Kesan Neuroprotektif Ekstrak Daun Glochidion Zeylanicum Terhadap Ketoksikan H2O2/Glutamat dalam Sel Neuronal Kultur Dan Ketoksikan A -Aruh dalam Caenorhabditis Elegans 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

3.3.Kesan Neuroprotektif Ekstrak GZM terhadap Tekanan Oksidatif Terinduksi Glutamat dalam Sel Neuronal Terkultur (HT22 dan Neuro-2a)

Untuk menyiasat sama ada GZM bertindak terhadap kerosakan oksidatif, tahap ROS intraselular telah diperiksa. Bukti ketoksikan akibat glutamat dalam sel HT22 dan Neuro-2a ditunjukkan oleh peningkatan pengeluaran ROS intraselular (1.7-1.9-kali ganda)(Rajah 4a,b). Pengeluaran ROS intraselular yang disebabkan oleh glutamat jelas dikurangkan dengan rawatan bersama dengan ekstrak GZM (Rajah 4a, b). Kami selanjutnya menyiasat enzim antioksidan endogen untuk menyokong kesan perlindungan ekstrak GZM apabila terdedah kepada glutamat. Ekspresi enzim antioksidan, termasuk glutathione-S-transferase (GST), glutathione peroxidase(GPx),catalase(CAT), dan superoxide dismutase(SOD) telah diukur. Dalam kajian terdahulu kami, kepekatan tertinggi ekstrak GZM （10 ug/mL） dilaporkan mempamerkan aktiviti antioksidan yang kuat secara in vitro dan in vivo [11]. Selaras dengan laporan itu, kepekatan tertinggi ekstrak GZM (10 ug/mL) menunjukkan perlindungan saraf yang kuat dalam sel HT22 dan Neuro-2a (Rajah 2-4). Selanjutnya, ekstrak GZM (10 ug/mL) meningkatkan ekspresi gen enzim antioksidan, termasuk SOD1, SOD2, GPx, GST dan GSTa2, dalam kedua-dua sel HT22 dan Neuro-2a, kecuali untukCAT (Rajah 4c,d ). Keputusan menunjukkan bahawa ekstrak GZM melindungi daripada sitotoksisiti glutamat/H2O2-dengan penindasan pengeluaran ROS intraselular dan induksi ekspresi enzim antioksidan.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

3.4. Kesan Ekstrak GZM pada Ekspresi Laluan SIRT1/Nrf2

Untuk menentukan mekanisme asas kesan neuroprotektif ekstrak GZM, kami menyiasat tahap ekspresi SIRTl dan Nrf2. Kami mendapati bahawa neuron yang dirawat GZM dengan ketara meningkatkan tahap protein SIRTl dan Nrf2 (Rajah 5a, b). Selanjutnya, rawatan GZM berpotensi memodulasi laluan isyarat SIRT1/Nrf2 gen antioksidan terkawal NQO1, GCLM, EAAT3, dan SIRT1 (Rajah 5c, d). Penemuan menunjukkan bahawa ekstrak GZM menambah laluan isyarat SIRT1/Nrf2 untuk menggalakkan pertahanan selular terhadap penghinaan toksik.

3.5.Kesan Ekstrak GZM terhadap Aktiviti Pertumbuhan Neurit dalam Sel Neuro-2a

Untuk mengkaji pembezaan neuron, sel Neuro-2a digunakan sebagai wakil[18]. Selaras dengan kajian terdahulu, kekurangan serum (DMEM ditambah dengan 1 peratus FBS) menyebabkan pertumbuhan neurit dalam Neuro-2a [18]. Neuro-2sel yang dirawat dengan ekstrak GZM menghasilkan peningkatan neuritogenesis. Sel Neuro-2a yang dirawat ekstrak GZM meningkatkan panjang neurit (30.92 um) dan bilangan sel yang mengandungi neurit(52.35 peratus ) jika dibandingkan dengan kawalan (1 peratus FBS) (panjang neurit,16.30 um; galas neurit sel, 22.26 peratus )(Rajah 6a,bg).

cistanche boleh anti penuaan

Untuk memastikan lagi berlakunya aktiviti pertumbuhan neurit, ungkapan penanda pertumbuhan neurit, protein berkaitan pertumbuhan 43 (GAP-43) [19] dan Teneurin-4 (Sepuluh-4) [20] telah ditentukan. Ekstrak GZM secara ketara mengimbangi GAP-43 dan Sepuluh-4 ekspresi pada tahap mRNA dan protein dalam sel Neuro-2a jika dibandingkan dengan kawalan DMSO (1 peratus FBS )(Rajah 6c-f) mencadangkan kesan neuritogenesis ekstrak GZM.

