Kompleks Protein-Mucilage Susu Nano: Pencirian Dan Kesan Antikanser Bahagian 2

Untuk maklumat lanjut, hubungitina.xiang@wecistanche.com

Klik pautan untuk mengetahui bahagian 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Bahan dan Kaedah

3.1. Bahan

Sekam Plantago ovata (subgoal) dan buah masak Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) dibeli dari Giza, Mesir; pekat protein susu (MP,81.3% protein) dibeli dari syarikat Fonterra (Auckland, New Zealand). Protein kasein dan whey di MPC sebahagian besarnya dalam bentuk asli dan serupa, micellar, kepada yang terdapat dalam susu. Semua bahan kimia yang digunakan adalah ketulenan analisis.

3.2.Penyediaan Isabgol Husk Mucilage (IHM) dan Nabeg Mucilage (NabM)

Isabgol sekamk mucilage (IHM) dan Nabeq mucilage (NabM)telah disediakan mengikut kaedah yang diterangkan oleh El-Maksoud et al. [5]. Secara ringkas, penggantungan sekam isabgol disediakan dengan membubarkan 1.2 g dalam 100 mL air suling dan disucikan dengan larutan aseton. Gel yang dihasilkan disimpan di dalam peti sejuk (4-5 ° C) sehingga digunakan.

Bagi NabM, buah-buahan Nabeq yang telah masak telah dibasuh dengan air paip untuk mengeluarkan kotoran. Buah-buahan segar dipisahkan dari biji dan dicampur dengan air suling pada nisbah 1:10 (w / v) setelah dipotong menjadi kepingan kecil. Campuran itu diadun menggunakan pengisar makmal (Toshiba Mixie, Jepun) dan dibenarkan untuk berdiri selama 12 jam di dalam peti sejuk.

Ekstrak mucilaginous kemudiannya dihalalkan pada 2000 rpm selama 30 minit dan ditapis melalui kain muslin. Mucilage larut likat yang terhasil telah didakan dengan aseton. Mucilage mentah yang diperolehi disimpan di dalam peti sejuk sehingga digunakan.

Untuk tujuan analisis, mucilage dikeringkan dalam ketuhar udara pada 40 °Tanah Cand menggunakan kilang bola MM400 (Retsch, Jerman). Komposisi kimia serbuk mucilage sekam psyllium (PHMP) dan serbuk mucilage Nabeq (NabMP) telah diukur. Kelembapan, protein, lemak, abu, serat mentah, dan jumlah kandungan karbohidrat adalah 8.49, 0.34,0.21,2.13,1.53, dan87.44% untuk PHMP dan 9.18,4.72,2.05,2.05,2.69,1.70, dan78.26% untuk NabMP, masing-masing. Serbuk yang dihasilkan disimpan pada suhu sejuk (4-5 ° C) sehingga analisis lanjut.

Klik untuk mengetahui maklumat lanjut

3.3. Penyediaan Kompleks Protein-Mucilage Susu (MPMC)

Kompleks protein susu (MP) dengan IHM dan NabM disediakan mengikut Morr et al.dengan beberapa pengubahsuaian [44]. Pekat protein susu telah disusun semula dalam air suling (10%). Koloid protein susu yang dihasilkan dicampur dengan IHM dan NabM pada nisbah 1:3 (o/o). pH campuran diselaraskan kepada 10 dan dibiarkan selama 10 minit. Selepas itu, pH diturunkan kepada 3.5 menggunakan 0.1 N HCl dan dibiarkan selama 10 minit lagi. pH kemudiannya diselaraskan kepada pH 4.6 menggunakan 0.5 M NaOH untuk mengumpul penapisan MPMCby pada kertas penapis: MP, serta MPMC yang dihasilkan, telah dikeringkan oleh lyophilization pada -45°CC untuk 24h menggunakan lyophilizer Novalyphe-NL500, Savant Instruments, Holbrook, NY, Amerika Syarikat.

3.4. Ciri-ciri Fizikokimia dan Fungsian

Pengukuran 3.4.1.pH

pH produk yang dihasilkan pada penyelesaian 10% diukur menggunakan meter pH yang ditentukur (HANNA, HI 902 m, Jerman).

3.4.2.Penentuan Ketumpatan Pukal (BD), Ketumpatan Tapped (TD), dan Indeks Carr

Serbuk MPMC dicurahkan ke dalam silinder pengukur 50 mL sehingga 25 mL, sepadan dengan isipadu yang belum diterokai, dan kemudian ketik 5-10 kali sehingga tiada perubahan lanjut jumlah serbuk dicatatkan sepadan dengan isipadu yang diketuk.

Ketumpatan pukal, ketumpatan yang diketuk, dan indeks Carr ditentukan menggunakan persamaan berikut [45]:

(1) BD = jisim/ jumlah yang belum diterokai

(2) TD = jisim/isipadu yang diketuk

73V Indeks Carr (%)= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Indeks Penyerapan Air (WAI) dan Indeks Kelarutan Air (WSD)

Indeks kelarutan air dan penyerapan air MP dan MPMC telah diperiksa mengikut kaedah yang diterangkan oleh Yagc dan Gogus dengan beberapa pengubahsuaian [46]. Sampel (0.5 g) tersebar dalam 10 mL air suling pada 25 ° Cin tiub sentrifuge. Selepas berdiri selama 30 minit, dengan penyongsangan tiub setiap 5 minit, sampel telah disempitkan pada 3500 rpm selama 15 minit. Penapis dipindahkan ke plat aluminium dan dikeringkan selama 3 jam pada 105 ° C. Berat gel yang tinggal direkodkan dan WSI dan WAI ditentukan seperti berikut:

(4) WAI(g/g)= Berat badan gel/Berat kering sampel

(5) WSI%= Berat pepejal kering dalam supernatant ×100/Berat kering sampel

3.4.4. Kecernaan Protein Susu

Kebolehcernaan protein ditentukan mengikut Abd El-Ghany et al. [47]. Secara ringkas, sampel MP dan MPMC telah disebarkan dalam air suling pada kepekatan 6.38 mg/mL, dan pH telah diselaraskan kepada 8.0. Satu mililiter larutan stok enzim yang baru disediakan (1.6 mg/mL trypsin, 3.1 mg/mL chymotrypsin, dan 1.3 mg/mL ER amino peptidase1

(ERAP1) dicampur dengan penggantungan protein pada 37°C. pH direkodkan selepas 10 minit, dan aktiviti enzim ditentukan menggunakan casein sebagai rujukan. Persamaan berikut digunakan untuk mengira kebolehcernaan protein [47]:

(6)% Kebolehcernaan = 210.46-18.10 (pH)

3.5.Phenolic Pecahan PHM dan NabM

Sebatian fenolik sampel mucilage menggunakan analisis HPLC telah dijalankan oleh protokol yang diterangkan oleh Elsayed et al. [48]. Secara ringkas, ekstrak mucilage dianalisis menggunakan sistem HPLC siri Agilent 1260 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, Amerika Syarikat). Pemisahan itu diluluskan menggunakan lajur C18 (100 mm×4.6 mm iaitu,d.,5 um). Fasa mudah alih mengandungi (A) air 0.2% H3PO4, (B)methanol, dan(C) acetonitrile pada kadar aliran 0.6 mL / min. Elute kecerunan adalah mengikut skim seterusnya: 0-11 min (96%A., 2% B);11-13 min (50% A,25%B);13-17min (40% A,30%B);17-20.5 min (50%B,50%C);dan 20.5-30 min (96% A,2% B). Panjang gelombang pengesanan (pengesan UV,284 nm) ditetapkan pada 284 nm. Saiz suntikan adalah 20 μL dan suhu lajur dikekalkan pada 30 ° C. Kompaun diketahui dengan membandingkan masa pengekalan mereka dengan mereka dari standard yang sahih. Keluk penentukuran telah digunakan untuk menilai jumlah kompaun.

3.6.Jumlah Kandungan Fenolik dan Flavonoid MP dan MPMC

Kandungan polifenolik ditentukan oleh kaedah Folin-Ciocalteu dengan beberapa pengubahsuaian [5]. Secara ringkas,2.8 mL milli-Qwater yang mengandungi 10 mg MP atau MPMC bercampur dengan 2 mL 2% natrium karbonat, dan 0.1 mL 50% Reagen Folin-Ciocalteau. Selepas 30 minit inkubasi pada suhu bilik, penyerapan campuran tindak balas diukur pada 750 nm terhadap air deionized sebagai kosong menggunakan spectrophotometer (Hitachi, Model 100-20). Asid Gallic (GA) digunakan sebagai sebatian fenolik standard, dan lengkung standard tujuh mata (0-200 mg / L) dibina. Hasilnya dinyatakan sebagai miligram asid gallik bersamaan per gram protein (GAE / g).

Flavonoidkandungan ditentukan menggunakan kaedah aluminium klorida seperti yang diterangkan sebelum ini oleh Abedelmaksoud et al. dengan beberapa pengubahsuaian [5]. Secara ringkasnya, 2.8 mL milli-Q air yang mengandungi 10 mg MP atau MPMC dicampur dengan 0.1 mL 10% aluminium klorida hexahydrate dan 0.1 mL 1 M kalium asetat. Selepas inkubasi pada suhu bilik selama 40 minit, penyerapan campuran tindak balas diukur pada 415 nm terhadap air deionized sebagai kosong. Quercetin digunakan sebagai standard menggunakan lengkung standard tujuh mata (0-50 mg / L). Jumlah kandungan flavonoid dinyatakan sebagai miligram quercetin setara (QE/g).

3.7. Aktiviti Antioksidan MP dan MPMC

Jumlah kapasiti scavenging radikal bebas MP dan MPMC dinilai menggunakan tiga ujian antioksidan yang berbeza: Stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS), dan radikal Hydroxyl (HS) radikal radikal seperti yang diterangkan sebelum ini oleh El-Maksoud et al. [5].

3.8. Profil Asid Amino MP dan MPMC

Sampel protein adalah asid dihidrolisis menggunakan 6 N HCl menurut Peksa et al. [49. Penganalisis asid amino automatik (AAA 400, INGOs Ltd.) digunakan untuk menentukan asid amino.

3.9. Sifat Rheologi

Sampel disediakan seperti yang diterangkan oleh Barnes [50]dengan beberapa pengubahsuaian. Kelikatan penyelesaian 2.5%(w/w)pada pH7 ditentukan pada 25±1°C menggunakan viscometer Brookfield (DV-II+ Pro, Rheocalc Software, Jerman). Tekanan (σ)dan kelikatan (n) telah diplotkan sebagai fungsi kadar ricih. Indeks konsistensi (K) dan indeks tingkah laku aliran (n) model kuasa-undang-undang telah dikira:

Nilai n sama dengan 1 untuk cecair Newtonian dan berbeza dari 0 hingga 1 untuk cecair yang menipis ricih dan lebih besar daripada 1 untuk cecair penebalan ricih [51].

3.10. Kalorimetri Pengimbasan Pembezaan (DSC)

Sifat terma MP dan MPMC diukur menggunakan kalorimeter pengimbasan pembezaan (PerkinElmer, Amerika Syarikat). Sampel (4-6 mg) diletakkan di dalam plat aluminium dan dimeteraikan. Setiap kuali kemudian dipanaskan hingga 350 ° C dengan aliran gas nitrogen kering pada 20 mL min-I pada kadar pemanasan 10 ° C min-1. Dari puncak endotermik termogram DSC, suhu permulaan denaturasi, suhu peralihan maksimum, dan titik degradasi dianggarkan [52]. Nilai enthalpy peralihan (AH) dari kawasan di bawah puncak endotermik dalam lengkung DSC ditentukan, dan kuali aluminium kosong digunakan sebagai rujukan.

3.11. Spektroskopi Inframerah Empat-Transform (FTIR)

Spektra inframerah antara 600 dan 3500 cm-I diukur pada 25°Cusing ftIR spectrophotometer (QFA Flex, Amerika Syarikat) dengan kaedah pantulan jumlah yang dikurangkan menggunakan resolusi 4 cm-I dan memperoleh 10 imbasan sesaat.

3.12. Mikroskopi Elektron Penghantaran

Mikrostruktur MP dan MPMC divisualisasikan menggunakan mikroskop elektron transmisi (JEOL, JEM 1400 Flash, Jepang) pada 80 kV. Peringkat cryo dalam kaedah pewarnaan negatif digunakan [53].

3.13.Kajian Biologi mengenai MP dan MPMC

Aktiviti Antikanser 3.13.1.In Vitro

Semua baris sel yang digunakan dalam percubaan ini diperolehi daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (ATCC, Manassas, VA, Amerika Syarikat). Dua garis sel kanser manusia digunakan dalam ujian ini: adenokarsinoma susu (MCF-7, ATCCHTB-22TM)dan karsinoma hepatoselular (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). Garis sel fibroblas kulit bukan kanser BJ-1 (ATCC(8) CRL-2522TM) dan payudara epitelium MCF-12F (ATCC CRL-10782TM) juga diuji untuk perbandingan. Garis sel ditanam dalam medium Eagle yang diubahsuai Dulbecco (DMEM / glukosa tinggi, HyCloneTM, Amerika Syarikat)ditambah dengan 10% serum lembu janin (FBS, Gibco, Brazil), 100 penisilin U / mL, 100 ug / mL streptomycin, dan 25 ng / mL amphotericin B(Sigma, Oakville, ON, Kanada) dan dikulturkan pada 37 ° C dengan 5%CO, dalam inkubator lembap. Media budaya digantikan setiap hari dengan medium segar. Apabila sel mencapai 70% pertemuan, mereka terpisah menggunakan 0.25% Trypsin-EDTA(1X) Gibco, Kanada, dan dipindahkan ke kelalang budaya baru. Selepas laluan kedua, sel-sel telah trypsinized dan bersalut dalam plat 96-baik pada kepekatan 2×10* sel / baik. Selepas 24 h inkubasi, medium telah dibuang, dan sel-sel dibasuh dua kali dengan PBS kemudian dirawat dengan 200 μL medium kultur yang mengandungi kepekatan sampel protein yang berbeza (1, 5,10, dan 20ug / mL). Doxorubicin HCl(4 ug/mL) digunakan sebagai kawalan positif, manakala sel yang dirawat dengan medium yang tidak ditambah diambil sebagai kawalan negatif. Plat diinkubasi pada 37 ° CC untuk 24 h dananti-kanseraktiviti sampel ditentukan menggunakan ujian pengambilan merah neutral menurut Repetto et al. [54]. Secara ringkas, selepas tempoh inkubasi, medium digantikan dengan 150 uL pewarna merah neutral (100 mg/mL) dibubarkan dalam medium bebas serum, dan sel-sel telah diinkubasi pada 37°CC untuk 3 h. Seterusnya, sel-sel telah dibilas dengan PBS, dan 150 μL medium wuduk (EtOH/AcCOOH,50∶1)telah ditambah diikuti dengan gegaran lembut selama 10 minit untuk memastikan pembubaran lengkap. Penyerapan diukur pada 540nm menggunakan pembaca plat microtiter (BioTek,96 Well Plates, ELX808, Amerika Syarikat).

di mana Ac adalah penyerap kawalan dan Seperti penyerap sampel. Kematian sel peratusan yang dibentangkan sebagai sitotoksisitas (%)dan kepekatan yang membunuh 50% sel (IC50) dikira untuk setiap sampel.

3.13.2.Penentuan Tahap Protein p53, Bax, Caspase-3, dan Bcl-2

Tahap selular penanda protein apoptosis utama ditentukan selepas 24 h selepas rawatan dengan ICO MP dan MPMC. Secara ringkas, sel Hep G-2, MCF-7, Bj-1, dan MCF-12F dibenih pada 5× 10* sel / baik dalam plat 6-baik. Selepas 24 h inkubasi dengan sampel pada 37 °C, sel-sel dikumpulkan dan lysed kemudian disedekahkan pada 10,000rpm selama 20 minit pada 4°C. Kepekatan protein diukur dalam supernatant oleh Bradford assay [55]. Aktiviti Caspase-3 dianalisis menggunakan kit ujian warna (Abcam, ab39401)mengikut arahan pengeluar [56]. Secara ringkas, 10 mg protein telah ditambah kepada 50 uL substrat Caspase dan isipadu akhir diselaraskan kepada 200 μL menggunakan penimbal tindak balas pada 37 °C, dan campuran itu diinkubasi untuk 1 h dalam gelap diikuti dengan mengukur kepekatan Caspase-3 pada 405 nm.

Tahap penanda pro-apoptotik p53, yang berkaitan X(Bax), dan penanda anti-apoptotik limfoma-sel B-2(Bcl-2)ditentukan dalam lysate sel menggunakan Enzim-Linked Immunosorbent Assay Simple Step ELISA mengikut arahan pengeluar (ab207225, ab119506, dan ab199080; Abcam, Amerika Syarikat), masing-masing [57,58].

3.13.3.Kerosakan DNA yang Disebabkan oleh Perlindungan Tekanan Oksidatif

Ujian kerosakan DNA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Leba et al. [59] dengan sedikit pengubahsuaian. Secara ringkas,3 μL perencat Ribonuclease plasmid RNH1(NM_203387)Human Tagged ORF Clone 10 μg/μL dicampur dengan reagen Fenton (5 mM H2O2 dan 0.3 mM FeSO4 dan 0.6 mM EDTA), dan jumlah akhir diselaraskan kepada 25 μL menggunakan penimbal fosfat (H2POA, 8.3 mM, pH 7.4). Kemudian, penyelesaiannya diinkubasi selama 20 minit pada 37 ° C. Untuk menilai kapasiti perlindungan antioksidan MP dan MPMC terhadap kerosakan DNA yang disebabkan oleh reagen Fenton, 5 μg / mL MP / NabM, MP / IHM, dan MP ditambahkan sebelum inkubasi. RNH1 plasmid DNA(3 μL, 10 μg/μL) digunakan sebagai kawalan perlindungan DNA.

3.13.4.Ujian Kerosakan DNA Genomik Berasaskan PCR

Gen Homo sapiens methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) dikuatkan menggunakan PCR daripada genomik darah yang sebelum ini diekstrak daripada sampel darah sihat menggunakan kit pengekstrakan DNA standard [60]. DNA diinkubasi selama 10 minit dengan atau tanpa reagen Fenton ditambah dengan MP atau MPMC. Serpihan 198-bp telah dikuatkan menggunakan forward5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' dan terbalik 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'primers. Menggunakan 50ng DNA yang dirawat, penguatan PCR dilakukan berikutan termikcycler seterusnya (94°C selama 5 minit, diikuti dengan 25 kitaran denaturasi, 30-an pada 94°C; penyepuhlindapan, 30s pada 60°C; dan sambungan,30 s pada 72°C)untuk 25 kitaran dan 1 kitaran sambungan akhir pada 72°C untuk 5min. Sampel tindak balas PCR telah digunakan untuk elektroforesis gel agarose (2%).

3.13.5. Profil Ekspresi Gen oleh RT-qPCR

Analisis ekspresi gen gen penanda pro-dan anti-apoptotik utama telah dijalankan dengan sel HepG-2, MCF-7, Bj-1 dan MCF-12F yang terdedah kepada data yang diperolehi IC50 (Jadual 3)untuk 72 h. Secara ringkas, jumlah RNA diekstrak menggunakan Total RNA Purification Kit (QIAGEN., Thorold, ON, Canada) mengikut arahan pengeluar. cDNA

sintesis telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini oleh Aboul-Sound et al. [61]. Program pengukuhan dan kekhususan amplikon PCR telah dilakukan dan dinilai dengan penggunaan kitaran haba Rotor-Gene O 5-Plex HRM (Qiagen, Jerman) dengan Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Jerman) seperti yang didokumenkan sebelum ini mengikut protokol standard [61]. Primer berikut digunakan: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); Limfoma sel B 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011); Bcl-2-like protein Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00031192); dan gen penyimpanan rumah (HK) 18S rDNA Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). Program berbasikal haba PCR dan analisis ekspresi gen untuk menentukan perubahan lipatan berbanding gen 18S pada dasarnya dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [61].

3.14.Analisis Statistik

Keputusan yang diperolehi dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Statistik dicapai menggunakan SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, Amerika Syarikat). Ujian pelbagai julat Duncan digunakan untuk menentukan perbezaan yang ketara di antara semua sampel, dan perbezaan dianggap penting pada p<>

4. Kesimpulannya

Kesimpulannya, kajian ini mendedahkan bahawa mencampurkan protein susu denganpolysaccharidesmelalui pembezaan penyelesaian pH adalah teknik yang sesuai untuk kompleksasi. Kompleks mucilage protein susu yang terhasil (MPMC) mempunyai fenolik yang jauh lebih tinggi danFlavonoidkandungan daripada protein susu (MP). Keputusan DSC menunjukkan bahawa kompleksasi MP dengan polysaccharides dengan ketara meningkatkan kestabilan haba dengan peralihan suhu denaturasi. Analisis FTIR dilakukan untuk mengenal pasti kumpulan berfungsi, dan tingkah laku aliran kompleks yang disediakan telah disiasat. WSI dan WAI protein susu meningkat dengan kompleksasi dengan NabM atau IHM. TEM digunakan untuk menggambarkan mikrostruktur kompleks yang disediakan. Sebaliknya, kompleks protein susu yang terhasil dengan mucilage sekam isabgol (HM) atau nabeq mucilage (NabM) dijangka mengatasi protein susu asli dalam kesan antioksidan dan antikanser. Ringkasnya, MPMCexpressed sifat antikanser unik terhadap kanser payudara model dan garis sel karsinoma hepatik (masing-masing MCF7 dan HEPG2) seperti yang dibuktikan oleh ujian pengambilan merah neutral.

MPMC dipertingkatkan kedua-duanyaAntioksidandan aktiviti anti-percambahan. Caspases adalah protein pengawal selia utama yang terlibat dalam induksi apoptosis. Upregulasi caspase 3 protein dan transkrip mRNA (Rajah 9A, B) mengawal protein lain dalam laluan apoptosis, yang dicirikan oleh keruntuhan membran mitokondria dengan pelepasan cytochrome c yang disebabkan oleh Bax dan pengaktifan caspase 9leading kepada penglibatan seterusnya caspase 3. Peraturan atas Casp3, p53, dan Bax, bersama-sama dengan pengurangan ungkapan Bcl-2 mendedahkan bahawa induksi apoptosis MPMCinduced, di mana upregulation p53 akan merangsang ungkapan Bax, yang seterusnya, akan mendorong pelepasan cytochrome c, diikuti dengan pengaktifan caspase-9 dan-3. Lebih-lebih lagi, Bcl-2 diketahui menghalang pelepasan cytochrome c. Dalam kajian kami, downregulation Bcl-2 yang disebabkan oleh MPMC ditunjukkan untuk memudahkan pelepasan cytochrome c yang disebabkan oleh Bax yang tidak bertentangan dan apoptosis berikutnya.

Kesan antikanser kompleks protein-polysaccharide memberikan pencerahan lebih lanjut mengenai kebolehgunaan kompleks ini untuk digunakan dalam pembangunan terapi kanser yang berpatutan dan cekap dengan kesan sampingan yang minimum.