksida sitosol dan mitokondria yang disebabkan oleh rawatan H2O2, seperti yang dibuktikan oleh peningkatan daya maju yis sod1∆ dan sod2∆ strain mutan masing-masing. SOD adalah pertahanan antioksidan enzimatik utama dalam sel terhadap tekanan oksidatif endogen dan eksogen dan mutasi dalam gen ini telah terlibat dalam kanser dan gangguan degeneratif. Begitu juga, penyelamatan antioksidan cta1∆ dan ctt1∆ (mutan katalase) oleh rawatan EPS menunjukkan bahawa rawatan dengan EPS galaktan memberikan perlindungan terhadap tekanan oksidatif peroksisom dan sitosolik yang disebabkan oleh H2O2. Catalase bertanggungjawab untuk detoksifikasi selular hidrogen peroksida dan kekurangannya dikaitkan dengan permulaan gangguan berkaitan usia. TSA1, thioredoxin peroxidase adalah protein sitoplasma yang berkaitan ribosom dan bebas yang melegakan sel daripada tekanan hidrogen peroksida. Laporan mencadangkan bahawa TSA1 juga mempunyai peranan dalam pembaikan kerosakan DNA oksidatif. Keputusan kami mencadangkan bahawa rawatan EPS menyelamatkan sel tsa1∆ yis daripada tekanan yang disebabkan oleh peroksida. Peroksiredoxin mamalia mempunyai kesan positif terhadap pertumbuhan sel, metabolisme, dan fungsi imun. Kekurangan mereka mengakibatkan tekanan oksidatif selular yang tinggi yang menjejaskan laluan isyarat penting dan terlibat dalam gangguan neurodegeneratif, keganasan dan penyakit radang 72. Mekanisme antioksidan glutation ialah satu lagi sistem pertahanan antioksidan enzimatik barisan pertama yang terdapat dalam sel untuk mengatasi tekanan oksidatif. GLR1 ialah homolog yis mamalia glutathione reductase, menyetempat kepada kedua-dua sitosol dan mitokondria73. Glr mengurangkan glutathione teroksida (GSSH) kepada glutation terkurang (GSH) dan memainkan peranan dalam mengekalkan tahap GSH dalam sel yang seterusnya menyahtoksik radikal superoksida dan hidroksida, dengan itu melindungi sel daripada tekanan oksidatif74. Keputusan kami menunjukkan sensitiviti tinggi yis glr1∆ kepada H2O2 yang telah dikurangkan dengan pra-rawatan dengan EPS galactan yang menunjukkan bahawa EPS galactan mungkin melindungi sel-sel yang kekurangan GLR1 daripada tekanan oksidatif. Menariknya, kekurangan glutathione reduktase telah dikaitkan dengan penuaan dan gangguan metabolik, degeneratif dan kardiovaskular yang berkaitan dengan usia75,76. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, yhb1∆ juga dilindungi oleh EPS galaktan terhadap tekanan H2O2 yang menunjukkan bahawa EPS galaktan melindungi sel-sel yang kekurangan YHB1 daripada tekanan oksidatif. Yis YHB1 ialah hemoglobin kegemaran yang telah dilaporkan melindungi sel daripada tekanan nitrik oksida77 dan tekanan oksidatif78. Bukti menunjukkan bahawa homolog manusia YHB1 nampaknya menyelamatkan sel daripada ketoksikan alpha-synuclein yang merupakan biomarker penyakit Parkinson79. Penemuan terdahulu dan keputusan kami menunjukkan bahawa EPS boleh menggalakkan kelangsungan hidup sel terhadap perkembangan gangguan degeneratif.

Untuk menilai tahap ROS dalam mutan yis dengan kehadiran dan ketiadaan galaktan di bawah tegasan H2O2, sel yis diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor dan tahap pengoksidaan intraselular dikira dengan spektrofuorometer47,48. Mutan yis yang dirawat dengan H2O2 sahaja menunjukkan lebih banyak sel fuoresen hijau berbanding dengan yang pra-rawatan dengan galaktan. (Gamb. 4C). Keamatan pendarfluor DCF meningkat lebih kurang 60 peratus , manakala dengan pra-rawatan galaktan, ia berkurangan kepada kira-kira 30 peratus dalam mutan yis yang dirawat H2O2-berbanding dengan WT dan kawalan masing-masing (Rajah 4D). Kedua-dua keputusan mikroskopik dan spektrofotometri menunjukkan peningkatan tahap ROS dalam sel yang kekurangan gen antioksidan tertentu berbanding kawalan masing-masing. Kultur pra-rawatan dengan galaktan dan kemudian terdedah kepada H2O2 menunjukkan pendarfluor yang berkurangan berbanding dengan kultur tanpa pra-rawatan galaktan yang menunjukkan bahawa galactan mengurangkan pendedahan induksi ROS H2O2 dalam sel mutan yis dan menggalakkan kemandirian sel. Dalam semua eksperimen di atas, apabila sel-sel dibasuh sebelum penambahan H2O2 tidak menunjukkan penyelamatan yang ketara (data tambahan) yang menunjukkan bahawa ROS scavenging oleh galaktan adalah disebabkan oleh scavenging langsung dalam medium dan bukannya dalam tindakan intraselular.