Oligosakarida Memperbaiki Kecederaan Buah Pinggang Akut Dengan Mengurangkan Kluster Pembezaan 44-Tindak Balas Imun Pengantaraan dalam Sel Tubular Renal
Jun 05, 2024
Abstrak:Kecederaan buah pinggang akut (AKI)ialah episod tiba-tibakerosakan buah pinggangyang biasa berlaku pada pesakit yang dimasukkan ke hospital. Sehingga kini, tiada rawatan ideal telah dibangunkan untuk mengurangkanKeterukan AKI. Oligo-fucoidan(FC) mengganggu gugusan protein permukaan sel tubular renal pembezaan 44 (CD44) untuk mengelakkan fibrosis interstisial buah pinggang; bagaimanapun, pengaruh oligosakarida pada AKI masih tidak diketahui. Dalam kajian ini, FC, galacto-oligosakarida (GOS), dan frukto-oligosakarida (FOS) telah dipilih untuk menyiasat pengaruh oligosakarida pada AKI. Ketiga-tiga oligosakarida telah terbukti sebahagiannya diserap oleh usus. Kami mendapati bahawa oligosakarida bergantung kepada dos mengurangkan antigenisiti CD44 dan menyekat ekspresi akibat hipoksia CD44, phospho-JNK, MCP-1, IL-1 dan TNF- dalam NRK-52E sel tubular renal. Sementara itu, pemindahan siRNA CD44 dan perencat JNK SP600125 mengurangkan ekspresi yang disebabkan oleh hipoksia fosfo-JNK dan sitokin. Ligan CD44, hyaluronan, mengatasi pengaruh oligosakarida pada CD44 dan fosfo-JNK. Pada 2 hari selepas pembedahan untuk kecederaan iskemia-reperfusi, oligosakarida mengurangkan keradangan buah pinggang, kreatin serum, MCP-1, IL-1 dan TNF- dalam tikus AKI. Pada 7 hari selepas pembedahan, pemulihan buah pinggang telah dipromosikan. Keputusan ini menunjukkan bahawa FC, GOS, dan FOS menghalang lata CD44 / JNK yang disebabkan oleh hipoksia dan sitokin dalam sel tiub buah pinggang, dengan itu memperbaiki AKI dan keradangan buah pinggang dalam tikus AKI. Oleh itu,suplemen oligosakaridaialah strategi penjagaan kesihatan yang berpotensi untuk pesakit AKI.
HERBA BARU UNTUK PENYAKIT BUAH PINGGANG
Kata kunci: kecederaan buah pinggang akut; kelompok pembezaan 44; frukto-oligosakarida; galactooligosakarida; oligo-fucoidan; keradangan
1. Pengenalan
Kecederaan buah pinggang akut(AKI) dicirikan oleh penurunan mendadak dalam kadar penapisan glomerular dan peningkatan kreatinin serum. Kerosakan ini biasa berlaku pada pesakit yang dimasukkan ke hospital dan unit rawatan rapi, terutamanya warga emas. Iskemia, sepsis, dan nefrotoksisiti adalah punca utama AKI yang sering wujud bersama dan, dengan itu, merumitkan diagnosis dan rawatan [1]. AKI yang teruk menempatkan pesakit yang dilepaskan pada risiko kejadian buruk, seperti penyakit buah pinggang kronik, kejadian kardiovaskular, kanser, dan jangkitan [2]. AKI mempunyai perkembangan pesat, dan tiada rawatan berkesan tersedia untuk mengelakkan atau mengurangkan keterukan. Pengambilan nutrien tertentu boleh mengurangkan kecederaan tubular renal dalam AKI [3]. Oleh itu, mengkaji pengaruh pemakanan khusus terhadap AKI akan membantu dalam memperbaiki AKI dan mengiringi risiko yang dihadapi oleh pesakit yang discaj.
Keradangan dan pengambilan leukositadalah pengantara utama AKI. Buah pinggang, terutamanya sel tubular renal, menjanasitokin radangsemasa AKI, seperti IL-1, IL-6, protein chemoattractant monocyte-1 (MCP-1), dan tumor necrosis factor- (TNF- ) [4,5] . Sitokin ini seterusnya mendorong keradangan sistemik dan pengambilan leukosit. Walaupun beberapa subset leukosit memberi kesan perlindungan pada AKI (seperti sel T-regulatory), kebanyakan neutrofil, monosit dan sel dendritik berbahaya kepada pemulihan AKI [6]. Keradangan sistemik juga memudaratkan pemulihan daripada AKI kerana paras sitokin yang tinggi [7]. Antara sitokin yang dirembeskan oleh buah pinggang, MCP-1 bertanggungjawab terutamanya untuk pengambilan leukosit, bertindak balas kepada pelbagai sitokin, termasuk IL-1 dan TNF- [8,9], dan memainkan peranan penting dalam patogenesis. kecederaan buah pinggang yang berbeza [10]. Dalam sel tubular proksimal manusia HK-2, ekspresi MCP-1 akibat hipoksia dimediasi oleh laluan terminal kinase (JNK) c-Jun NH2- (JNK) [11]. Laluan p38 juga terlibat dalam ekspresi MCP-1 akibat albumin dalam sel epitelium tiub renal [12]. Oleh itu, peraturan laluan JNK dan p38 boleh mempengaruhi keradangan dan pengambilan leukosit dalam AKI.
Oligosakarida adalah polimer sakarida yang mengandungi 3-10 monosakarida yang tidak boleh dihadam dan merupakan komponen utama jumlah prebiotik yang tersedia sebagai bahan tambahan diet [13]. Kebanyakan frukto-oligosakarida (FOS) yang ditelan dalam tubuh manusia ditapai sepenuhnya oleh flora kolon, dan sebahagian kecil diperolehi dalam air kencing [14]. Galacto-oligosaccharides (GOSs) boleh diserap dalam darah dan seterusnya dikumuhkan dalam air kencing [15]. Keadaan yang sama berlaku untuk fucoidan dalam alga laut coklat [16]. Oligosakarida yang diserap boleh mempengaruhi tindak balas biokimia dan pengecaman sel [17]. Kajian terdahulu kami mendedahkan bahawa oligo-fucoidan (FC) mengganggu interaksi antara protein permukaan sel tubular renal CD44 dan ligan ekstraselularnya, dengan itu menghalang fibrosis interstisial buah pinggang [18]. Interaksi antara CD44 dan ligan ekstraselularnya menggalakkan laluan isyarat JNK [19]. Oleh itu, pengambilan harian oligosakarida mungkin mengurangkan keradangan buah pinggang pada pesakit dengan AKI. Walau bagaimanapun, pengaruh polimer ini pada AKI masih tidak diketahui. Kajian ini menyiasat kesan FC, FOS, dan GOS pada sel tubular renal yang dirawat hipoksia dan tikus AKI dengan kecederaan reperfusi iskemia (IRI). Keputusan menunjukkan bahawa tiga oligosakarida menindas CD{16}}mengantara tindak balas imun buah pinggang dan mengurangkan keterukan selepas AKI. Oleh itu, penggunaan polimer ini sebagai suplemen pemakanan membentangkan strategi rawatan AKI yang baru
2. Bahan dan Kaedah
2.1. Bahan
FOS (darjah purata pempolimeran < 10), GOS (darjah purata pempolimeran < 8), dan FC (darjah purata pempolimeran < 5) diperoleh daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat, Cat. No. F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Cat. No. OG32134), dan Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan). Oligosakarida telah dibubarkan dalam H2O suling dua kali dan ditapis menggunakan penapis steril 0.22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman). Hyaluronan (HA) dan semua bahan kimia gred reagen lain diperoleh daripada Sigma. Antibodi terhadap JNK (sc-7345), fosfo-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), dan TNF- (sc-52746) telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Antibodi terhadap p38 (9212) dan phospho-p38 (9211) diperoleh daripada Teknologi Isyarat Sel (Danvers, MA, Amerika Syarikat). Antibodi terhadap Ly6G (ab25377) dan F4/80 (ab100790) telah dibeli dari Abcam (Cambridge, UK). Antibodi terhadap HIF-1 (NB100-105) telah dibeli daripada Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).
2.2. Kultur Sel
Sel tubular renal proksimal tikus (NRK-52E) dan garis makrofaj tikus RAW264.7 telah dibeli daripada Institut Penyelidikan dan Pembangunan Industri Makanan (Hsinchu, Taiwan); dikultur dalam DMEM ditambah dengan larutan antibiotik/antikulat dan 10% serum anak lembu janin; dan disimpan pada suhu 37 ◦C dan 95% kelembapan dalam inkubator CO2. Selepas mencapai 70% pertemuan, sel-sel telah dibiakkan dalam medium bebas serum dan diinkubasi semalaman sebelum eksperimen. Untuk percubaan hipoksia, sel NRK-52E dan Pek Anaero (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, USA) telah didepositkan ke dalam balang segi empat tepat (Mitsubishi Gas Chemical America) dan keseluruhan persediaan diletakkan dalam 37 ◦C inkubator selama 4 jam. Sel-sel itu kemudiannya dibiakkan semalaman di bawah keadaan normal.
2.3. Analisis Western Blot
Secara ringkasnya, 15 µg NRK-52E protein lysate telah digunakan pada setiap lorong, dan hasilnya dianalisis oleh Western blot. Tahap jalur protein relatif dikira daripada lima eksperimen bebas oleh perisian Quantiscan dari Biosoft (Cambridge, UK).
2.4. Transfeksi RNA Interfering Pendek (si) CD44
Rat CD44 siRNA (4390771) telah dibeli dari Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Selepas berkembang kepada 70% pertemuan, sel telah ditransfeksi dengan siRNA menggunakan reagen transfeksi Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) mengikut arahan pengilang.
2.5. Ujian Percambahan Sel
Selepas sel NRK-52E hipoksik dibiakkan selama 24 jam, medium yang sama digunakan untuk mengkultur sel RAW264.7 dalam 96-plat perigi (2000 sel/telaga). Selepas 24 jam pengeraman, pembiakan sel RAW264.7 dianalisis dengan menggunakan Kit Ujian SRB (Abcam, Cat. No. ab235935) mengikut arahan pengilang.
2.6. Ujian Antigenisiti CD44
CD44 tikus rekombinan diperoleh daripada Sistem R&D (Minneapolis, MN, USA, Cat. No. 6577-CD) dan digunakan untuk menghasilkan tindak balas pengikatan dengan HA mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, 20 ng/mL tikus rekombinan CD44 dicampur dengan kepekatan FC, FOS, atau GOS yang berbeza selama 10 minit untuk menyiasat pengaruh oligosakarida pada antigenisiti CD44. Campuran dianalisis menggunakan kit CD44 ELISA (Abcam, Cat. No. ab213928) mengikut arahan pengilang.
2.7. Haiwan Eksperimen dan IRI Renal
Tikus jantan 129S1/SvImJ berusia lapan minggu telah dibeli daripada Lasco Technology (Taipei, Taiwan). Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Eksperimen Universiti Perubatan Taipei (No. kelulusan LAC-2019-0511) dan dibentuk oleh Panduan NIH untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal. Untuk induksi IRI, tikus (berberat 21-23 g) tertakluk kepada penjepit pedikel buah pinggang dua hala selama 30 minit dengan melakukan hirisan sayap [20]. Tikus telah dibius dengan anestesia inhalan dengan isoflurane sebelum operasi. Tikus yang dikendalikan sham menjalani operasi yang sama, kecuali untuk pengapitan pedikel buah pinggang. Semua tikus diberi makan dengan oligosakarida melalui gavage oral dari 1 hari sebelum hingga 2 hari selepas pembedahan IRI. Tikus eksperimen dibahagikan kepada lima kumpulan berikut dengan n=8 untuk keputusan pada hari ke-3 dan hari7: (1) kumpulan palsu; (2) kumpulan AKI; (3) Kumpulan AKI diberi makan FC (10 mg/kg/hari); (4) Kumpulan AKI diberi makan dengan FOS (10 mg/kg/hari); dan (5) kumpulan AKI yang diberi makan dengan GOS (10 mg/kg/hari). Tikus telah dikorbankan 3 atau 7 hari selepas pembedahan, dan darah dikumpulkan dan dianalisis menggunakan penganalisis biokimia dan kit ELISA. Tahap kreatinin serum setiap tetikus dianalisis untuk menilai perkembangan AKI. Morfologi buah pinggang telah diperiksa dengan pewarnaan asid-Schiff (PAS) berkala dan pewarnaan imunohistokimia (IHC) dalam bahagian parafin 2 µm tetap formalin.
2.8. Pewarnaan imunohistokimia
Tisu buah pinggang telah diperbaiki dengan 4% paraformaldehid terbuffer, tertanam dalam parafin, dan dipotong kepada bahagian 2 µm untuk pewarnaan dengan UltraVision Quanto Detection System HRP DAB kit (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) dan hibridisasi dengan antibodi utama mengikut arahan pengilang .
2.9. Mewarna PAS
Bahagian buah pinggang telah diwarnai dengan Kit Noda PAS (Abcam, Cat. No. ab150680) mengikut arahan pengilang.
2.10. Ujian ELISA
Medium kultur sel NRK-52E dan sampel serum tikus eksperimen telah dikumpul dan dianalisis menggunakan kit MCP-1 ELISA (Abcam, Cat. No. ab208979) dan IL-1 Kit ELISA (Abcam, Cat. No. ab197742). Sampel serum juga dianalisis menggunakan kit TNF- ELISA (Sistem R&D, Cat. No. MTA00B) dan kit ELISA berkaitan lipocalin (NGAL) neutrofil gelatinase (Sistem R&D, Cat. No. MLCN20) oleh arahan pengeluar.
2.11. Ujian Statistik
Perbezaan ketara antara kedua-dua kumpulan ditentukan menggunakan ujian-t Pelajar. Perbezaan dianggap signifikan untuk nilai p<0.05
3. Keputusan
3.1. Oligosakarida Menghalang Peningkatan CD44 dan Sitokin dalam Sel NRK Hipoksik-52E
Ekspresi CD44 dalam sel NRK-52E yang dirawat dengan FC, FOS dan GOS pertama kali dipantau untuk menilai pengaruh oligosakarida pada sel tiub buah pinggang. Ekspresi CD44 yang disebabkan oleh hipoksia telah dihalang oleh ketiga-tiga oligosakarida dalam julat 0.05–0.5 mg/mL (Rajah 1A). Oleh itu, dos oligosakarida 0.1 mg/mL digunakan dalam eksperimen sel berikut. Dalam sistem yang disediakan, rawatan hipoksia sangat mendorong ekspresi penanda hipoksia HIF-1 dalam sel NRK-52E, menunjukkan bahawa sel berada dalam keadaan hipoksia (Rajah 1B). Hipoksia mengimbangi tahap JNK terfosforilasi, MCP-1, IL-1 dan TNF- tetapi tidak dalam sel yang dirawat dengan oligosakarida (Rajah 1B, C). Ekspresi JNK meningkat dalam sel hipoksik tetapi tidak dalam sel yang dirawat FC atau dirawat FOS. GOS tidak menjejaskan ekspresi JNK dalam sel hipoksik tetapi menindas regulasi JNK terfosforilasi. Oleh itu, oligosakarida boleh menghalang transduksi isyarat JNK yang disebabkan oleh hipoksia dan ekspresi sitokin dalam sel tiub buah pinggang. Walaupun FC dan GOS mengawal selia p38 phos terforilasi dalam sel hipoksik, ekspresi protein ini tidak meningkat dalam sel hipoksik. Dapatan ini menunjukkan bahawa p38 tidak memainkan peranan penting dalam tindak balas yang disebabkan oleh hipoksia dalam sel NRK-52E.
3.2. CD44 dan JNK Memainkan Peranan Kritikal dalam Peningkatan Sitokin dalam Sel NRK{3}}E Hipoksik
Ekspresi CD44, JNK terfosforilasi, dan sitokin dalam sel tubular renal semuanya dipengaruhi oleh oligosakarida, tetapi perkaitannya masih belum dijelaskan. Untuk menyiasat peranan CD44 dalam transduksi isyarat JNK dan ekspresi sitokin dalam sel hipoksik, sel NRK-52E telah ditransfeksi dengan dos CD44 siRNA yang berbeza. CD44 siRNA pada 50 dan 100 PM dengan cekap menyekat ekspresi CD44 yang meningkat hipoksia dan menghalang peningkatan yang disebabkan oleh hipoksia dengan ketara dalam tahap JNK terfosforilasi, MCP- 1, IL-1 dan TNF- (Rajah 2A). Pengaruh penyekatan CD44 pada ekspresi JNK berkaitan dengan dos siRNA. Ekspresi JNK dalam sel hipoksik telah diinduksi oleh CD44 siRNA pada 50 pM tetapi dihalang pada 100 pM. Kedua-dua dos menindas regulasi JNK terfosforilasi. Perencat selektif untuk JNK, SP600125, mengurangkan ekspresi MCP-1, IL-1 dan TNF- dalam sel NRK-52E hipoksik-52} dengan ketara (Rajah 2B). Keputusan ini menunjukkan bahawa kesan perencatan transfeksi siRNA CD44 pada sitokin yang disebabkan oleh hipoksia dikaitkan dengan pengurangan JNK terfosforilasi.
Rajah 1. Kesan perencatan oligosakarida pada transduksi isyarat CD44 dalam sel NRK-52E hipoksik. Sel-sel telah dirawat terlebih dahulu dengan FC, FOS atau GOS selama 30 min dan kemudian tertakluk kepada kultur hipoksik. Ekspresi protein dianalisis oleh Western blotting. ( A ) Kesan bergantung kepada dos oligosakarida pada ekspresi CD44. (B) Kesan oligosakarida pada44-isyarat berkaitan CD. Kepekatan oligosakarida ditetapkan sebagai 0.1 mg/mL. Peningkatan relatif dalam jalur protein juga ditunjukkan dalam bentuk carta bar (C). Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD (n=4).
Rajah 2. Peranan CD44 dan JNK dalam tindak balas keradangan akibat hipoksia dalam sel NRK-52E. Ekspresi protein dianalisis oleh Western blot. (A) Kesan perencatan transfeksi CD44 siRNA pada JNK dan sitokin terfosforilasi. (B) Kesan perencatan SP600125 pada sitokin. Sel-sel telah dirawat terlebih dahulu dengan 20 μM SP600125 selama 30 minit pbeforehypoxia rawatan. Peningkatan relatif dalam jalur protein juga dibentangkan dalam bentuk carta bar. Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD (n=4).
3.3. Rembesan Sitokin Akibat Hipoksia dalam Sel Tubular Renal Menggalakkan Pembiakan Makrofaj
Keradangan adalah perantara kecederaan buah pinggang dalam AKI. Oleh itu, pengaruh tunggangan oligosaka pada leukosit telah diperiksa. Rajah 3A menunjukkan bahawa FC, FOS, dan GOS tidak mempengaruhi percambahan sel RAW264.7 makrofaj. Pembiakan sel RAW264.7 telah dipromosikan oleh 24-medium kultur jam untuk sel NRK-52E hipoksik (Rajah 3B) tetapi bukan oleh medium untuk sel NRK hipoksik-52E yang dirawat dengan oligosakarida. Yang pertama mempunyai tahap MCP-1 dan IL-1 yang lebih tinggi daripada yang kedua (Rajah 3C, D). Ketiga-tiga oligosakarida mengurangkan MCP-1 dan IL-1 dengan ketara dalam medium kultur sel NRK{14}}E hipoksik. Oleh itu, FC, FOS, dan GOS boleh mengurangkan ekspresi dan rembesan sitokin dalam sel tubular renal hipoksik dan, akibatnya, mengurangkan keradangan yang disebabkan oleh sel tubular renal yang cedera.
