Asid Oleanolik Nanofibers Dilemahkan Zarah Terinduksi Tekanan Oksidatif dalam Keratinosit

Sila hubungi oscar.xiao@wecistanche.com untuk mendapatkan maklumat lanjut

Abstrak:Zarah bawaan udara (PM) adalah bijih penunjuk pencemaran udara, dan ia juga merupakan faktor utama yang menyebabkan tekanan oksidatif dalam kulit. Asid oleanolik (OA), sebatian terpenoid semula jadi, menghalang penuaan kulit akibat PM dengan berkesan; namun, OA mempunyai keterlarutan air dan penyerapan kulit yang lemah, yang mengehadkan penggunaannya dalam ubat-ubatan dan kosmetik. Matlamat kajian ini adalah untuk menyediakan nanofiber asid oleanolik (OAnf) dan menilai kesan OA dan OAnf dalam keratinosit yang dirawat PM. Keputusan menunjukkan bahawa (OA terlarut dalam dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) melemahkan lebihan pengeluaran spesies oksigen reaktif disebabkan oleh PM, pengaktifan protein kinase / kinase terminal Jun-amino-terminal (SAPK/JNK) tekanan-tekanan, dan ekspresi keradangan dan kulit. -protein berkaitan penuaan. Di samping itu, proses nanofiber OA secara berkesan meningkatkan keterlarutan air OA lebih daripada 99,000-kali ganda melalui perubahan sifat fizikokimianya, termasuk peningkatan luas permukaan, pengurangan saiz zarah, transformasi amorfus dan pembentukan ikatan hidrogen dengan eksipien. Keupayaan penembusan kulit OAnf secara konsisten melebihi 10-kali ganda lebih tinggi daripada OA. Selain itu, apabila dilarutkan dalam PBS, OAnf mempamerkan aktiviti antioksidan, anti-radang dan anti-penuaan yang unggul dalam PM -keratinosit yang dirawat daripada OA. Kesimpulannya, penemuan kami mencadangkan bahawa OAnf boleh menjadi formulasi antioksidan topikal untuk melemahkan masalah kulit yang disebabkan oleh PM.

Kata kunci:perkara zarah; asid oleanolik; nalnofiber; antioksidan; anti-radang; anti penuaan

1. Pengenalan

Pencemaran udara kini menjadi masalah kesihatan awam di seluruh dunia. Dengan perkembangan teknologi, pelbagai bahan berbahaya, termasuk gas, bahan kimia, bahan pencemar biologi, dan zarah, terkumpul di atmosfera dan menjejaskan kehidupan dan kesihatan manusia dengan teruk. Zarah (PM), penunjuk pencemar udara, ialah gabungan pelbagai sebatian organik, bahan terbitan biologi, dan nukleus karbon zarahan[1]. PM memasuki paru-paru melalui penyedutan dan masuk ke dalam peredaran darah menyebabkan bahaya kesihatan sistemik seperti keradangan organ dan penyakit kardiovaskular dan pernafasan [2,3]. Di samping itu, PM boleh melalui penghalang kulit dan terkumpul di dalam folikel rambut dan juga menembusi ke dalam dermis dengan sentuhan berulang; Oleh itu, pendedahan berlebihan kulit kepada PM telah dikaitkan dengan penuaan kulit ekstrinsik, perubahan dalam pigmentasi, dermatitis atopik, jerawat, dan psoriasis [2,4]. Sentuhan berpanjangan dengan PM mendorong pengeluaran berlebihan spesies oksigen reaktif (ROS) dalam keratinosit, yang mencetuskan beberapa laluan isyarat termasuk laluan apoptosis, laluan kinase protein diaktifkan mitogen (MAPKs) dan keradangan. Ekspresi tinggi sikloksigenase-2 (COX-2), faktor nekrosis tumor- (TNF-a), dan interleukin-1 (IL-1 )biasa dilihat dalam keratinosit yang terdedah kepada PM.Selain itu, PM juga mengaktifkan metalloproteinase matriks (MMPs) dan mengakibatkan kehilangan keanjalan kulit dan penuaan [5].

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Produk semulajadi telah lama digunakan sebagai bahan kosmetik yang berkesan. Asid oleano-lik (OA, 3 -hydroxyolean-12-en-28-oicacid), sebatian triterpenoid lima cincin, banyak terdapat dalam tumbuhan, buah-buahan dan sayur-sayuran [6]. OA terkenal dengan kesan perlindungan hepatiknya seperti mengurangkan kerosakan hati akut yang disebabkan oleh kimia dan fibrosis/sirosis dalam penyakit hati kronik [6,7]. Di samping itu, kajian terdahulu telah mendedahkan bahawa OA mempunyai kesan antioksidan, anti-kanser, anti-radang, anti-diabetes, anti-mikrob [8]Kim et al. mendedahkan bahawa OA boleh mengurangkan ekspresi sitokin pro-radang (TNF-a,IL-6)dan protein penuaan kulit (MP-1) dalam keratinosit yang dirawat PM [9]. Walau bagaimanapun, sifat fizikokimia OA menjadikannya sukar untuk larut dalam air, yang mengehadkan penggunaannya dalam ubat-ubatan, makanan dan kosmetik.