3.6. Kesan Neuroprotektif Ekstrak GZM terhadap A -Induced Paralysis in C.elegans

Untuk mengkaji lebih lanjut kesan neuroprotektif ekstrak GZM dalam vivo, strain transgenik C. elegans yang menyatakan A telah digunakan. Kami mula-mula menyiasat kesan ekstrak GZM terhadap lumpuh akibat A pada cacing transgenik CL4176 dan CL2006. Dalam kajian terdahulu kami, ekstrak GZM menunjukkan ketahanan terhadap tegasan oksidatif dan sifat lanjutan jangka hayat dalam C. elegans pada kepekatan bukan toksik （1-5 ug/mL）【11】. Strain kawalan CL802 (tidak menyatakan A ) tidak menunjukkan kelumpuhan, walaupun rawatan (data tidak ditunjukkan) pada kepekatan yang diuji (1-5 ug/mL).cistanche wirkungKami mendapati bahawa cacing CL4176 yang dirawat dengan ekstrak GZM telah menunjukkan kelewatan dalam PT50 (masa yang diambil untuk 50 peratus daripada nematod lumpuh) jika dibandingkan dengan kawalan DMSO (Rajah 7a) (Jadual S1, Bahan Tambahan). Begitu juga, ekstrak GZM juga mempamerkan kelewatan dalam kelumpuhan yang disebabkan oleh A cacing transgenik CL2006 semasa dewasa (Rajah 7b). Keputusan menunjukkan bahawa ekstrak GZM melindungi C.elegans daripada kerosakan yang disebabkan oleh A.

3.7.Kesan Neuroprotektif Ekstrak GZM terhadap Kecacatan Terinduksi A dalam Tingkah Laku Chemotaxis dalam C.elegans

Untuk menyokong kesan neuroprotektif ekstrak GZM dalam C.elegans, ujian chemotaxis dengan cacing transgenik CL2122 dan CL2355 telah dijalankan. Cacing CL235 transgenik didapati mengekspresikan A 1-42 dalam sel neuron, yang mengakibatkan kecacatan pada kepekaan chemotaxis 【21】. Oleh kerana ekstrak GZM pada kepekatan 1-5 ug/mL melambatkan kelumpuhan dalam cacing transgenik CL4176, 5 ug/mL ekstrak GZM telah dipilih untuk semua eksperimen berikutnya. Untuk menentukan kesan potensi ekstrak GZM pada tingkah laku chemotaxis, kami menggunakan diacetyl sebagai penarik. Keputusan dinyatakan sebagai indeks chemotaxis berbanding dengan kawalan yang tidak dirawat. Pertama, kami mendapati bahawa rawatan ekstrak GZM tidak menjejaskan tingkah laku chemotaxis mutan CL2122 (tegangan kawalan transgenik) (Rajah 7d). Cacing CL2355 yang dirawat dengan ekstrak GZM menunjukkan tindak balas chemosensory yang bertambah baik dengan ketara kepada penarik (diacetyl) berbanding kawalan yang tidak dirawat (Rajah 7c), menunjukkan bahawa ekstrak GZM mempunyai potensi untuk meningkatkan tingkah laku chemotaxis dalam C.elegans terhadap A .bioflavonoid sitrusDiambil bersama, kesan ekstrak GZM pada tingkah laku yang bergantung kepada A bagi C. elegans mungkin memberi peluang untuk menguraikan perlindungan saraf pengantara ekstrak GZM terhadap AD.

4. Perbincangan

Penyakit Alzheimer (AD) adalah keadaan neurodegeneratif yang lazim ditemui dalam populasi warga tua di seluruh dunia [1]. Pada masa ini, tiada rawatan yang memuaskan untuk pelbagai keadaan patologi yang berkaitan dengan AD. Tekanan oksidatif dikaitkan secara intensif dengan penyakit neurodegeneratif, terutamanya AD [3].faedah cynomoriumProduk semulajadi yang mengandungi antioksidan yang kuat boleh digunakan sebagai rawatan alternatif atau untuk pencegahan penyakit neurodegeneratif. Dalam kajian semasa, kami meneroka kesan ekstrak GZM pada neurodegenerasi. Ini ialah laporan pertama yang menerangkan kesan neuroprotektif ekstrak daun GZ secara in vitro (sel neuron kultur HT22 dan Neuro-2a) dan in vivo (C.elegans).

Ketoksikan neuron akibat tekanan oksidatif dianggap sebagai salah satu faktor utama yang bersekutu dengan perkembangan penyakit neurodegeneratif, termasuk AD [3]. Tahap glutamat yang tinggi mengaktifkan pengeluaran ROS, membawa kepada neurotoksisiti, kerosakan sel neuron, dan akhirnya, kematian sel neuron [4,6]. Di samping itu, hidrogen peroksida (H2O2) adalah mediator penting biasa bagi tekanan oksidatif dalam sel neuron [22]. Oleh itu, glutamat dan H2O2 digunakan sebagai agen neurotoksik untuk mendorong kematian sel neuron dalam kajian ini. Untuk mengkaji kesan neuroprotektif terhadap ketoksikan glutamat, sel HT22 neuron hippocampal tikus yang tidak mempunyai reseptor glutamat ionotropik telah digunakan [6]. Sebagai tambahan, neuroblastoma tikus Neuro{11}}sel digunakan secara meluas sebagai wakil dalam kajian pertumbuhan neurit dan pembezaan neuron [23]. Pertama, kesan neuroprotektif ekstrak GZM terhadap ketoksikan akibat H-Oz/glutamat ditentukan menggunakan sel HT22 dan Neuro{16}}a. Kami mendapati bahawa ekstrak GZM memberikan kesan neuroprotektif yang kuat terhadap sitotoksisiti glutamat/H2O{18}}dalam kedua-dua sel HT22 dan Neuro-2a.

Tekanan oksidatif apabila pendedahan glutamat boleh menjadi sebab kemerosotan struktur, kerosakan DNA, dan disfungsi mitokondria, yang memainkan peranan penting dalam kematian sel neuron [6]. Dalam kajian kami, daya maju sel yang dirawat dengan glutamat sahaja adalah sangat rendah (kira-kira 50 peratus lebih rendah) berbanding dengan sel kawalan yang tidak dirawat. Selain itu, peningkatan ketara dalam tahap ROS intraselular dikesan dalam sel HT22 (1.7-kali ganda) dan Neuro-2a (1.9 kali ganda) apabila dibandingkan dengan kawalan yang tidak dirawat. Akibatnya, sitotoksisiti akibat glutamat dalam sel neuron (HT22 dan Neuro-2a) sememangnya didapati bersekutu dengan peningkatan ROS intraselular yang menyokong laporan sebelumnya[24]. Enzim antioksidan endogen, CAT, SOD, GST dan GPx memainkan peranan penting dalam perlindungan saraf dengan menghalang kerosakan selular pengantara ROS [25-27]Kami mendapati bahawa ekstrak GZM boleh mengatasi sitotoksisiti akibat H-Oz/glutamat dengan menekan intraselular. Pengeluaran ROS dan menambah ekspresi gen antioksidan yang sepadan dengan laporan sebelumnya, di mana ekstrak GZ merangsang ekspresi Sod-3 dan Gst-4 dalam C.elegans [11].

Faktor transkripsi NRF2(faktor nuklear erythroid 2-faktor berkaitan 2) ialah tindak balas mekanisme selular utama kepada tekanan oksidatif dan kerosakan sel [28-31]. Laluan isyarat SIRT1/Nrf2 ialah laluan isyarat penting untuk mengimbangi tekanan oksidatif, yang terlibat secara aktif dalam pelbagai penyakit neurodegeneratif [25,26]. SIRT1 menguruskan faktor transkrip, termasuk Nrf2, yang bertindak sebagai pengawal selia utama sistem pertahanan antioksidan. Nrf2 mengikat kepada unsur tindak balas antioksidan (ARE), yang membawa kepada peningkatan ekspresi enzim penyahtoksik (fasa II) (GPx, GSTol, dan GSTa2) dan gen antioksidatif (SOD, CAT, NQO1, GCLM, dan EAAT3)[25,26] .Selaras dengan laporan, ekspresi protein SIRT1 dan Nrf2 serta gen antioksidan, termasuk NQO1, GCLM, EAAT3 dan SIRT1, telah dikawal selia semasa rawatan GZM. Selanjutnya, dengan ekspresi enzim antioksidan endogen, SOD, GPx, GSTol, dan GSTa2 juga meningkat dengan ketara, yang mungkin disebabkan oleh pengaktifan Nrf2/ARE. Hasilnya adalah selaras dengan kajian terdahulu kami, di mana ekstrak GZleaf telah ditunjukkan untuk memberikan sifat rintangan tegasan oksidatif dalam C. elegans melalui mekanisme bergantung SKN-1/Nrf-2 [11]. Secara kolektif, penemuan kami mencadangkan bahawa sifat pertahanan antioksidan ekstrak GZM dalam sel neuron berbudaya (HT22 dan Neuro-2a) melibatkan laluan isyarat SIRT1/Nrf2. NRF2 telah ditunjukkan untuk mempengaruhi arah metabolisme glutamat yang berasal dari glutamin, termasuk penjanaan glutation antioksidan (GSH) untuk mengekalkan homeostasis redoks [13]. Dalam kajian ini, kami mula-mula menumpukan pada sifat antioksidan ekstrak GZM melalui laluan isyarat SIRT1/Nrf2, yang merupakan pertahanan antioksidan yang terkenal. Kami mendapati bahawa ekstrak GZM menambah laluan isyarat SIRT1/Nrf2 untuk menggalakkan pertahanan selular terhadap penghinaan toksik. Namun begitu, penyiasatan kesan ekstrak GZM pada laluan isyarat SIRT1/Nrf2 di bawah keadaan ketoksikan yang disebabkan oleh glutamat adalah topik yang menarik untuk mengesahkan sifat antioksidan ekstrak GZM melalui laluan isyarat SIRT1/Nrf2.

Ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan (tekanan oksidatif) telah terlibat dalam perkembangan penyakit neurodegeneratif [1,3]. Sepanjang dekad yang lalu, sebatian polifenol telah diterokai secara meluas dalam kesan neuroprotektif kerana sifat antioksidannya[13,32-35].kaedah pengekstrakan flavonoid pdfSelain itu, sebatian antioksidan tidak langsung [36] (sistem antioksidan sederhana dan laluan berkaitan, tetapi bukan interaksi langsung dengan spesies reaktif) seperti asid docosahexaenoic (DHA)[37], Vitamin K[38], dan asid sinapik [39] telah muncul dalam rawatan alternatif penyakit neurodegeneratif. Memandangkan perkara di atas, penemuan kami disokong kerana kesan berfaedah GZM pada kesan neuroprotektif mungkin bergantung kepada aktiviti antioksidannya.

Neuritogenesis atau pertumbuhan neurit memainkan peranan penting dalam perkembangan neuron [32].gondok gurunSifat pertumbuhan neurit ekstrak GZM ditentukan menggunakan sel Neuro-2a. Ekstrak GZM ditunjukkan untuk melaksanakan aktiviti pertumbuhan neurit kerana ia meningkatkan panjang neurit dan bilangan sel yang mengandungi neurit. Di samping itu, fenomena ini disahkan lagi dengan peningkatan ekspresi penanda pertumbuhan neurit GAP-43 dan Sepuluh-4.Beberapa kajian telah melaporkan bahawa polifenol, termasuk asid gallic [32,34], cate-chin [ 13,40,41] dan quercetin [33,42,43], menggalakkan aktiviti pertumbuhan neurit. Kehadiran sebatian fenolik serta asid gallik, katekin, dan kuersetin dalam ekstrak GZM mungkin bertanggungjawab untuk tingkah laku yang diperhatikan (Tambahan Rajah S1) [1,12].

Plak A dan protein tau adalah ciri terkenal AD [4,45]. Pengeluaran dan pemendapan yang tidak normal memainkan peranan penting dalam patogenesis AD [44].C.el egans ialah organisma model yang berguna untuk memahami neurodegenerasi berkaitan usia [47]Cacing ini mempunyai sistem saraf asas yang hanya mengandungi 302 neuron yang memetakan secara komprehensif sambungan neuron [47]. Selain itu, cacing transgenik mempamerkan pengumpulan karbonil protein dan ROS, serupa dengan patologi AD [48]. Oleh itu, kami memanfaatkan korelasi yang telah ditetapkan antara ekspresi A dan simptom yang jelas, termasuk kelumpuhan dan tingkah laku chemotaxis, dalam model C.elegans transgenik. Fenotip lumpuh dalam A menyatakan (dalam otot) ketegangan CL4176 dan CL2006 pertama kali disiasat. Ekstrak GZM menangguhkan permulaan akibat A dan lumpuh usia dalam cacing transgenik CL4176 dan CL2006, masing-masing. Untuk menghubungkan ketoksikan A dengan fungsi neurologi, tingkah laku chemotaxis A menyatakan ketegangan (dalam neuron)CL2355 telah diterokai. Ekstrak GZM didapati menunjukkan peningkatan dalam kecacatan tingkah laku chemotaxis dalam cacing CL2355 transgenik terhadap A . Secara kolektif, keputusan ini menunjukkan bahawa ekstrak GZM melindungi fungsi otot dan neurologi dalam C elegans daripada ketoksikan yang disebabkan oleh A. Kajian yang pelbagai telah melaporkan bahawa faktor transkripsi DAF-16 dan SKN-1 memainkan peranan penting dalam pemendapan A dalam nematod[47,48]. Dalam kajian terdahulu kami, kami membuktikan bahawa ekstrak daun GZM boleh merangsang rintangan tekanan oksidatif melalui laluan isyarat DAF-16/FoxO dan SKN-1/Nrf-2, yang membawa kepada peningkatan dalam jangka hayat dan kesihatan C. elegans [11]. Kami membuat spekulasi bahawa DAF-16/FoxO dan SKN-1/Nrf-2 mungkin memainkan peranan dalam perlindungan pengantara ekstrak GZM terhadap ketoksikan A.

Beberapa kajian telah melaporkan bahawa antioksidan fenolik boleh melindungi daripada neurotoksisiti yang disebabkan oleh glutamat, peptida A, dan tekanan oksidatif, yang bergantung terutamanya pada laluan isyarat Nrf2/ARE [13,17,49-52]. Ekstrak GZM mengandungi sebatian fenolik termasuk asid gallik, katekin, dan kuersetin (Rajah Tambahan S1)[1,12]. Oleh itu, kesan neuroprotektif yang dimediasi oleh laluan isyarat SIRT1/Nrf2 mungkin terhasil daripada kehadiran sebatian bioaktif dalam ekstrak GZM. Kajian lanjut diperlukan untuk mengesahkan penglibatan kesan neuroprotektif dan meneroka lebih banyak kemungkinan sasaran ekstrak GZM.

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, kesan neuroprotektif ekstrak GZM terhadap ketoksikan yang disebabkan oleh H202/glutamat/A dan sifat pertumbuhan neurit telah ditunjukkan dalam kajian ini. Ekstrak GZM melindungi daripada ketoksikan oksidatif yang disebabkan oleh H4O2/glutamat dengan menghalang pengumpulan ROS intraselular dan meningkatkan enzim antioksidan endogen melalui laluan isyarat SIRT1/Nrf2. Selain itu, ekstrak GZM melindungi daripada ketoksikan yang disebabkan oleh A dalam C. elegans. Sebagai tambahan kepada kesan neuroprotektifnya, ekstrak GZM mempamerkan kesan yang bermanfaat dalam menggalakkan aktiviti pertumbuhan neurit. Antioksidan yang saling berkaitan dalam proses mengatasi ketoksikan yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dan aktiviti mendorong pertumbuhan neurit telah menjadi sasaran utama terapi neuroprotektif. Ekstrak GZM mempamerkan sifat neuroprotektif yang bukan sahaja melindungi terhadap ketoksikan yang disebabkan oleh H202/glutamat/A tetapi juga menggalakkan aktiviti pertumbuhan neurit. Kesan neuroprotektif ekstrak GZM telah berjaya disahkan dalam sel neuron berbudaya (HT22 dan Neuro-2a) dan model C. elegans. Kajian ini mengesahkan, buat kali pertama, kesan neuroprotektif yang berfaedah ekstrak GZM, menunjukkan bahawa G.zeylanicum mungkin merupakan calon pelindung saraf untuk pencegahan dan rawatan AD dan gangguan neurodegeneratif lain yang berkaitan dengan tekanan oksidatif. Walau bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan dalam organisma model yang lebih kompleks untuk menerangi komponen aktif ekstrak GZM dan laluan mekanistik yang terlibat dalam perlindungan saraf untuk menyokong potensi terapeutik ekstrak tumbuhan untuk rawatan alternatif atau tambahan bagi penyakit neurodegeneratif.

Artikel ini diekstrak daripada Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology