Frekuensi Optogenetik Perebutan Ayunan Theta Hippocampal Memecahkan Pengambilan Memori Bekerja Daripada Kod Ruang Hippocampal Bahagian 3

Rentak optogenetik neuron MS membawa kepada penyegerakan theta bukan fisiologi

Yang menghairankan, rangsangan optogenetik 8 Hz yang dikaitkan dengan rentak ayunan theta membawa kepada penurunan prestasi apabila digunakan semasa sama ada pengekodan atau pengambilan memori episod dalam tugas NPOR, serta pengambilan memori kerja spatial dalam tugas DNMTS. Untuk lebih memahami kesan pacing theta pada hippocampalphysiology, kami menganalisis penguncian fasa ayunan theta sebelum dan semasa rangsangan optogenetik 8 Hz (Tambahan Rajah 7a) dan mendapati bahawa rangsangan tersebut membawa kepada peningkatan segerak fasa merentas zaman rangsangan (Tambahan Rajah 7b). Tambahan pula, kami menganalisis korelasi silang ayunan theta merentasi dorsal CA1 (~ 1 mm jarak antara elektrod di sepanjang paksi septotemporal (Tambahan Rajah 7c) dan mendapati bahawa rentak irama theta pada 8 Hz membawa kepada korelasi silang yang meningkat antara kedua-dua elektrod tersebut ( Tambahan Rajah 7d).

Genetik ialah sains yang mengkaji pewarisan dan variasi genetik, dan ingatan merupakan aspek yang sangat membimbangkan. Jadi, apakah kaitan genetik dengan ingatan? Artikel ini akan meneroka isu yang berkaitan dengan ingatan dari perspektif genetik.

Pertama sekali, kita tahu bahawa gen genetik adalah asas kepada perkembangan fizikal dan intelek manusia, dan sama ada gen ini lebih unggul akan menjejaskan ingatan manusia. Kajian terbaru menunjukkan bahawa IQ dan ingatan manusia dipengaruhi oleh faktor genetik. Penyelidikan menunjukkan bahawa gen genetik memainkan peranan penting dalam kecerdasan dan ingatan. Oleh itu, sesetengah orang dilahirkan dengan ingatan yang lebih kuat, manakala yang lain perlu bekerja keras dan berlatih untuk meningkatkan daya ingatan mereka.

Kedua, faktor persekitaran juga merupakan faktor penting dalam perkembangan ingatan. Kita bukan sahaja memerlukan sokongan gen genetik tetapi juga perlu meningkatkan ingatan melalui latihan saintifik dan tabiat hidup yang baik. Sebagai contoh, kita boleh bertegas untuk bersenam setiap hari, mendapat tidur yang cukup, mengikut prinsip pemadanan makanan, dsb., yang boleh membantu meningkatkan fungsi otak dan ingatan kita.

Akhir sekali, orang biasa, jangan terlalu menekankan pengaruh faktor genetik terhadap perkembangan ingatan. Kerana faktor genetik tidak mutlak, ingatan dan kecerdasan manusia masih boleh memperbaiki diri mereka dengan meningkatkan usaha dan latihan mereka. Kita harus sentiasa mengekalkan sikap pembelajaran yang positif dan berterusan, dan sentiasa meneroka dan mengembangkan potensi ingatan kita. Saya percaya bahawa hanya dengan cara ini kita boleh menjadi lebih bijak dan mempunyai rasa pencapaian yang lebih besar. Kesimpulannya, hubungan antara genetik dan ingatan adalah sangat rapat, tetapi kita tidak harus terlalu menekankan faktor genetik, tetapi harus sentiasa meningkatkan ingatan dan kecerdasan kita melalui peningkatan diri dan latihan.

Dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan. Cistanche deserticola boleh meningkatkan daya ingatan dengan ketara kerana Cistanche deserticola ialah bahan perubatan tradisional Cina dengan banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan daging cincang berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik tahu 10 cara untuk meningkatkan ingatan

Perbincangan

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neuron semasa melakukan rangsangan optogenetik neuron MS dengan resolusi subsaat untuk mengawal irama theta dan menilai peranannya dalam fisiologi dan ingatan hippocampal. Yang penting, dengan menggunakan opsin penguja dan sama ada rangsangan atau rangsangan 8 Hz, kami masing-masing dapat menghapuskan atau mempercepatkan theta hippocampal secara konsisten dan teguh.

Berbanding dengan perencatan MS menggunakan sama ada sebatian orfarmakologi opsin perencatan (cth muscimol), pendekatan kami membolehkan perbandingan awithin-subjek dua keadaan bertentangan (paced vs abolishedtheta) sambil mengekalkan tahap aktiviti dalam sel MS-PV. Kami menggabungkan tugasan trek linear yang dicurahkan yang, bersama-sama dengan pendekatan teori maklumat, membolehkan kami merungkai kod hippocampal spatial dan temporal. Kaedah ini mengurangkan keperluan untuk ambang sewenang-wenangnya, membolehkan pendekatan piawai untuk imaginanalis kalsium. Walaupun sebahagian besar neuron piramid CA1 menyatakan campuran kod spatiotemporal, kami memfokuskan analisis kami pada neuron yang disesuaikan secara khusus pada tempat, masa atau jarak perjalanan.

Walaupun pengekodan spatial telah disiasat secara meluas dalam CA1, kod temporal dan jarak baru-baru ini mendapat lebih banyak minat. Kod temporal28,35–37 dan jarak37 telah diekstrak dengan isyarat clampingvisuospatial atau diekstrak secara analitik menggunakan model linear umum dalam paradigma realiti maya26,27,38. Di sini, kami mencadangkan pendekatan untuk merungkai kod spatial, temporal dan jarak menggunakan pendekatan teori maklumat yang, bersama-sama dengan tugas pertukaran isyarat kami, membolehkan analisis kod berganda spatiotemporaland dunia sebenar dalam haiwan yang bergerak bebas. Sebilangan besar neuron CA1piramidal menyandikan maklumat berbilang lokasi, jarak dan masa seperti yang dilaporkan sebelum ini26,27,38 sebagai tambahan kepada isyarat gerak sendiri seperti pecutan, kelajuan dan orientasi60.

Kami mendapati bahawa perebutan frekuensi dan rangsangan optogenetik 8 Hz secara drastik memansuhkan atau mempercepatkan irama theta, masing-masing, dan membawa kepada penurunan aktiviti keseluruhan dalam subpopulasi sel piramid CA1 sambil tidak menyebabkan perubahan ketara dalam aktiviti sel tempat, sama seperti laporan sebelumnya menggunakan sama ada perencatan farmakologi36, 46,47 atau optogenetik9,48 pacing MS atau input septum ke hippocampus. Memandangkan neuron MS dikenali sebagai pemacu utama ayunan hippocampal, kami menjangkakan bahawa rangsangan MS akan dikaitkan dengan aktiviti sel masa atau jarak yang terganggu dalam keadaan irama theta yang berkurangan, tetapi tiada perubahan berlaku apabila theta dimansuhkan atau bergerak. Selain itu, rentak ayunan hippocampal kepada 8 Hz tidak membawa kepada perubahan dalam kualiti kod spatial seperti yang dilaporkan sebelum ini9 dan tidak mengubah kod temporal seperti yang diperhatikan dalam paradigma tingkah laku kami.

Walaupun dilaporkan bahawa sel masa (tetapi bukan tempat) boleh bergantung secara langsung pada input korteks entorhinal medial (MEC)61, bukti eksperimen terkini menunjukkan bahawa lesi MEC tidak membawa sebarang perubahan dalam fisiologi sel masa hippocampal62. Terutama, penyiasatan baru-baru ini mendapati bahawa pacing optogenetik MS tidak mengganggu kod spatial sel grid dalam entorhinalcortex63, seterusnya menunjukkan bahawa aktiviti MS tidak terlibat secara langsung dalam kod spatial dalam pembentukan hippocampal. Bersama-sama dengan keputusan anda, ini menunjukkan bahawa kod temporal boleh sama ada hasil pengiraan yang bergantung kepada MS dalam entorhinalcortex63 (1) atau dijana secara intrinsik dalam hippocampusself (2).

Walaupun kajian awal mendapati bahawa MS memainkan peranan penting dalam mengekalkan sel masa dan menyokong memori kerja36, bukti eksperimen terkini menunjukkan bahawa sumbangan tepat sel masa kepada prestasi memori bekerja mungkin kurang daripada yang difikirkan sebelumnya62. Memandangkan neuron MS-PV berkemungkinan mengekalkan tahap aktiviti yang ketara semasa stimulasi optogenetik perebutan frekuensi (berbeza dengan pendekatan perencatan), keputusan kami sangat menyokong peranan aktiviti septum yang dimasa dengan tepat dalam menyokong memori kerja, yang diasumsikan sebelum ini. Walaupun kami memerhatikan prestasi ingatan yang berkurangan apabila menggunakan rangsangan optogenetik semasa pengambilan, rangsangan semasa fasa pengekodan tugas DNMTS tidak dikaitkan dengan pengurangan memori dalam tugas DNMTS. Pergerakan taosilasi pada 8 Hz semasa sama ada fasa pengekodan atau pengambilan semula tugas NOPR menyebabkan pengambilan semula ingatan terjejas. Analisis elektrofisiologi kami selanjutnya mendedahkan bahawa rangsangan sedemikian menyebabkan kawasan jauh CA1 dorsal terperangkap pada fasa yang sama, dengan penguncian bukan fasa fisiologi. Walaupun kami tidak menyiasat secara langsung hubungan sebab akibat antara perubahan fasa dan prestasi ingatan, pemasaan pancang, dan presesi fasa juga didapati dikaitkan dengan fungsi ingatan kerja yang diubah walaupun meninggalkan pengekodan tempat yang tidak aktif64. Lebih-lebih lagi, penguncian fasa neuron piramid kepada taosilasi sebelum ini telah ditunjukkan sebagai peramal prestasi ingatan65.

Terutama, satu had pendekatan kami untuk mewujudkan sifat penalaan jarak temporaland ialah ia memerlukan pensampelan empat kali lebih banyak daripada trek linear biasa yang meningkatkan peluang pelunturan foto apabila menambahkan keadaan rangsangan pada garis masa eksperimen. Walaupun kami mendapati bahawa kod spatial kekal tidak terjejas oleh rangsangan optogenetik dalam sesi yang sama, lebih banyak perkakasan pengimejan yang merangkumi penderia dengan kepekaan yang meningkat boleh membantu mencegah pelunturan foto dan membolehkan sesi rakaman yang lebih lama, dengan itu pensampelan sel temporal dan jarak bersama-sama rangsangan. Kami juga mendapati bahawa kumpulan neuron yang secara signifikan dan khusus mengekod hanya satu pembolehubah adalah kecil berbanding dengan bilangan neuron penghubung, menjadikan keperluan pensampelan untuk neuron yang sangat spesifik ini lebih tinggi.

Kami menyediakan bukti eksperimen bahawa manipulasi MS tidak mengubah kelajuan lokomotor dan sebaliknya, kelajuan lokomotor menentukan kekerapan theta. Walaupun kod tempat dan masa dikekalkan semasa rangsangan MS kami, sebahagian (~6%) sel telah dimodulasi secara langsung dan boleh menyumbang kepada gangguan ingatan yang diperhatikan dalam ujian tingkah laku kami. Interneuron PV dalam hippocampus sebelum ini telah dilaporkan sebagai sebahagian daripada litar mikro yang penting dalam mengawal penyatuan memori66, 67, dan manipulasi optogenetik kami boleh dikaitkan dengan pembungkaman sebahagian daripada sel-sel ini. Selain itu, walaupun kami tidak melihat perubahan dalam jalur frekuensi selain theta, kami tidak boleh mengecualikan bahawa pemasaan pancang CA1 pyramidalneuron boleh diubah secara drastik apabila ayunan scramblingtheta, manakala rangsangan 8 Hz ditunjukkan tidak mengakibatkan peningkatan aktiviti hippocampal18, yang boleh menjelaskan kesan pembezaan corak rangsangan pada prestasi ingatan kerja. Kemerosotan ingatan yang kami perhatikan berkemungkinan bukan kolinergik: pertama, dalam eksperimen imunohistologi kami, kami mendapati hampir tiada ekspresi ChrimsonR dalam neuron ChAT MS. Kedua, rangsangan optogenetik kami tidak dikaitkan dengan perubahan dalam riak hippocampal, manakala laporan sebelumnya menunjukkan bahawa rangsangan Neuron ChAT dikaitkan dengan pengurangan frekuensi riak45,57. Transfeksi ChrimsonR neuron MS VGLUT2 juga tidak mungkin kerana pengaktifan neuron ini dikaitkan dengan peningkatan langsung dalam aktiviti lokomotor 68, yang tidak kami perhatikan.

Walaupun susunan temporal yang tepat bagi pancang piramid CA1 dapat menjelaskan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, kesan rangsangan MS pada ingatan, mekanisme alternatif harus diambil kira. Terutama, sebagai tambahan kepada hippocampus dan korteks entorhinal, MS PVneurons mengunjur ke korteks retrosplenial3 dan boleh bertanggungjawab untuk beberapa gangguan ingatan yang diperhatikan di sini.

Ringkasnya, menggunakan pengimejan kalsium, optogenetik dan elektrofisiologi, kami mendapati bahawa irama theta boleh diatur atau dimansuhkan menggunakan rangsangan MS. Rangsangan sebegini menjejaskan pengambilan semula ingatan episodik dan juga berfungsi. Kesan ini bukan kolinergik dan tidak mengganggu aktiviti riak hippocampal. Akhirnya, sementara sebahagian kecil neuron hippocampal bertindak balas secara langsung kepada rangsangan optogenetik MS, tempat, masa, dan sel jarak tidak terganggu oleh manipulasi ayunan theta. Bersama-sama keputusan ini mencadangkan bahawa walaupun input MS ke hippocampus memainkan peranan penting dalam ingatan, kod berganda dalam neuron piramid CA1 mungkin tidak menjadi substrat langsung untuk fungsi tersebut.

Kaedah

Haiwan

Semua prosedur telah diluluskan oleh McGill University Animal CareCommittee dan Canadian Council on Animal Care (protokol 2015-7650). Sejumlah n=41 jantan (n=20) dan betina (n=21) berumur 8–16 minggu,B6;129P2 PV-Cre tikus (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) telah digunakan dalam kajian ini. n=5 tikus digunakan untuk menggabungkan optogenetik dengan pengimejan kalsium; n=3 tikus telah ditanam untuk kawalan pengimejan kalsium, optogenetik dan elektrofisiologi; n=4 tikus digunakan dalam kajian elektrofisiologi; n=29 tikus telah dipindahkan dan diimplan untuk ujian tingkah laku. Tikus ditempatkan secara individu pada 12-h kitaran terang/gelap pada 22 darjah dan kelembapan 40% dengan makanan dan air libitum. Semua eksperimen telah dijalankan semasa bahagian terang kitaran terang/gelap.

Vektor virus yang berkaitan dengan adeno

Adeno-associated virus AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, diperoleh daripada University of Pennsylvania Vector Core) telah digunakan dalam semua eksperimen pengimejan kalsium. Virus berkaitan adeno(AAV) serotype dj (kapsid hibrid yang dicipta daripada lapan AAVserotypes berbeza) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato diperoleh daripada Kemudahan Teras Vektor di Oregon Health and Science University di Portland, Oregon. Walaupun dia adalah gen pengemasan, kami tidak memerhatikan pemindahan dalam sel kolinergik (lihat "Keputusan" dan Rajah 2b–e). Konstruk eYFP tanpa urutan ChrimsonR digunakan sebagai kawalan (disebut kawalan YFP dalam manuskrip ini).

Prosedur pembedahan

Tikus telah dibius dengan isoflurane (5% aruhan, 0.5–1 % penyelenggaraan) dan diletakkan dalam bingkai stereotaksik (David Kopf Instruments). Suhu badan dikekalkan dengan pad pemanas, mata dihidratkan dengan gel (Optixcare) , dan Carprofen (10 ml/kg) diberikan secara subkutan. Tengkorak telah dibersihkan sepenuhnya daripada semua tisu penghubung dan kraniotomi kecil dilakukan menggunakan gerudi gigi untuk suntikan atau implan berikutnya.

Suntikan virus. Semua suntikan virus dilakukan menggunakan pipet kaca yang disambungkan kepada penyuntik Nanoject III (Drummond). 500 nl AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (atau kawalan eYFP) telah dihantar ke MS pada kadar 1 nL/s, pada koordinat berikut berdasarkan atlas69 stereotaksik tetikus rujukan (jarak dari Bregma dalam mm): anteroposterior (AP) 0.85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) −4.50menggunakan sudut 5 darjah dalam satah ML. Selepas pembedahan, haiwan dipantau sehingga pemulihan.

Implan gentian optik. Dua minggu selepas suntikan, tikus telah dibius untuk implantasi mengikut prosedur pembedahan yang sama. Gentian optik berdiameter A200 μm dengan ferrule seramik (Thorlabs) telah ditanam pada koordinat yang sama. Implan disimen di tempat menggunakan C&B-Metabond® (pergigian Patterson). Pengilat kuku hitam disapu di atas simen pergigian untuk menghalang pelepasan cahaya semasa rangsangan optogenetik.

Implan elektrod. Susunan 7 mikroelektrod tungsten (~1 MΩimpedans) telah diturunkan dalam dorsal CA1 merentangi melalui stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad), dan stratum lacunosummoleculare (lm). Skru diletakkan di dalam tulang di atas korteks hadapan dan otak kecil berfungsi sebagai tanah dan rujukan, masing-masing. Selepas elektrod, tanah, dan penempatan rujukan, simen pergigian telah digunakan untuk mengikat implan secara kekal pada tengkorak.

Implan untuk pengimejan kalsium. Kami menyuntik AAV5.CamKII.GCaMP6fvirus (200 nL pada 1 nl s−1) dalam hippocampal CA1 menggunakan koordinat berikut: anteroposterior (AP) − 1.86 mm dari bregma, mediolateral(ML) 1.5 mm, dorsoventral (DV) 1.5 mm. Dua minggu selepas suntikan, tikus telah dibius dengan isoflurane dan tengkoraknya dibersihkan. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Pengimejan kalsium serentak dan rakaman elektrofisiologi. Untuk mengawal kesan implan GRIN pada hippocampal thetaas serta perbincangan silang antara skop mini dan lampu pengujaan optogenetik, kami memasang elektrod mikro tungsten pada kanta GRIN. Untuk tujuan ini, kami meletakkan kanta GRIN secara mendatar di bawah mikroskop pembesaran rendah dalam persekitaran bebas habuk. Mikroelektrode tungsten diletakkan perlahan-lahan pada tepi atas kanta GRIN menggunakan mikromanipulator. Kami menggunakan diameter kanta GRIN yang diketahui sebagai unit rujukan untuk menganggarkan penonjolan elektrod yang dikehendaki (~50 µm, selanjutnya dinilai secara digital selepas mengambil mikrofotograf penyediaan) oleh koordinat implantasi kami yang dirancang. Sejumlah kecil (~50 µL) superglue telah didepositkan pada tepi atas kanta GRIN dengan elektrod di tempatnya dan dibiarkan kering selama~10 minit, sebelum menggunakan lapisan gam seterusnya. Lima lapisan nipis telah digunakan untuk mengekalkan elektrod yang dipasang pada kanta GRIN. Selepas implantasi pemasangan elektrod GRIN ini menggunakan protokol yang diterangkan di atas, wayar yang menonjol dibengkokkan perlahan-lahan dan disembunyikan di bawah penutup pelindung (tinggi 1–1.5 cm) yang diambil daripada pir pipet sedutan manual sebagai pengganti Kwik-Sil.

Prosedur tingkah laku in vivo

Kebiasaan. Tikus dikendalikan dengan lembut selama ~ 5 minit dalam tempoh satu minggu, dengan pelaziman progresif kepada prosedur palam (gentian optik, miniskop, dan pra-amplifiedtethers elektrofisiologi). Haiwan kemudiannya dijadualkan air (akses 2 jam sehari).

Rakaman miniskop. Miniskop (V3) telah dipasang menggunakan arahan sumber terbuka (miniscope.org). Data pengimejan diperoleh menggunakan sensor pengimejan CMOS (Aptina, MT9V032) dan dimultiplekskan melalui kabel sepaksi ringan. Data diperoleh menggunakan kotak pemerolehan data(DAQ) yang disambungkan melalui pengawal hos USB (Cypress, CYUSB3013). Tingkah laku haiwan dirakam menggunakan kamera web gred pengguna (Logitech) yang dipasang di atas persekitaran. Kalsium dan data tingkah laku direkodkan menggunakan miniscope.org, sumber perisian perolehan tersuai DAQ. DAQ secara serentak memperoleh strim pengimejan tingkah laku dan selular pada 30 Hz sebagai fail uncompressed.avi 1000frame untuk 15-sesi rakaman minit, bersama-sama dengan cap masa yang sepadan untuk membolehkan penjajaran temporal yang tepat bagi data pengimejan tingkah laku dan kalsium.

Rakaman elektrofisiologi in vivo. Selepas 1 minggu pemulihan selepas pembedahan dan satu minggu pembiasaan kepada persediaan penambatan, LFP daripada tikus yang diimplan telah direkodkan. Semua isyarat yang direkodkan daripada elektrod yang diimplan telah dikuatkan oleh pra-penguat tether sebelum didigitalkan pada 22 kHz menggunakan sistem rakaman digital (Neuralynx, USA). Rakaman setiap isyarat saluran telah disimpan bersama-sama dengan rakaman video dan isyarat TTL daripada Diod Laser untuk subsequentanalysis.

Rangsangan optogenetik. Rangsangan laser disampaikan melalui kord optik afiber (diameter 200 μm) menggunakan sumber cahaya gentian diod laser (Doric Lenses). Keamatan cahaya telah ditentukur dan panjang gelombang diperbetulkan menggunakan Power Meter Bundle dengan PM100D Consoleand S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Setiap rangsangan pacing (termasuk 8 Hz) dilakukan menggunakan denyutan 5 ms persegi. Untuk menggunakan rangsangan cahaya yang hancur, kami menggunakan mikropengawal Arduino untuk menjana isyarat ayunan hingar putih terus dimasukkan ke dalam input analog pemacu diod laser. Untuk melakukan rangsangan frekuensi yang dipilih secara rawak, kami menggunakan protokol 5 s ON, 5 s OFF standard, tetapi untuk setiap zaman rangsangan, kami menggunakan mikropengawal Arduino secara rawak memilih frekuensi rangsangan dalam jalur theta. Apabila menggunakan rangsangan optogenetik semasa tingkah laku, sekeping tiub pengecutan haba yang longgar dipasang di sekeliling persimpangan antara tali tampal dan implan ferrule tetikus untuk mengehadkan pelepasan cahaya yang boleh dilihat. Keamatan cahaya dinyatakan sebagai kuasa nominal, seperti yang diukur pada hujung pemasangan tali implan gentian optik (sebelum penempatan pembedahan), dan diperbetulkan untuk panjang gelombang yang sesuai.

Ujian tingkah laku

Trek linear nada berurutan. Tikus adalah berjadual air dan boleh mengakses air hanya selama 2 jam sehari dari 6–8 malam Untuk merungkai kod ruang, temporal dan jarak, kami membina trek linear sepanjang 134 cm menggunakan bata Lego® kelabu sederhana, yang membolehkan pengubahsuaian dan pelaksanaan mudah tanpa perlu mengubah suai struktur maze secara kekal. Penderia piroelektrik diletakkan pada setiap hujung trek linear dan disambungkan kepada mikropengawal Arduino. Setiap pengesanan mencetuskan nada baharu dalam urutan, menunjukkan kemajuan untuk penghantaran ganjaran. Nada berikut telah digunakan dan dihantar menggunakan pembesar suara apiezo: 1 s bip pada 2000 Hz, 250 ms bip pada 3000 Hz, dan nada berterusan pada 4000 Hz. Apabila nada berterusan yang terakhir dicetuskan, ganjaran (10% sukrosa dalam air) dihantar pada hujung permulaan trek linear dalam penutup tiub Falcon 15 mL. Perubahan arah larian sebelum mencetuskan nada seterusnya dianggap sebagai ralat dan tidak mencetuskan penghantaran ganjaran. Prestasi diukur dengan bilangan percubaan yang betul (tanpa ralat) dibahagikan dengan bilangan jumlah percubaan.

Pengecaman tempat objek novel. Pada hari pertama, tikus dibenarkan meneroka medan terbuka kelabu gelap 45 × 45 cm secara bebas yang mengandungi isyarat visual (parut mendatar dan menegak putih besar) pada dindingnya selama 10 minit. Pada hari kedua, dua objek yang sama (tapak tangan membantu) dipersembahkan selama 10 minit. Pada hari ketiga, tikus dibenarkan meneroka padang terbuka yang sama manakala lokasi salah satu daripada dua objek itu dialihkan. Untuk mengawal potensi bias keutamaan spatial, kedua-dua kedudukan awal dan juga kedudukan objek yang dialihkan, adalah secara rawak. Tikus telah mengaitkan susunan ujian rawak yang disimpan sama sepanjang tiga hari ujian. Tingkah laku telah dirakam dengan kamera video (Logitech) dan dianalisis di luar talian. Analisis tingkah laku dilakukan buta terhadap genotip dan rawatan. Penerokaan objek ditakrifkan sebagai zaman di mana tikus mempunyai hidung dalam jarak 1 cm dari objek. RI dikira seperti berikut:

Tertunda automatik tidak sepadan dengan tugasan sampel. Tikus telah dijadualkan air dan dilatih dalam T-maze yang berterusan kepada tugas sampel yang tidak sepadan dengan tertunda. Secara ringkas, setiap percubaan dibahagikan kepada dua fasa: sampel dan ujian. Dalam fasa sampel, satu lengan telah disekat dan tikus dipaksa untuk meneroka lengan bertentangan, di mana mereka menerima 50 µL 10% ganjaran air sukrosa. Selepas melengkapkan fasa sampel, tikus dikenakan kelewatan (10 s) dalam petak permulaan. Kemudian, semasa fasa ujian, kedua-dua lengan boleh diterokai, tetapi hanya lengan yang bertentangan (belum diterokai) diumpan supaya tikus terpaksa bergilir-gilir lokasi antara sampel dan fasa ujian. Tikus telah tertakluk kepada 10 percubaan (sampel + ujian) setiap hari, selama 10 hari berturut-turut, dan kadar kejayaan harian dikira sebagai bilangan percubaan yang betul dibahagikan dengan jumlah percubaan.

Analisis histologi post-mortem

Selepas selesai ujian tingkah laku, tikus telah dibius secara mendalam dengan campuran ketamin/xylazine/acepromazine (100, 16, 3 mg/kg, masing-masing, suntikan intraperitoneal) dan perfused transcardiallywith 4% paraformaldehyde (PFA) dalam PBS. Otak telah diekstrak dan postfix semalaman dalam PFA pada 4 darjah dan kemudiannya dibasuh dalam PBS selama 24 jam tambahan pada 4 darjah. Otak dan bahagian telah dilindungi krioproteksi dalam larutan 30% etilena glikol, 30% gliserol, dan 40% PBS sehingga digunakan. Setiap otak kemudiannya dibelah pada 50 µm menggunakan vibratom: setiap bahagian dikumpulkan secara berurutan dalam 4 tiub 1.5 mL yang berbeza untuk membenarkan analisis yang berbeza (lokasi elektrod, imunohistokimia).

Imunohistologi. Menggunakan satu tiub bahagian otak yang dikumpul (25% pensampelan) untuk setiap analisis, bahagian telah dibasuh selama 3 × 5 minit dalam PBS untuk mengeluarkan larutan krioprotektif. Bahagian diinkubasi semalaman dengan PGT (0.45% Gelatin dan 0.25% Triton dalam PBS) pada 4 darjah .Seterusnya, kepingan diinkubasi dengan antibodi primer: sama ada 1:200 goatanti-choline-acetyl -transferase daripada Millipore atau 1:500 tetikus anti-PVmonoklonal IgG1 daripada Sigma-Aldrich dalam PGT pada suhu bilik masing-masing selama 48 jam atau 2 jam. Selepas mencuci 10, 20, dan 30 minit, bahagian kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder [1:2000 donkeyanti-goat ditambah dengan Alexa 488 atau 1:500 kambing anti-tikus IgG1 digabungkan dengan Alexa 488 (Life Technologies)] dalam PGT untuk 45 min. Selepas mencuci 10,20, dan 30 minit dalam PBS, bahagian kemudiannya dipasang pada gelongsor kaca dan ditutup secara kekal dengan medium pelekap Fluoromount yang mengandungi DAPI. Hanya tikus dengan penempatan implan yang disahkan secara histologi dimasukkan dalam kajian ini. Untuk GRINlenses, permukaan kanta mestilah<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Analisis data

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 pada trek linear).

Penjejakan tingkah laku automatik. Untuk mengekstrak maklumat tentang kedudukan, halaju dan arah kepala tikus, kami menggunakanDeepLabCut70,71. Secara ringkas, kami melatih model untuk mengesan telinga, hidung, badan dan pangkal ekor tikus. Arah kepala dianggarkan menggunakan anglebetween sama ada setiap telinga atau hidung dan badan, bergantung pada ketersediaan ukuran. Data lokasi diinterpolasi kepada kekerapan persampelan pengimejan kalsium menggunakan interpolasi linear. Halaju telah diekstrak dengan mengira Δd/Δt di mana d ialah jarak dan masa t dan seterusnya melicinkan hasilnya dengan menggunakan penapis Gaussian dengan sigma=33 ms untuk mengalih keluar artifak pengesanan. Isyarat halaju digunakan untuk mengenal pasti tempoh aktiviti lokomotor dan mengira tempat, masa, dan modulasi jarak aktiviti khusus untuk tempoh tersebut.

Analisis pengimejan kalsium. Analisis data pengimejan kalsium dilakukan menggunakan MATLAB 2020a dan Python 3.8.4. Rakaman video dianalisis menggunakan saluran paip Analisis Miniskop (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Secara ringkas, pembetulan gerakan tegar (putaran dan terjemahan) digunakan menggunakan NoRMCorre72, dan video telah diturunkan sampel secara spasial (3×) sebelum penyatuan. Surih kalsium telah diekstrak menggunakan CNMFe51 menggunakan parameter berikut: gSig=3 piksel (lebar kernel Gaussian), gSiz=20 piksel (anggaran diameter neuron), latar belakang_model='cincin', spatial_algoritma='hals', min_corr=0.8 (minimum pixel correlationthreshold), min_PNR {{17 }} (ambang nisbah puncak-ke-bunyi minimum).

Surih kalsium mentah telah ditapis untuk membuang turun naik frekuensi tinggi dan diduakan: Secara ringkas, neuron dianggap aktif apabila amplitud isyarat kalsium dinormalisasi melebihi dua sisihan piawai, dan terbitan tertib pertama berada di atas 0 (lihat rujukan 52 untuk butiran tambahan mengenai metodologi52). Untuk mengekstrak penalaan neuron kepada pembolehubah khusus, lokasi, masa dan jarak telah dibinkan (lokasi: tong 3 cm; masa: tong 1 s; jarak: tong 3 cm). Daripada isyarat binarized, kami mengira kemungkinan kecil sel aktif P Að Þ yang kami gunakan sebagai proksi untuk aktiviti neuron. Lebih penting lagi, kami kemudiannya kemungkinan terbitan aktiviti atau 'kebarangkalian aktif memandangkan keadaan avariable' PA j Si menggunakan pembolehubah binned:

dengan M ialah jumlah bilangan keadaan tingkah laku yang mungkin, dan P(Si∩Aj) ialah kebarangkalian bersama haiwan itu berada dalam tong I serentak dengan tahap aktiviti j (0 atau 1). Untuk menilai kepentingan nilai MI yang diperolehi, kami kemudian menghasilkan 1000 pengganti yang dikocok menggunakan pilih atur bulat rawak. Kami memilih pilih atur bulat kerana mereka mengalih keluar hubungan temporal antara aktiviti neuron dan tingkah laku, sementara masih mengekalkan struktur temporal kalsium transients dan dengan itu membawa kepada keputusan yang lebih konservatif (berbanding dengan rawak lengkap setiap titik data, yang meningkatkan nilai kepentingan keputusan). Oleh kerana pengganti yang dikocok tidak diedarkan secara normal secara sistematik, kami menggunakan pendekatan bukan parametrik di mana nilai p (pN) sepadan dengan bilangan titik data daripada pengedaran yang dikocok yang lebih besar daripada data sebenar untuk setiap bin, dibahagikan dengan bilangan pilih atur52, 73.

Untuk menentukan modulasi sel oleh rangsangan optogenetik, kami menggunakan pendekatan yang sama tetapi mengira MI antara aktiviti neuron dan isyarat rangsangan binari (dengan itu dianggap sebagai keadaan tingkah laku). Prosedur shuffling bulat yang sama telah digunakan untuk mengekstrak kepentingan statistik.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, set data latihan dijana menggunakan 90% daripada data. Baki 10% daripada data telah digunakan untuk ujian. Ralat penyahkodan telah dikira menggunakan pengganti 50bootstrapped dan kumpulan 160 sel menggunakan titik data yang dipilih secara rawak dengan penggantian. Setiap neuron diandaikan tidak bergantung antara satu sama lain, yang pada praktiknya tidak berlaku dan membawa kepada kesilapan pembinaan semula yang lebih besar, tetapi mengurangkan masa pengiraan. Kebarangkalian posterior populasi diperoleh daripada persamaan berikut:

Menjejaki sel selama beberapa hari. Neuron telah dijejaki selama beberapa hari menggunakan CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Secara ringkas, jejak spatial telah diselaraskan menggunakan penjajaran tegar untuk membetulkan bagi putaran dan terjemahan. Selepas penjajaran, kami menganggap set calon sel sebagai neuron yang sama jika jarak maksimumnya adalah<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Analisis elektrofisiologi. Analisis data elektrofisiologi dilakukan menggunakan MATLAB 2020a menggunakan kedua-dua pemprosesan isyarat serta kotak alat wavelet. Konvolusi wavelet digunakan pada isyarat LFP menggunakan wavelet Morlet kompleks ('cmor1–1.5' dalam MATLAB) apabila ketepatan domain masa dan frekuensi diperlukan. Movingwindow Fourier convolution (tetingkap 2 s dalam jalur theta, tetingkap 5 s dalam jalur gamma, 10 ms langkah bergerak) telah digunakan apabila ketepatan domain frekuensi diberi keistimewaan berbanding ketepatan domain masa (cth, frekuensi dominan toplot apabila pacing menggunakan optogenetik). Analisis ketumpatan spektrum kuasa dilakukan apabila tikus berjalan pada 5 cm s−1 atau ke atas melainkan diterangkan sebaliknya.

Kekuatan ayunan. OS dikira sebagai nisbah ketumpatan spektrum kuasa terkumpul di sekitar frekuensi ayunan puncak ±1 Hz kepada kuasa jalur terkumpul dalam jalur theta (4–12 Hz). Metrik ini menjadi 1 apabila semua ketumpatan spektrum kuasa berada dalam frekuensi ayunan puncak (cth 8 Hz jika merangsang pada frekuensi itu).

Pengesanan dan analisis SWR. Untuk memantau SWR, tikus dibenarkan meneroka medan terbuka secara bebas selama 10 min semasa merakam. Rangsangan (bergetar atau 8 Hz) dilakukan dengan paradigma ON, 5 s OFF 5 s. Hanya tempoh rehat yang tenang dipertimbangkan untuk analisis. Untuk tujuan ini, kami mengira nisbah z-skor kuasa theta/delta selepas menapis untuk setiap jalur frekuensi, melakukan transformasi Hilbert, dan hanya mempertimbangkan tempoh di mana nilai yang terhasil adalah di bawah 0. Untuk mengesan SWR, kami menapis isyarat LFP dalam 150–250 Jalur frekuensi Hz dan seterusnya dijaringkan z. Riak telah dikesan menggunakan fungsi findpeaks dalam MATLAB, dengan parameter berikut: ambang=4 sd,lebar minpeak=0 s, jarak puncak=0.03 s.

Rujukan

1. Colgin, LL Irama rangkaian hippocampal. Nat. Rev. Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Pembasmian sel hippocampalpyramidal tikus oleh aferen GABAergic dari septum. J. Physiol.500, 463–474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Sasaran sinaptik unjuran septum medial dalam korteks hippocampus dan extrahippocampal tetikus. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Pointessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Ciri-ciri penembakan neuron yang dikenal pasti secara anatomi dalam septum medial tikus yang dibius dan tidak dinestesi. J. Neurosci. 26, 9038–9046 (2006).

5. Scotty, F. et al. Sifat elektrofisiologi yang berbeza bagi neuron septohippocampal tikus glutamatergik, kolinergik dan GABAergik: implikasi novel untuk ritmik hippocampal. J. Physiol. 551,927–943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Rangkaian glutamatergicneuron berfungsi dalam septum medial dan kawasan jalur pepenjuru. J.Fisiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. et al. Parvalbumin interneuron aktiviti tunepopulation hippocampus pada kekerapan theta. Neuron 86, 1277–1289(2015).

8. Etter, G. et al. Rangsangan gamma optogenetik menyelamatkan gangguan ingatan dalam model tetikus penyakit Alzheimer. Nat. Commun. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. et al. Litar neural hippocampal bertindak balas kepada optogeneticpacing frekuensi theta dengan menjana frekuensi ayunan dipercepatkan. Curr. biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. et al. Ayunan Theta mengawal kelajuan pergerakan melalui laluan septum hippocampus ke sisi. Nat. Commun. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com