Reka bentuk rumusan penghantaran ubat seperti pembawa nano berasaskan polimer, li. posomes, dan nanofibers biasanya digunakan untuk memperbaiki sifat fizikokimia bahan aktif. Enkapsulasi bahan aktif dengan eksipien dalam formulasi farmaseutikal ini boleh meningkatkan keterlarutan air dan penyerapan kulit serta mengurangkan potensi ketoksikan dan kerengsaan pada kulit. Antaranya, nanofibers adalah formulasi bersaiz nano yang baru muncul, dengan luas permukaan yang besar, ketumpatan rendah, dan isipadu liang yang tinggi, dan sudah digunakan secara meluas dalam bioperubatan, yang boleh mengurangkan jumlah ubat oral, meningkatkan kestabilan bahan aktif, mengawal melepaskan, meningkatkan bioavailabiliti, dan membuat tisu buatan [10]. Electrospinning adalah teknologi biasa yang digunakan untuk menghasilkan nanofibers dan sangat serasi dengan pengeluaran besar-besaran [1]. Oleh itu, penyediaan nanofiber menggunakan proses electrospinning secara serentak boleh meningkatkan bioavail. kecekapan dan kecekapan pengeluaran bahan aktif dengan keterlarutan air yang lemah. Polyvinyl pyrrolidone (PVPK90) dan 2-hydroxypropyl- -cyclodextrin (HPBCD) ialah sebatian yang diluluskan oleh FDA untuk melarutkan dan menghantar bahan farmaseutikal aktif hidrofobik pada manusia.kolesterol cistancheKajian terdahulu menunjukkan bahawa gentian nano yang disediakan dengan HPBCD dan PVPK90 telah meningkatkan dengan ketara keterlarutan air dan penembusan kulit resveratrol [12] dan minyak plai [13]. Oleh itu, matlamat kajian ini adalah untuk menggunakan PVPK90 dan HPBCD sebagai pembawa penghantaran untuk menyediakan nanofiber asid oleanolik (OAnf) dan untuk menilai kesan OA dan OAnf dalam keratinosit yang dirawat PM.

Cistanche boleh anti-penuaan

Matlamat kajian ini adalah untuk menilai kesan biologi OA yang dibubarkan dalam DMSO dalam kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM. Untuk mengatasi keterlarutan air OA yang lemah, kami menggunakan PVPK90 dan HPBCD sebagai pembawa penghantaran untuk menyediakan nanofiber asid oleanolik (OAnf) melalui proses pemutaran elektro dan kemudian menentukan perubahan sifat fizikokimia antara OA mentah dan OAnf untuk menjelaskan peningkatan keterlarutan air dan penembusan kulit. Untuk membandingkan kesan biologi selepas proses nanofiber OA, model kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM digunakan untuk menilai aktiviti antioksida, anti-radang dan anti-penuaan OAnf dan OA.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1.Bahan

Oleanolic acid hydrate (OA) telah dibeli daripada Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd. (Tokyo, Jepun). Polyvinyl pyrrolidone (Luviskol" K90 Powder, PVP) telah dibeli daripada Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co.,Ltd. Taipei,Taiwan). Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HPBCD) diperoleh daripada Zibo Qianhui (Zibo, China).Methanol dan dimetil sulfoksida (DMSO) telah dibeli daripada Aencore Chemical (Surrey Hills, Australia). Semua bahan kimia atau reagen untuk kultur sel adalah gred biologi, dan bahan kimia lain bagi penentuan fizikokimia adalah gred kromatografi cecair (HPLC) berprestasi tinggi.

2.2.Ujian Daya Tahan Sel

Penentuan daya maju sel bagi bahan aktif ialah kaedah biasa yang digunakan untuk memilih julat kepekatan yang sesuai untuk bahan aktif untuk menilai aktiviti biologinya. Keratinosit HaCaT telah dibeli daripada Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Itali). Sel HaCaT telah dikultur dalam DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, India) yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin (Hazelton Product, Denver, PA, USA) dengan 1 peratus penicillin-streptomycin (Biological Indus-tries, Connecticut, NE , USA), dan sel HaCaT diinkubasi dalam inkubator (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dengan syarat ditetapkan pada 37 darjah dengan 5 peratus COz. Untuk penyediaan sampel ujian, OA dan OAnf telah dibubarkan dalam DMSO dan PBS, masing-masing, dan kemudian setiap sampel dicairkan dalam DMEM tanpa serum lembu janin untuk penentuan daya maju sel. Sel HaCaT telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 1 × 104 sel/100 μL/telaga selama 24 jam. Medium kultur kemudiannya dikeluarkan, dan sel-sel telah dirawat dengan kepekatan OA dan OAnf yang berbeza antara 5 hingga 80 uM dalam DMEM bebas serum selama 24 jam. Pada masa ujian, medium rawatan telah dikeluarkan, dan 150 μL larutan MTT 0.5 mg/mL dimasukkan ke dalam setiap telaga. Selepas 3 jam pengeraman, larutan MTT telah dikeluarkan, dan kristal formazan ungu setiap telaga telah dibubarkan dalam 100 uL DMSO. Penyerapan pada 550 nm setiap telaga kemudian diukur menggunakan spektro-fotometer mikroplat (BioTek uQuant, Winoski, VT, USA). Daya tahan sel dikira dengan formula berikut:

2.3.Penentuan Kandungan Spesies Oksigen Reaktif(ROS).

PM (Bahan Rujukan Standard,SRMB1649b) telah dibeli daripada Institut Piawaian dan Teknologi Negara. Produk ini dikumpul pada tahun 1976 dan 197 di Washington, DC Made. Sebanyak 10 mg/mL PM telah digantung dalam PBS dan kemudian disonikasi selama 10 minit sebelum digunakan. Sejumlah 1 × 10 tambah keratinosit HaCaT telah dibiakkan dalam 96-plat perigi selama 24 jam di bawah 37 darjah dan 5 peratus keadaan CO2. Sel telah dirawat dengan kepekatan OA yang berbeza dalam DMSO, OA dalam PBS, dan OAnf dalam PBS selama 24 jam, masing-masing. Kemudian, mereka diinkubasi dengan 20 uM dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA;Sigma, Tokyo, Jepun）penyelesaian selama 30 minit. Seterusnya,50 ug/cm² PM dimasukkan ke dalam setiap telaga dan diinkubasi selama 1 jam. Selepas itu, sel-sel telah dibasuh. dua kali dengan PBS, dan keamatan pendarfluor setiap sampel dianalisis menggunakan pembaca plat pendarfluor (pengujaan: 485 nm; pelepasan: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, Amerika Syarikat). Persamaan berikut digunakan untuk mengira peratusan perencatan bagi Pengeluaran ROS:

2.4. Analisis Western Blot

Sebanyak 4 × 105 HaCaT keratinosit telah dibiakkan dalam 6-plat perigi selama 24 jam. Sel kemudiannya dirawat dengan OA atau OAnf dalam medium bebas serum selama 24 jam diikuti dengan penambahan PM. Selepas pelbagai titik masa, sel telah dilisiskan dengan penimbal RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington,MA,USA),kemudian disentrifugasi pada 12,000 rpm selama 10 minit. Kit ujian protein BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) telah digunakan untuk menentukan kepekatan protein. Kemudian, protein diasingkan oleh elektroforesis gel sodium dodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE), dan kemudian disapu pada polivinilidena difluorida(PVDF) mem-branes (Merck Millipore). Membran disekat selama 1 jam dan dicuci dengan garam Tris-buffered( TBS) dengan 1 peratus Tween-20.Membran diinkubasi dengan antibodi primer pada 4 darjah semalaman. Antibodi utama yang digunakan dalam kajian ini termasuk cyclooxygenase-2 (COX-2), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), perencat tisu metallopro-teinase-1 (TIMP-1), kinase protein diaktifkan tekanan/Jun-amino-terminal kinase (SAPK/JNK)(Teknologi Isyarat Sel, Danvers,MA, Amerika Syarikat),GAPDH(Santa Cruz Bi-otechnology, Dallas,TX, USA), matriks metalloproteinase-1 (MMP-1) (Proteintech Group,Rosemont, IL, USA), p380, extra-cellular regulated protein kinase (ERK) dan faktor nuklear kappa-light-chain- penambah sel B diaktifkan (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, Amerika Syarikat). Seterusnya, antibodi sekunder ditambah selama 1 jam pada suhu bilik dan bertindak balas dengan reagen chemilu-minescence yang dipertingkatkan (ECL; Thermo Fisher Scientific). Antibodi terhadap GAPDH digunakan sebagai kawalan dalaman. Setiap ungkapan protein dianalisis menggunakan Touch Imager (e-BLOT; Shanghai, China), dan ungkapan itu dikira menggunakan ImageJ.

2.5. Penyediaan Nanofiber Asid Oleanolik(OAnf)

OAnfs diputar secara elektro dengan nisbah berbeza OA:PVP:HPCD (1:8:5,1:8:10, dan 1:8:20). Larutan electrospun disediakan seperti berikut: 25 mg OA telah dilarutkan dalam 5 mL metanol, dan HPBCD ditambah dan dikacau dengan pengacau magnet untuk mendapatkan larutan yang jelas; kemudian, PVPK90 ditambah serta-merta, dan campuran dikacau selama 1 jam.kesan sampingan cistanche deserticolaGentian nano ditenun menggunakan peralatan pemutar Elektro FES-COS (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Taiwan) di bawah keadaan berikut: picagari 10 mL dengan jarum diameter dalaman 0. 22 mm digunakan untuk electrospinning; kadar aliran telah diselaraskan kepada 0.2 mL/j; voltan yang digunakan ditetapkan pada 12 KV; jarak pengumpul hujung ialah 10 cm. Selepas proses electrospinning, nanofibers dikumpul menggunakan aluminium foil. Nanofibers yang baru disintesis diletakkan di dalam beg plastik bertutup dan disimpan dalam bekas kalis lembapan.

2.6.Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)Analisis Asid Oleanolik

Sistem analisis HPLC (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tokyo, Jepun) terdiri daripada pam L-2130, autosampler L-2200 dan L{{3 }} pengesan ultraviolet-visible (UV-vis). Lajur analisis ialah lajur Mightysil RP-18 GP (250×4.6 mm id.,5 um). Fasa bergerak terdiri daripada metanol dan 0.1 peratus larutan asid asetik glasier dalam nisbah tetap (95:5; w/v). Kadar aliran fasa mudah alih ialah 1 mL/min, dan panjang gelombang pengesanan pengesan UV ditetapkan pada 215 nm. Puncak penyerapan bagi asid oleanolik muncul pada 7.5 min. Keluk penentukuran asid oleanolik menunjukkan linear （r =0.999） yang baik dalam julat 0.01-100 ug/mL.

2.7. Morfologi, Diameter Gentian, dan Ukuran Saiz Zarah OAnf

Sampel gentian nano yang berbeza disalut dengan platinum dengan penyalut ion (E{{0}}, HITACH, Tokyo, Jepun); keadaan ditetapkan pada 10 mA 120 s kemudian. Morfologi dan bentuk setiap sampel diperhatikan oleh mikroskop elektron pengimbasan (Hitachi S4700 Hitachi, Tokyo, Jepun). Diameter setiap sampel dikira oleh perisian imej j. Penganalisis Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, UK) digunakan untuk mengukur saiz zarah OAnf. Saiz zarah OA dan OAnf diukur pada kepekatan 1 mg/mL dan 0.1 mg/mL, masing-masing.dos cistanche redditSelain itu, kami juga memerhatikan keseragaman morfologi OAnf selepas larut dalam air menggunakan mikroskop elektron penghantaran (TEM,JEM{{0}}instrumen EXII,JEOL Co., Tokyo, Jepun). Sampel ujian dilaraskan kepada 1 ug/mL OA dalam air ternyahion dan kemudian dititiskan ke dalam jaringan kuprum, dan kemudian 0.5 peratus (b/v) asid fosfotungstik segera dititiskan. Selepas pengeringan, setiap sampel diletakkan di atas TEM untuk pemerhatian.

2.8. Pemuatan Dadah dan Kecekapan Enkapsulasi OAnf

Adalah sangat penting untuk menentukan pemuatan ubat dan kecekapan pengkapsulan sistem penyampaian untuk menilai prestasi proses farmaseutikal. Pemuatan ubat dikira sebagai peratusan kandungan yang ditentukan dan kandungan teori OA yang terkandung dalam nanofibers OA. Untuk penentuan pemuatan dadah 100 μL setiap sampel telah ditambah ke dalam 900 μL metanol, dan kepekatan OA adalah di mana CoA ialah kepekatan OA daripada OAnf, WoA ialah jumlah teori OA yang ditambah, VoAnf ialah isipadu larutan OAnf.

Kecekapan pengkapsulan menunjukkan sama ada nanofibers berjaya membungkus sebatian aktif. Sampel OAnf telah dilarutkan dalam air ternyahion dan ditambah ke dalam peranti penapis emparan (Microcon YM-10,Millipore, Billerica,MA, USA) dan kemudian diempar pada 12,00 rpm selama 10 minit dengan emparan yang disejukkan (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburg, Jerman). Bahagian berkapsul dikekalkan di dalam tiub atas, dan bahagian yang tidak berkapsul dikumpulkan dari tiub bawah kerana perbezaan berat molekul. Jumlah OA yang tidak berkapsul telah dikesan oleh kaedah HPLC yang disebutkan di atas. Persamaan berikut digunakan untuk mengira kecekapan enkapsulasi:

di mana AoA ialah jumlah teori OA (diperolehi daripada keadaan penyusuan) yang digabungkan ke dalam gentian nano, dan Aunentrapped OA ialah jumlah OA yang tidak terkapsul.

2.9.Keterlarutan Berair OAnf

OA mentah (1 mg) dan formulasi nisbah berbeza OAnf (mengandungi bersamaan 1 mg asid oleanolik) masing-masing dilarutkan dalam 1 mL air ternyahion, dan kemudian disonikasikan di bawah ultrasonikator (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, AS) selama 20 minit. Setiap sampel telah ditapis melalui membran 0.45 um (Pall Corporation, Washington, NY, USA) dan 10-kali ganda dicairkan. Larutan yang dicairkan telah dianalisis oleh HPLC, dan lengkung piawai digunakan untuk menentukan jumlah asid oleanolik untuk dibandingkan dengan keterlarutan akueusnya.

2.10. Penentuan Transformasi Kristal-ke-Amorfus

Difraktometer sinar-X (Siemens D500, Karlsruhe, Jerman) digunakan untuk menganalisis bentuk kristal OA, eksipien dan OAnf. Analisis dijalankan menggunakan sinaran Cu-Ka yang ditapis nikel, menggunakan voltan 40 kV dan arus 25 mA. Kadar imbasan ialah 1 darjah/min, dan julat sudut yang diimbas ialah dari 5 darjah hingga 50 darjah . 2.11. Interaksi Antara Molekul antara OA dan Eksipien

Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dan 1HNuklear resonans magnetik (1H NMR) biasanya digunakan untuk mengesahkan interaksi antara molekul antara bahan aktif dan eksipien. Asid oleanolik, PVP, HPBCD, dan formulasi nisbah berbeza OAnf, masing-masing, dicampur dengan kalium bromida (KBr) dalam nisbah isipadu 1:9 menggunakan mortar dan ditekan ke dalam tablet. Setiap sampel kemudiannya dianalisis oleh spektrofotometer FTIR (spektrofotometer Perkin-Elmer 200, Perkin-Elmer, Norwalk, CT USA). Julat pengimbasan ialah 400-4000 cm-4.Selain itu , setiap sampel telah dibubarkan dalam 0.8 mL sebanyak 99.8 peratus DMSO-dg (Merck, St.Louis, MO, Amerika Syarikat) dan dianalisis oleh spektrometer JEOL Alpha 400 (Nihon Denshi Co., Tokyo, Jepun).

2.12. Penembusan Kulit Ex Vivo Asid Oleanolik dan Nanofibernya

Eksperimen ini telah dilakukan mengikut protokol piawaian garis panduan Persatuan Dandanan dan Perfume Kosmetik Eropah (COLIPA). Sistem sel penyebaran Franz boleh dibahagikan kepada bekas kaca ruang penderma atas dan ruang reseptor bawah. Sebanyak 1.5 mL larutan penimbal yang terdiri daripada 0.14MNaCl,2mMK-HPO4, 0.4 mM KH2PO4 (pH7.4) diletakkan di dalam ruang reseptor dan dikacau dengan bar magnet pada 600 rpm sepanjang eksperimen itu. Kulit sayap segar daripada babi diperoleh daripada penjual daging tempatan di pasaran dan disejukkan semasa tempoh percubaan. Setiap sampel kulit dipotong menjadi kepingan 2 cm × 2 cm dan diletakkan di antara dua ruang, dengan stratum korneum menghadap ke atas. Sel resapan Franz dikekalkan pada 32 darjah dengan mandi air beredar.faedah ekstrak cistancheKemudian, 200 μL 1 mg/mL OA atau OAnf telah ditambah ke ruang penderma selama 1,2, atau 4 jam. Selepas itu, kulit babi dikeluarkan dari sel penyebaran Franz, dan stratum korneum diperolehi dengan pelucutan pita sebanyak 15 kali. Setiap sampel kulit sisa dipanaskan hingga 95 darjah dengan pad haba, dan epidermis dan dermis dipisahkan menggunakan pisau bedah. Setiap sampel direndam dalam metanol dan disonikasi selama 1 jam untuk mengekstrak OA, dan kandungan asid oleanolik dalam setiap sampel ditentukan oleh kaedah HPLC. 2.13. Analisis statistik

Semua data dipaparkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Kesignifikan statistik antara kumpulan berbeza telah dianalisis dengan analisis varians (ANOVA) dengan ujian post hoc Tukey.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. Asid Oleanolik Boleh Menekan Keradangan, Penuaan dan Laluan Isyarat ROS/MAPK dalam Kerosakan Keratinosit Akibat PM

Untuk mencari julat kepekatan yang sesuai untuk penilaian aktiviti biologi, sitotoksik-iti OA yang dibubarkan dalam DMSO ditentukan dalam sel keratinosit HaCaT manusia menggunakan ujian MTT. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A, 40 dan 80 μM OA dikaitkan dengan 32 hingga 16 peratus daya maju sel. OA pada kurang daripada 20 μM masih mempunyai kadar survival sel melebihi 85 peratus. Keputusan ini menunjukkan bahawa OA pada kepekatan 5-20 μM tidak mempunyai kesan sitotoksik pada keratinosit HaCaT manusia (Rajah 1A). Sehubungan itu, OA telah dikaji pada kepekatan 5-20 uM untuk menyiasat aktiviti antioksidan dan antipencemarannya dalam kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM. Baru-baru ini, banyak kajian telah menunjukkan bahawa PM ialah pencemar udara biasa yang menyebabkan pengeluaran berlebihan ROS dan kerosakan seterusnya sistem kulit melalui satu siri tekanan oksidatif, termasuk peroksidasi lipid, karbonilasi protein dan mutasi DNA [14-16]Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, rawatan PM dengan ketara meningkatkan pengeluaran ROS jika dibandingkan dengan kumpulan yang tidak dirawat (p<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Nanofiber Asid Oleanolik Meningkatkan Keterlarutan Air dan Penembusan Kulit Asid Oleanolik Mentah dengan Memperbaiki Sifat Fisikokimia

3.2.1. Morfologi Permukaan Asid Oleanolik dan Nanofibernya

Di bawah pemerhatian SEM, kemunculan HPBCD menunjukkan eksipien sfera dan berliang, dan saiznya adalah kira-kira 20 hingga 50 μm（Rajah2A）.PVPK90 ialah eksipien dengan zarah poligon tidak sekata dan saiz zarah lebih daripada 60 um (Rajah 2B) .Asid oleanolik mentah ialah serbuk berbutir bulat tidak teratur dengan saiz 3-60 um. Rajah 2D-F menunjukkan diameter gentian purata nisbah berat berbeza asid oleanolik: HPBCD:PVPK90 ialah 174.83±19.53nm,219.23±18.93nm, dan 403.17±32.99nm, masing-masing. Didapati nisbah HPBCD yang lebih tinggi (18 HPBCD). :20)membawa kepada OAnf yang mempunyai diameter gentian yang lebih besar (Jadual 1).

3.2.2. Saiz Zarah dan Morfologi OAnf Dibentuk Semula dalam Air

Untuk memerhatikan bentuk zarah dan saiz zarah OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) terlarut dalam air, imej OAnf di bawah skop mikro elektron penghantaran (TEM) menunjukkan bahawa zarah asid oleanolik adalah sfera dan tersebar secara seragam di dalam air (Rajah 3). Saiz zarah juga disahkan oleh penganalisis saiz zarah laser (Jadual 2). Saiz zarah OA dan OAnf ialah 5079.50±384.87 nm dan 302.37±11.91 nm, masing-masing. Indeks polydispersity (PDI) OA dan OAnf ialah 1.63±0.21 dan 0.32±0.02, masing-masing. Keputusan ini menunjukkan bahawa proses electrospinning berkesan mengurangkan saiz zarah OA dengan pengedaran zarah seragam dan mengakibatkan peningkatan luas permukaan.

3.2.3.Pemuatan Ubat, Kecekapan Enkapsulasi dan Keterlarutan Air bagi Gentian Nano Asid Oleanolik

Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 3, peratusan pemuatan OA dalam nisbah eksipien yang berbeza ialah 72.36±10.45 peratus ,84.23±3.62 peratus, dan 98.19±4.82 peratus, masing-masing. Keputusan menunjukkan bahawa nisbah HPBCD yang lebih tinggi menunjukkan kesan pemuatan ubat yang lebih baik. Kecekapan pengkapsulan semua formulasi adalah lebih besar daripada 95 peratus , yang menunjukkan bahawa PVPK90 dan HPBCD berkesan membungkus OA. Selain itu, keterlarutan air OAnf dengan nisbah eksipien yang berbeza ialah 296.14±57.75 ug/mL,395.87±32.77 ug/mL , dan 998.7±58.32 ug/mL, masing-masing.cistanche genghis khanKeputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan dalam HPBCD dalam formulasi secara mendadak meningkatkan keterlarutan air OA mentah. Sebaliknya, keterlarutan air OA mentah tidak dapat ditentukan kerana ia berada di bawah had pengesanan (0.01 ug/mL) dalam kaedah HPLC. Keputusan ini menunjukkan bahawa OAnf 1:8:20 mempunyai lebih daripada 1000-peningkatan keterlarutan air kali ganda jika dibandingkan dengan OA mentah. Oleh itu, dalam kajian berikut, 18:20 OAnf digunakan untuk menentukan aktiviti biologi dalam model kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM.

3.2.4.Perubahan Kristal Asid Oleanolik dan Nanofibernya

Corak pembelauan sinar-X (XRD) OA mentah, eksipien dan gentian nanonya ditunjukkan dalam Rajah 4. OA mentah mempamerkan berbilang puncak pembelauan ciri intensiti tinggi pada sudut imbasan 5 darjah -20 darjah, menunjukkan bahawa OA mentah ialah sebatian kristal. Sebaliknya, corak pembelauan PVPK90 dan HPBCD tidak mempunyai puncak pembelauan ciri-ciri yang jelas. Di samping itu, untuk OA mentah di bawah pemprosesan pemutaran elektro, semua puncak pembelauan ciri OA mentah hilang sepenuhnya, yang menunjukkan bahawa sifat mentah mentah. OA telah diubah daripada kristal kepada amorf (Rajah 4). Mengikut keputusan ini, kita boleh menyimpulkan bahawa asid oleanolik mentah berjaya dikapsulkan ke dalam HPBCD dan dikapsulkan oleh PVPK90 selepas proses nanofiber.

3.2.5.Pembentukan Ikatan Hidrogen Intermolekul antara Asid Oleanolik dan Bahan Eksipien

Interaksi antara molekul OA mentah dan HPBCD dengan PVPK90 ditentukan oleh spektroskopi FTIR, dan hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 5. Spektrum FTIR jelas menunjukkan penyerapan beberapa kumpulan berfungsi kimia OA mentah, termasuk jalur penyerapan pada 3463 cm{{ 3}} (——Getaran regangan OH),1696 cm-1 (——Getaran regangan C=O), dan 1462 cm-l (—getaran regangan CHz)(Rajah 5). Apabila OA, PVPK90, dan HPBCD dikomplekskan untuk membentuk nanofibers, penyerapan kumpulan berfungsi kimia ini jelas beralih kepada penyerapan yang lebih rendah. Penemuan ini menunjukkan interaksi ikatan hidrogen antara molekul antara OA dan HPBCD dengan PVPK90. Di samping itu, kajian ini juga menggunakan 'H NMR untuk mengesahkan interaksi antara molekul OA dan eksipien. Spektrum 1HNMR OA mentah (Rajah 6C) menunjukkan isyarat karboksil pada 812 ppm (H28), proton terikat dua kali pada 85.15 ppm (H12), isyarat proton hidroksi pada 83.38 ppm (H3), dan proton metil (81 ppm). , spektrum HNMR nanofibers OA menunjukkan bahawa isyarat karboksil OA hilang, dan anjakan kimia proton terikat berganda, hidroksi dan metil jelas telah dipindahkan ke atas (Rajah 6). Keputusan ini menunjukkan pembentukan ikatan hidrogen antara molekul antara OA dan eksipien, yang menyokong kejayaan enkapsulasi OA oleh HPBCD dan PVPK90.

3.2.6.Penembusan Kulit Secara In Vitro Asid Oleanolik Mentah dan Nanofibernya

Aktiviti biologi formulasi topikal kebanyakannya bergantung pada penyerapan kulit. Penembusan kulit OA mentah dan nanofibernya ditentukan dalam kulit babi ex vivo. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7, kandungan OA yang lebih rendah（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Nanofiber Asid Oleanolik pada Kepekatan Bukan Sitotoksik Mempunyai Aktiviti Anti-Pencemar yang Lebih Baik dengan Meningkatkan Aktiviti Antioksidan, Anti-Radang dan Anti-Penuaan

Sama seperti OA yang dilarutkan dalam DMSO, OAnf yang dilarutkan dalam PBS pada 40 uM dan 80 uM mengurangkan daya maju sel HaCaT kepada 14.1 peratus dan 5.6 peratus, masing-masing (Rajah 8A). Oleh itu, 10 uM OAnf telah dinilai untuk aktiviti antioksidan dan antipencemaran selanjutnya untuk memahami sama ada OA dan nanofibernya mempunyai keupayaan untuk menghalang pengeluaran ROS yang berlebihan yang disebabkan oleh PM. Rajah 8B menunjukkan bahawa OAnf pada 10 uM ketara mengurangkan pengeluaran ROS yang disebabkan oleh PM. Kami juga mengira kadar perencatan pengeluaran ROS untuk membandingkan aktiviti antioksidan antara OA terlarut PBS dan OAnf. Sepuluh OA mikromolar dalam PBS menghasilkan perencatan 28.3 peratus pengeluaran ROS, dan OAnf mencapai perencatan 97.6 peratus (Rajah 8B). Keputusan ini menunjukkan bahawa OAnf mempunyai aktiviti antioksidan yang lebih baik daripada OA dalam PBS dalam tekanan oksidatif yang disebabkan oleh PM dalam keratinosit. Di samping itu, kami juga membandingkan aktiviti anti-radang kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM. Prarawatan dengan OA mentah dalam PBS tidak dapat menghalang ekspresi protein yang disebabkan oleh PM bagi NF-KB dan COX-2 Sebaliknya, prarawatan dengan OAnf dalam PBS mengurangkan ekspresi NF dengan ketara. kB dan COX-2 dalam sel yang dirawat PM (m.s<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Perbincangan

Baru-baru ini, pemantauan kepekatan bahan zarahan di udara telah menjadi salah satu petunjuk terpenting yang digunakan untuk menilai indeks kualiti udara. Kulit adalah organ imun terbesar manusia, dan pendedahan berlebihan PM boleh merosakkan fungsi kulit. Jin et al. mendedahkan bahawa pelbagai jenis PM bukan sahaja tinggal di luar stratum korneum epidermis tetapi juga menembusi ke dalam stratum spinosum dan folikel rambut [14]. Jika terdedah kepada PIA yang berlebihan untuk masa yang lama, ini akan menyebabkan disfungsi penghalang kulit dan dikaitkan dengan banyak penyakit kulit, seperti dermatitis atopik, psoriasis, jerawat, dan penuaan [19,20]. Dijkhoff et al. jelas menggambarkan bahawa PM boleh mencetuskan pembentukan ROS eksogen dan endogen, mengakibatkan perkembangan tekanan oksidatif, termasuk peroksidasi lipid, pengoksidaan protein, disfungsi mitokondria, kerosakan DNA, pengaktifan keradangan, dan pecutan proses penuaan [15]. Sehubungan itu, mengatasi pengeluaran ROS yang disebabkan oleh PM adalah strategi yang baik dan pilihan pertama untuk mencegah kerosakan tekanan oksidatif semasa pendedahan berlebihan PM. Kajian terdahulu juga telah menunjukkan bahawa rawatan antioksi-dant, seperti diphlorethohydroxycarmalol [21], dieckol [22], ekstrak Opuntia humifusa [23], dan ekstrak ceri tart [24] boleh melemahkan disfungsi keratinosit akibat PM dengan berkesan. Keputusan kami juga mendapati bahawa OA dalam DMSO boleh mengurangkan ROS akibat PM berbanding pengeluaran dan menghalang kerosakan daripada PM. Selain itu, NF-kB ialah faktor transkripsi di mana-mana dan boleh diinduksi yang mengawal selia ekspresi protein proinflamasi, seperti COX-2, yang memainkan peranan penting dalam banyak penyakit kulit. Keputusan kami menyebut bahawa OA boleh mengurangkan pengaktifan NF-kB akibat PM untuk menghalang ekspresi protein radang COX-2[25]. Selain itu, pengaktifan isyarat MAPK boleh meningkatkan ekspresi AP-1 dan membawa kepada peraturan transkrip Ahli Parlimen[18]. Dalam kajian ini, OA dapat menyekat ekspresi MP protein penuaan kulit-1 dan meningkatkan ekspresi TIMP protein anti-penuaan kulit-1 untuk mencegah penuaan keratinosit akibat PM. Hasil kajian kami juga menunjukkan bahawa OA telah menghalang fosforilasi JNK dengan berkesan Oleh itu, OA boleh menghalang keradangan kulit yang disebabkan oleh PM dan penuaan dengan mengurangkan kawal selia laluan isyarat ROS/JNK dalam kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM.

Untuk pengetahuan terbaik kami, keterlarutan air yang lemah bagi sebatian aktif dikaitkan dengan bioavailabiliti yang rendah, yang mengehadkan penggunaannya dalam industri perubatan, makanan, dan kosmetik [26,27]. Adalah diketahui umum bahawa sebatian dengan keterlarutan air yang lemah mempunyai beberapa ciri fizikokimia yang biasa, seperti saiz zarah yang terlalu besar dengan luas permukaan yang lebih rendah, struktur lipofilik, dan bentuk kristal [28]. Keputusan kami juga menunjukkan bahawa OA mentah mempunyai sifat fizikokimia ini, termasuk saiz zarah yang besar (5079.50±384.87 nm), serbuk berbutir tidak sekata 3-60 um dengan luas permukaan yang lebih rendah (Rajah 2C), dan bentuk kristal yang jelas. Keputusan ini menunjukkan bahawa kebolehlarutan air OA adalah lebih rendah daripada 0.01 ug/mL dan boleh dikelaskan sebagai sebatian aktif tidak larut praktikal mengikut klasifikasi keterlarutan air Amerika Syarikat Phar-macopeia(USP)[29]. Jika kelemahan ini tidak dapat diselesaikan, aktiviti OA pada kulit akan menjadi sangat terhad. Kajian ini berjaya menggunakan PVPK90 dan HPBCD sebagai pembawa menggunakan proses electrospinning untuk menyediakan OAnf. Penambahbaikan keterlarutan air ialah indeks utama yang digunakan untuk mengesahkan formulasi farmaseutikal yang optimum, dan keputusan kami menunjukkan bahawa OA:PVPK90:HPBCD pada 1:8:20 mempunyai keterlarutan air yang terbaik Ini menunjukkan bahawa OAnf secara berkesan meningkatkan keterlarutan air mentah. OA bergantung pada nisbah HPBCD. Begitu juga, kajian terdahulu juga telah mendedahkan bahawa nisbah siklodekstrin yang lebih tinggi meningkatkan kapasiti penggubalan formulasi dan menghasilkan peningkatan ketara dalam keterlarutan air dan aktiviti biologi curcumin [30], resvera-trol [12], timol [31] , dan difenoconazole[32].Selain itu, kajian ini juga membandingkan sifat fizikokimia OA mentah dan gentian nanonya untuk menjelaskan mekanisme peningkatan keterlarutan air bagi gentian nano OA.OA yang dihasilkan dalam kajian ini adalah semua filamen dengan saiz nano yang seragam. Keputusan analisis saiz zarah juga menyebut bahawa OAnf yang disusun semula dalam air mempamerkan zarah bersaiz nano dengan kehomogenan pengedaran yang unggul. Keputusan ini menunjukkan bahawa OAnf mempunyai luas permukaan yang lebih besar daripada OA mentah. Selain itu, pembentukan ikatan hidrogen antara molekul antara sebatian aktif dan pembawa juga boleh menyumbang kepada peningkatan keterlarutan air. Spektrum FTIR dan HNMR OAnf menunjukkan bahawa OA mentah telah dikapsulkan dengan berkesan ke dalam HPBCD dan membentuk struktur nanofiber yang stabil dengan PVPK90 melalui pembentukan ikatan hidrogen antara molekul antara OA dan HPBCD/PVPK90. Bentuk kristal yang berubah menjadi bentuk amorf bagi sebatian aktif juga merupakan penunjuk peningkatan keterlarutan air. Corak XRD OAnf menunjukkan bahawa struktur kristal OA mentah telah diubah kepada struktur amorf selepas pembentukan nanofibers. Keputusan yang sama ini juga diperhatikan dalam beberapa sebatian aktif yang dimuatkan dalam nanofibers [12,30]. Diambil bersama, formulasi nanofiber secara berkesan meningkatkan keterlarutan air OA mentah melalui penambahbaikan sifat fizikokimia, termasuk pengurangan saiz zarah, peningkatan luas permukaan, pembentukan ikatan hidrogen dengan pembawa, dan transformasi amorf.

Formulasi topikal yang mengandungi antioksidan adalah berkesan untuk penghantaran ke epidermis dan dermis untuk mengatasi tekanan oksidatif yang disebabkan oleh PM, keradangan, dan penuaan kulit [33]. Berdasarkan pengetahuan tentang penyerapan kulit, stratum corneum adalah faktor pembatas kadar yang menghadkan penembusan kulit dan penyerapan sebatian aktif, mengakibatkan penurunan dalam aktiviti biologi [34]. Hasil daripada penembusan kulit in vitro menunjukkan bahawa OAnf melalui stratum korneum lebih mudah dan cepat daripada OA mentah dan tinggal di epidermis dan dermis dalam jumlah yang banyak. Keputusan ini mengesahkan bahawa OAnf boleh meningkatkan penyerapan kulit OA mentah dengan berkesan. Seterusnya, untuk menentukan sama ada OAnf mempunyai aktiviti antipencemaran yang lebih baik daripada OA mentah, dalam kajian ini, model kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM digunakan untuk membandingkan aktiviti biologi mereka. Keputusan kami menunjukkan bahawa OAnf dalam PBS mempunyai kesan antipencemaran yang lebih baik daripada OA mentah, termasuk pengurangan pengeluaran berlebihan ROS, penurunan ekspresi protein radang (COX-2 dan NF-kB) dan protein penuaan kulit (MP-1), meningkatkan ekspresi protein anti-penuaan kulit (TIMP-1), dan menurunkan fosforilasi JNK. Oleh itu, OAnf boleh menjadi formulasi topikal sebagai agen antioksidan untuk mencegah kerosakan keratinosit yang disebabkan oleh PM.

Secara ringkasnya, OAnf menambah baik sifat fizikokimianya untuk menyelesaikan keterlarutan air yang lemah OA mentah dan juga meningkatkan penyerapan kulit OA mentah dengan ketara. OAnf mempunyai aktiviti antioksidan, anti-keradangan dan anti-penuaan yang lebih baik dalam kerosakan keratinosit akibat PM. Oleh itu, kami mencadangkan bahawa OAnf boleh digunakan sebagai produk penjagaan kulit atau sebagai formulasi farmaseutikal untuk mengelakkan kerosakan kulit akibat PM pada masa hadapan.

Artikel ini diekstrak daripada Antioksidan 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants