Pengklonan Molekul Dan Pencirian Biokimia Coumarin Glycosyltransferase CtUGT1 Baru Dari Cistanche Tubulosa

untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

ABSTRAK

UDP-glycosyltransferases (UGTs) ialah keluarga enzim penting dan pelbagai fungsi yang terlibat dalam biosintesis metabolit sekunder. Coumarin adalah salah satu rangka produk semula jadi yang paling biasa dengan aktiviti farmakologi calon. Walau bagaimanapun, setakat ini, kebanyakan GT yang dilaporkan daripada tumbuhan mengiktiraf flavonoid sebagai penerima gula. Hanya GT yang terhad boleh memangkinkan glikosilasi kumarin. Dalam kajian ini, UGT baharu telah diklon daripadaCistanche tubulosa, herba Cina tonik tradisional yang berharga, yang banyak dengan pelbagai glikosida seperti glikosida phenylethanoid, glikosida lignan, dan glikosida iridoid. Penjajaran jujukan dan analisis filogenetik menunjukkan bahawaCtUGT1adalah jauh dari segi filogenetik daripada kebanyakan UGT flavonoid yang dilaporkan dan bersebelahan dengan UGT fenilpropanoid. Ujian enzim in vitro yang meluas mendapati bahawa walaupunCtUGT1tidak terlibat dalam biosintesis glikosida bioaktif dalamCistanche tubulosa, ia boleh memangkinkan glikosilasi coumarins umbelliferone 1, esculetin 2, dan hymecromone 3 dalam hasil yang banyak. Produk glikosilasi dikenal pasti dengan perbandingan dengan piawaian rujukan atau spektroskopi NMR, dan keputusan menunjukkan bahawaCtUGT1boleh memangkinkan glikosilasi hidroksil kumarin secara spesifik pada kedudukan C7- OH. Sisa utama yang ditentukanCtUGT1Aktiviti dibincangkan selanjutnya berdasarkan pemodelan homologi dan analisis dok molekul. Digabungkan dengan keputusan mutagenesis terarah tapak, didapati bahawa H19 memainkan peranan yang tidak boleh digantikan sebagai asas pemangkinan yang penting.CtUGT1boleh digunakan dalam penyediaan enzim glikosida kumarin bioaktif.

Kata kunci:Glikosiltransferases tumbuhan, glikosida Coumarin,Cistanche tubulosa, Pemodelan homologi, mutagenesis terarah tapak

Klik untuk produk faedah ekstrak cistanche

pengenalan

Glikosilasi adalah salah satu jenis pengubahsuaian struktur yang paling biasa bagi produk semula jadi sekunder. Glikosilasi boleh mengubah kestabilan dan/atau keterlarutan aglikon, dan menyumbang banyak kepada kepelbagaian produk semula jadi/tidak semulajadi disebabkan oleh pelbagai jenis konjugasi. Dalam tumbuhan, tindak balas ini biasanya dijalankan oleh glycosyltransferases (UGTs) yang bergantung kepada uridin difosfat (UDP), sejenis enzim yang memangkinkan pemindahan gugus monosakarida daripada gula nukleotida diaktifkan kepada molekul penerima glikosil yang boleh menjadi karbohidrat, glikosida, oligosakarida. , atau polisakarida [1,2]

Sehingga kini, banyak gen pengekodan UGT telah diasingkan daripada beberapa tumbuhan [3]. Glikosilasi terutamanya berlaku pada kumpulan hidroksil atau kumpulan karboksil dari pelbagai produk sekunder, seperti flavonoid [4], fenilpropanoid [5], terpenoid [6], steroid [7], alkaloid [8], dan sebagainya. Coumarins ialah metabolit fenilpropanoid yang diedarkan secara meluas dalam banyak spesies tumbuhan. Kumarin yang wujud secara semula jadi sering wujud sebagai glikokonjugat, dan derivatif ini mempamerkan spektrum aktiviti farmakologi yang luas, termasuk antioksidan [9], antivirus [10,11], hepatoprotektif [12], anti-radang [13], anti-kanser [14]. ], aktiviti perencatan antimutagenik [15], dan kolinesterase (ChE) & monoamine oxidase (MAO) [14,15], dsb. Walau bagaimanapun, sehingga kini, berbanding dengan UGT flavonoid yang paling kerap dilaporkan dan disiasat secara meluas, hanya UGT terhad yang dilaporkan mampu memindahkan bahagian gula kepada kumarin [16–18].

Tumbuhan yang kaya dengan pelbagai glikosida boleh berfungsi sebagai kumpulan gen ideal UGT dengan aktiviti pemangkinan baru. Tambahan pula, banyak UGT telah dilaporkan mempunyai pergaulan penerima yang besar untuk memangkinkan glikosilasi pelbagai substrat, beberapa daripadanya bahkan tidak dipisahkan dalam tumbuhan [19]. Dalam artikel ini, glikosiltransferase novelCtUGT1dikenal pasti daripadaCistanche tubulosa, herba perubatan tradisional yang banyak dengan pelbagai glikosida seperti phenylethanoid glycosides (PhGs), lignan glycosides, dan iridoid glycosides. Ungkapan heterolog dan pencirian fungsi menunjukkan bahawa walaupun rekombinanCtUGT1tidak terlibat dalam biosintesis glikosida ini dalamCistanche tubulosa, ia boleh memangkinkan glikosilasi kumarin hidroksil, dan tindak balas secara regiospesifik berlaku pada kedudukan 7- OH kumarin umbelliferone 1, meningkat 2, dan himecromone 3 untuk menghasilkan tiga sebatian aktif secara farmakologi penyaringan (1a), cichoriin (2a) , dan 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) dengan hasil yang besar, masing-masing. Di samping itu, substrat benzofenon 4,4'-dihydroxy benzophenone (4), substrat isoflavon genistein (5), dan substrat antrakuinon aloe-emodin (6) juga boleh diterima olehCtUGT1. Sifat pemangkin dan sisa utama yang menggariskan keupayaan pemangkinanCtUGT1juga dinilai berdasarkan pemodelan homologi, analisis AutoDock, dan mutagenesis terarah tapak.

2. Eksperimen

2.1. Bahan tumbuhan dan bahan kimia

Cistanche tubulosayang digunakan dalam kajian ini dikumpulkan dari kawasan gurun di Hetian, wilayah autonomi Xinjiang. Identiti botani mereka telah disahkan oleh Profesor Pengfei Tu di Universiti Peking. Kumarin yang diuji dan substrat lain dalam kajian ini telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika Syarikat), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China) dan Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, China). ) melainkan dinyatakan sebaliknya. Piawaian rujukan skimming (1a) dan cichoriin (2a) telah dibeli daripada Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, China).

2.2. Pengklonan molekul CtUGT1 dari Cistanche tubulosa

Jumlah RNA bagiCistanche tubulosatelah diekstrak daripada batang berdaging menggunakan Kit RNA Tumbuhan OMEGA (GA, USA) dan ditranskripsi terbalik kepada cDNA dengan Kit reagen PrimeScript™ RT (TaKaRa, Jepun) mengikut arahan pengilang. Primer yang merosot telah direka untuk 3′RACE berdasarkan jujukan asid amino dalam kotak PSPG (Glycosyltransferases Produk Sekunder Tumbuhan) yang dipelihara bagi tumbuhan glycosyltransferases. Penguatan 3'-hujung dan 5'-hujungCtUGT1telah dijalankan menggunakan Kit Penguatan cDNA Smart RACE (Clontech, USA) mengikut protokol pengeluar menggunakan primer (Jadual S1). CDNA penuh panjangCtUGT1telah dikuatkan oleh PCR menggunakan KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Jepun) dengan pasangan primer khusus gen (Jadual S1) di bawah keadaan berikut: langkah denaturasi awal pada 94 ◦C selama 2 minit, diikuti oleh 35 kitaran denaturasi pada 98 ◦C selama 15 s, penyepuhlindapan pada 55 ◦C selama 30 saat, dan lanjutan pada 68 ◦C selama 55 s, dengan langkah lanjutan akhir pada 68 ◦C selama 7 minit. Semua serpihan DNA yang diperolehi telah diklonkan ke dalam vektor pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China) dan dijujukan.

2.3. Penjajaran jujukan dan analisis filogenetik

Penjajaran jujukan bagiCtUGT1dengan glycosyltransferases yang dilaporkan (Jadual S2) telah dilakukan menggunakan pakej perisian DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Kanada). Motif dan domain dianalisis menggunakan alat domain terpelihara (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). Pokok filogenetik telah dibina dengan membootstrap MEGA 7.0.14 perisian menggunakan kaedah penyatuan jiran dengan 1000 replika bootstrap [20]. Urutan protein yang diterjemahkan daripadaCtUGT1telah diselaraskan dengan glikosiltransferases tumbuhan yang diketahui yang disimpan dalam pangkalan data NCBI GenBank (Jadual S3) dengan ClustalW.

2.4. Ekspresi heterolog dan pembersihan protein CtUGT1 dalam Escherichia coli

Kawasan pengekodan bagiCtUGT1telah dikuatkan dengan BamH I dan Not I sebagai tapak sekatan menggunakan primer yang ditunjukkan dalam Jadual S1. Reaksi PCR dijalankan menggunakan KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Osaka, Jepun). Urutan yang diperoleh telah disahkan dengan mengklon ke dalam vektor pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China). Produk penguatan yang disahkan daripadaCtUGT1kemudiannya dicerna dan diklonkan ke dalam vektor ungkapan pET-28a( tambah ) (Novagen, Amerika Syarikat). Konstruk yang disahkan kemudiannya diubah menjadi E. coli Transetta (DE3) untuk mendapatkan terikan rekombinan. Kultur terikan rekombinan semalaman disuntik ke dalam medium Luria-Bertani (LB) yang mengandungi 50 ug⋅mL− 1 kanamisin dan 40 ug⋅mL− 1 kloromisetin pada nisbah 1:1{{ 19}}0. Kultur ditanam pada suhu 37 ◦C, 200 rpm sehingga nilai OD600 mencapai 0.4–0.6. Isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) kemudiannya ditambah kepada kepekatan akhir 0.5 mM dan sel-sel telah ditanam selama 16 jam pada 18 ◦C, 180 rpm. Kemudian pelet sel dituai dengan sentrifugasi (7600 × g, 10 min, 4 ◦C), dan digantung semula dalam 3 mL/g penimbal lisis sejuk (Data Tambahan Nota 1), dan terganggu oleh sonication pada ais. Serpihan sel telah dikeluarkan dengan sentrifugasi pada 7600 ×g, 4 ◦C selama kira-kira 30 minit. Lajur Histrap yang telah diseimbangkan (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) telah digunakan untuk kromatografi pertalian mengikut arahan pengilang. Protein rekombinan telah dielusi oleh 10 isipadu lajur penimbal elusi (Data Tambahan Nota 1) yang mengandungi 250 mM imidazole. Ketulenan protein dianalisis oleh 10 peratus SDS-PAGE. Protein yang disucikan ditumpukan oleh tiub ultrafiltrasi 30 kDa (Sigma-Aldrich, Amerika Syarikat) dan dinyahgaram menggunakan lajur PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) dengan penimbal penyahgaraman (Nota Data Tambahan 1). Kepekatan protein ditentukan oleh kaedah Bradford menggunakan BSA sebagai piawai.

2.5. Ujian aktiviti enzimatik dan kekhususan substrat CtUGT1

Untuk menyiasat aktiviti glikosilasi bagiCtUGT1, ujian enzim dilakukan dalam campuran tindak balas (150 μL) yang terdiri daripada 0.4 mM aglikon, 0.8 mM UDP-glukosa (UDPG) dan 50 ug tulenCtUGT1protein dalam penimbal penyahgaraman. Semua tindak balas telah diinkubasi pada 3{17}} ◦C selama 12 jam dan ditamatkan dengan menambah 300 μL metanol sejuk. Campuran telah disentrifugasi pada 15,000 ×g selama 30 minit untuk mengumpul supernatan untuk analisis HPLC-UV/ESI-MS. Tiga ujian selari telah dijalankan secara rutin untuk setiap tindak balas. HPLC (Agilent 1260, USA) dilengkapi dengan pengesan tatasusunan diod dan lajur CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Shiseido, Jepun) pada kadar aliran 1 mL⋅min− 1, dan suhu lajur dikekalkan pada 30 ◦C. Fasa bergerak terdiri daripada A (iaitu, 0.1 peratus larutan akueus asid formik) dan B (iaitu, asetonitril). Program kecerunan telah disenaraikan dalam Jadual S4. Data HRESI-MS telah direkodkan pada sistem LCMS-IT-TOF, dipasang dengan antara muka ESI (Shimadzu, Kyoto, Jepun) dengan ketulenan ultra tinggi He sebagai gas perlanggaran, dan N2 sebagai gas nebulizing. Parameter sumber ESI yang dioptimumkan adalah seperti berikut: kadar aliran gas sarung, 1.5 mL⋅min− 1; kadar aliran gas tambahan, 1.5 mL⋅min− 1; voltan semburan, 4.5 kV; suhu kapilari, 200 ◦C. Spektrum telah direkodkan dalam julat 100-1500 m/z untuk analisis MS imbasan penuh.

2.6. Kesan masa tindak balas, nilai pH dan suhu ke atas aktiviti enzim, dan kajian kinetik CtUGT1

Kesan masa tindak balas, nilai pH, dan suhu ke atas aktiviti enzimCtUGT1telah diuji menggunakan UDPG sebagai penderma gula dan 3 sebagai penerima gula dalam keadaan tindak balas seperti yang diterangkan di atas. Untuk penentuan pH optimum, aktiviti enzim telah dibandingkan dalam penimbal 100 mM (asid sitrik‑natrium sitrat) dengan nilai pH antara 3.0 hingga 6.{{ 14}}, 10{{20}} penimbal mM (KH2PO4-K2HPO4) dengan nilai pH antara 6.0 hingga 8.{{29} }, 100 penimbal mM (Tris-HCl) dengan nilai pH berjulat dari 7.0 hingga 9.0, penimbal 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) dengan nilai pH antara 9.0 hingga 11.0. Untuk menguji suhu tindak balas yang optimum, tindak balas telah diinkubasi pada pelbagai suhu antara 0 hingga 65 ◦C. Kursus masa tindak balas dinilai pada 12 titik masa yang berbeza antara 0 dan 24 jam. Semua eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda. Campuran tindak balas telah dianalisis oleh HPLC-MS seperti yang diterangkan di atas. Untuk kajian kinetik bagiCtUGT1, ujian enzimatik dilakukan dalam volum akhir 100 μL yang mengandungi 100 mM KH2PO4-Penimbal K2HPO4 (pH 8.0), 25 ug penulenCtUGT1, 3 mM UDPG, dan kepekatan yang berbeza-beza (50–3000 μM) daripada 3. Tindak balas dijalankan pada 37 ◦C selama 30 minit dan kemudian ditamatkan dengan 100 μL metanol ais sejuk. Kesemua tindak balas ini dilakukan dalam tiga kali ganda, dan aktiviti enzim dinilai melalui kuantifikasi derivatif glukosilasi yang sepadan. Parameter kinetik, termasuk pemalar Michaelis-Menten (Km) dan Vmax, dikira dengan analisis regresi tak linear menggunakan perisian GraphPad Prism 5.

2.7. Pemilihan substrat dan penderma gula CtUGT1

Untuk meneroka keutamaan substrat bagiCtUGT1, sejumlah 27 substrat yang tergolong dalam jenis struktur yang berbeza telah diuji menggunakan UDPG sebagai penderma. Maklumat kimia mereka disenaraikan dalam Jadual S5, dan struktur mereka ditunjukkan dalam Rajah. S1 dan S2. Untuk menyiasat selektiviti penderma gula bagiCtUGT1, ujian dijalankan menggunakan umbelliferone (1), esculetin (2), hymecromone (3), 4,4'-dihydroxy benzophenone (4), genistein (5), dan aloe-emodin (6) sebagai substrat dengan UDPG, UDP- N asetil galactosamine, UDP-galaktosa, GDP-mannose, GDP-fucose, UDP galacturonic acid, UDP-rhamnose sebagai penderma gula, masing-masing. Semua eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda. Campuran tindak balas telah dianalisis oleh HPLC-MS seperti yang diterangkan di atas.

2.8. Penyediaan 4-methylumbelliferyl glucoside (kompaun 3a) oleh CtUGT1

Campuran tindak balas persediaan terdiri daripada {{0}}.034 mmol substrat sebatian 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg ditulenkanCtUGT1dalam 50 mL penimbal tindak balas. Tindak balas digoncang perlahan-lahan pada keadaan optimum (100 mM KH2PO4-K2HPO4 dengan pH 8.0; 37 ◦C). Selepas pengeraman pada 37 ◦C selama 24 jam, supernatan tindak balas dipisahkan dengan kromatografi lajur dengan resin makroporous (MCI GEL CHP) selepas mengempar pada 12,000 ×g selama 30 minit. Fasa bergerak ialah elusi kecerunan 100 peratus air kepada 100 peratus metanol. Setiap pecahan dianalisis oleh HPLC-UV. Pecahan yang mengandungi hanya produk yang disasarkan telah disejat kepada kekeringan di bawah tekanan yang dikurangkan dan dicirikan oleh spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR) 1H dan spektroskopi 13C NMR.

2.9. Pelabuhan molekul dan mutagenesis terarah tapak CtUGT1

Model protein bagiCtUGT1telah ditubuhkan dengan menggunakan SWISS-MODEL [21–25]. Struktur kristal Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) telah dipilih sebagai struktur templat [26]. Model yang telah ditetapkan telah dinilai oleh VERIFY-3D [27,28]. Vina Auto-Dock digunakan untuk kajian dok molekul [29]. Struktur kristal UGT74F2 [30], glycosyltransferase daripada Arabidopsis thaliana, dalam kompleks dengan ligan UDP dan asid salisilik (PDB ID 5U6M) digunakan sebagai struktur kawalan untuk poket penderma gula dan analisis poket penerima gula. . Auto-Dock-Tools 1.5.6 daripada MGLTools (alat Makmal Grafik Molekul) digunakan untuk menyediakan UDPG penderma gula dan substrat 1, 2 untuk dok molekul. Rantai sisi residu di sekeliling rongga tapak aktif ditetapkan fleksibel, dan ikatan ligan yang boleh diputar dibiarkan bebas untuk berputar. Pose kedudukan teratas seperti yang dinilai oleh model dok Vina dengan pertalian tertinggi (kcat/ mol) tertakluk kepada analisis visual menggunakan perisian PyMOL 2.0.

Untuk penyiasatan mutagenesis, urutan gen yang dioptimumkan bagiCtUGT1(Data tambahan Nota 2) telah disintesis dan diuji sebagai jenis liar. mutagenesis terarah tapak bagiCtUGT1telah dijalankan menggunakan Sistem Mutagenesis Pantas (TransGen Biotech). Mutan telah dikuatkan daripada templat gen yang dioptimumkan yang telah dibina ke dalam vektor-28pET menggunakan primer khusus yang ditunjukkan dalam Jadual S1. Mutan yang dibina telah disahkan oleh PCR dan penjujukan sebelum diubah menjadi E. coli (DE3) untuk ekspresi heterolog. Pembersihan protein dan tindak balas enzim telah dilakukan dan dianalisis seperti yang diterangkan di atas.

3. Keputusan dan perbincangan

3.1. Pengklonan cDNA penuh gen CtUGT1 daripadaCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) ialah herba perubatan tradisional Cina yang menghasilkan pelbagai jenis glikosida semulajadi bioaktif. Seharusnya terdapat sejumlah besar gen glikosiltransferases baharu yang wujud dalam genomnya. Untuk mendapatkan glycosyltransferases novel dengan aktiviti pemangkinan yang menarik, primer yang merosot untuk 3'-RACE telah direka berdasarkan motif PSPG yang dipelihara untuk mengklon UGT permisif daripadaCistanche tubulosa. Urutan akhir 3' yang diperoleh telah dianalisis selanjutnya oleh letupan NCBI dan primer khusus untuk 5'-RACE telah direka berdasarkan urutan yang diperolehi. Hujung cDNA 5′ yang diperkuat dan hujung cDNA 3′ telah disambung dan panjang penuhCtUGT1jujukan, termasuk 1739 nukleotida, telah diperolehi (Rajah S3) dan disenaraikan dalam data Tambahan Nota 3. Selepas itu, bingkai bacaan terbuka (ORF) daripadaCtUGT1telah ditemui oleh alat NCBI ORF Finder dan urutan pengekodan 1482 bp berjaya diklonkan oleh penguatan RT-PCR menggunakan primer khusus dalam Jadual S1. Urutan cDNA CtUGT1 telah diserahkan kepada NCBI (No. penyertaan MW629113).

3.2. Analisis jujukan dan ekspresi heterolog CtUGT1

TheCtUGT1gen dijangka mengekod protein 493 sisa asid amino dengan anggaran jisim molekul 55.78 kDa. Letupan NCBI mendedahkan bahawa urutan protein yang disimpulkan daripadaCtUGT1berkongsi identiti tertinggi (76.39 peratus ) dengan enzim seperti UGT86A1-. Fungsi biokimia enzim jenis ini belum dicirikan sepenuhnya. Ia diramalkan bahawa mereka mungkin terlibat dalam penyesuaian tumbuhan kepada tegasan abiotik. Penjajaran jujukan asid amino CtUGT1 dan glikosiltransferases tumbuhan lain ditunjukkan dalam Rajah S4.

44 sisa motif PSPG yang sangat terpelihara ditemui di terminal CCtUGT1. Dalam kotak PSPG, urutan peptida HCGWNS terletak pada asid amino ke-373, yang telah dikesan dalam 95 peratus daripada semua glycosyltransferases [31]. Sisa terakhir motif PSPG ialah glutamin, yang menunjukkan bahawa enzim ini cenderung menggunakan UDPG sebagai penderma gulanya [32] (Rajah S4). Pokok filogenetik telah dibina berdasarkan urutan polipeptida yang diramalkanCtUGT1dan pelbagai jenis glikosiltransferase asal tumbuhan yang terlibat dalam biosintesis pelbagai metabolit sekunder. Setakat ini, kebanyakan glikosiltransferases daripada tumbuhan mengiktiraf flavonoid sebagai substratnya, seperti flavon 7-O-glycosyltransferases, flavonoid 3-O-glucosyltransferases, isoflavon 7-O-glycosyltransferases, dan chalcone glycosyltransferases. Keputusan analisis filogenetik menunjukkan bahawaCtUGT1belum dikelompokkan ke dalam klad flavonoid GT. Sebaliknya, ia terletak bersebelahan dengan UGT74T1 dan UGT74S1 (lignan glycosyltransferases daripada Linum usitatissimum) dan NtGT2 (coumarin glycosyltransferase daripada Nicotiana tabacum), yang menunjukkan bahawaCtUGT1mungkin mempunyai beberapa aktiviti pemangkinan baru terhadap substrat fenilpropanoid (Rajah 1), terutamanya dianggap bahawa hanya ahli terhad yang telah dikenal pasti secara fungsional kepunyaan klad ini.

Untuk mendedahkan lagi aktiviti pemangkinannya, theCtUGT1jujukan telah dinyatakan di bawah kawalan promoter lac T7 dalam sel E. coli Transetta (DE3) sebagai protein gabungan yang ditag-Nya. Rekombinan yang ditag-NyaCtUGT1telah disucikan dengan cekap kepada kehomogenan oleh kromatografi pertalian Ni-NTA. Berat molekul CtUGT1 rekombinan yang telah disucikan adalah kira-kira 55 kDa (Rajah S5), yang konsisten dengan jisim molekul yang diramalkan.

3.3. Kekhususan substrat penerima in vitro CtUGT1

Untuk menguji aktiviti glikosilasiCtUGT1, ujian enzimatik in vitro telah dilakukan. UDPG digunakan sebagai penderma gula. Penerima gula dipilih berdasarkan kebimbangan yang berbeza. Pertama, yangCtUGT1gen diklon daripadaCistanche tubulosayang komponen kimia utamanya ialah PhG. Untuk mengesahkan sama adaCtUGT1terlibat dalam biosintesis PhGs, aglikon biasa PhGs dalamCistanche tubulosaseperti tyrosol (NP1, Rajah S2) dan salidroside (NP2, Rajah S2) pada mulanya dipilih sebagai substrat. Malangnya, analisis HPLC dan HRESI-MS tidak menemui sebarang produk glikosilasi, yang menunjukkan bahawaCtUGT1mungkin tidak terlibat dalam biosintesis PhGs.

Kedua, berdasarkan penjajaran jujukan dan hasil analisis filogenetik (Rajah 1),CtUGT1secara filogenetik berkaitan dengan lignanoid dan coumarin glycosyltransferases, yang mencadangkan bahawaCtUGT1mungkin adalah fenilpropanoid glycosyltransferase. Untuk mengesahkan ramalan ini, tiga substrat kumarin 1, 2, dan 3 bersama-sama dengan satu substrat lignanoid magnolol NP17 telah diuji sebagai penerima gula, masing-masing. Enzim yang tidak diaktifkan haba (100 ◦C, 10 min) digunakan sebagai kawalan negatif. Analisis tindak balas HPLC-HRESI-MS menggunakan NP17 sebagai substrat tidak menemui sebarang produk. Sebaliknya,CtUGT1menunjukkan kebolehan glukosilasi yang jelas terhadap substrat kumarin yang diuji (1,2,3). Menggunakan substrat 1 sebagai contoh, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, puncak baharu (1a) dengan masa pengekalan menurun (11.46 min) berbanding dengan substrat 1 (19.75 min) telah dihasilkan olehCtUGT1pada kadar hasil sebanyak 37.78 peratus . Spektrum penyerapan UVnya adalah sepadan dengan 1. Spektrum HRESI-MS menunjukkan bahawa puncak 1a menunjukkan tambah [M tambah H] pada m/z 325.1029, dan tambah [M tambah Na] pada m/z 347.0710 (kira. 347.0737 untuk C15H16O8Na ) dengan formula ramalan C15H16O8, iaitu 162 amu lebih besar daripada 1 dan konsisten dengan formula teori produk terglukosilasi (Rajah 2A). Begitu juga, produk terglukosilasi substrat 2 (14.21 min, Rajah 2B) dan 3 (21.92 min, Rajah 2C) juga ditemui pada masa pengekalan 10.85 min dan 13.80 min, dengan kadar penukaran 22.03 peratus dan 68.67 peratus , masing-masing. Jisim molekul produk dipadankan dengan jisim terkira produk terglukosilasi dengan tepat, yang mengesahkan bahawaCtUGT1boleh memangkinkan glikosilasi sebatian kumarin 1–3 (Jadual 1).

Selepas itu, memandangkan kebanyakan enzim yang dilaporkan baru-baru ini mempamerkan pemangkinan rambang in vitro, untuk meneroka lebih lanjut spektrum substratCtUGT1, ujian enzim yang meluas telah dijalankan terhadap pelbagai sebatian kepunyaan pelbagai jenis produk semula jadi, termasuk flavonoid, sebatian fenolik, kumarin, stilbene, antrakuinon, benzofenon, naftalena dan iridoid (Gamb. S1-S2), menggunakan UDPG sebagai penderma gula. Didapati bahawa substrat benzofenon 4,4'-dihydroxy benzophenone (4), substrat isoflavon genistein (5), dan substrat antrakuinon aloe-emodin (6) juga boleh dimangkinkan olehCtUGT1untuk membentuk produk terglukosilasi yang sepadan 4a, 5a, 6a dengan kekutuban yang lebih tinggi (Rajah 3). Analisis HRESI-MS menunjukkan bahawa puncak ion produk adalah 162 amu lebih besar daripada substrat, menunjukkan bahawaCtUGT1boleh memangkinkan glikosilasi sebatian ini untuk membentuk produk monoglukosida yang sepadan. Kadar penukaran 4, 5 dan 6 masing-masing ialah 4.12 peratus , 14.14 peratus dan 23.33 peratus (Jadual 1).

Pemilihan penderma gula bagiCtUGT1turut diterokai. Sebagai tambahan kepada UDPG, enam penderma lain, termasuk UDP-N-acetyl galactosamine, UDP galaktosa, GDP-mannose, GDP-fucose, asid UDP-galakturonik, dan UDP rhamnose, telah diuji menggunakan substrat 1-6 sebagai penerima. Keputusan menunjukkan bahawaCtUGT1UDPG terpilih secara eksklusif sebagai penderma gula. Tiada produk diperhatikan apabila gula diaktifkan lain diuji (data tidak ditunjukkan).

3.4. Sifat biokimia dan parameter kinetik CtUGT1

Sifat biokimia bagiCtUGT1telah disiasat menggunakan 3 sebagai penerima gula dan UDPG sebagai penderma gula seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4. Aktiviti pemangkinanCtUGT1telah diuji dalam julat suhu 4–60 ◦C, aktiviti optimum dikesan pada 37 ◦C (Rajah 4A). Analisis aktiviti enzim antara pH 3.0 dan 9.0 menunjukkan bahawa nilai pH optimum diperhatikan pada pH 8.0 (100 mM penimbal KH2PO4-K2HPO4, Rajah 4C). Hasil produk glukosilasi 3a meningkat secara linear dalam masa 1 jam dan kadar pertumbuhan merata selepas 5 jam (Rajah 4B). Nilai Km ketara bagiCtUGT1untuk 3 ialah 218.7 ± 7.176 μM, dan Vmaks ialah 0.02255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Penyediaan enzimatik dan pengenalan struktur produk glucosylated

Berdasarkan keputusan ujian enzim,CtUGT1cenderung menjadi glucosyltransferase khusus yang boleh memangkinkan glikosilasi pelbagai jenis produk semula jadi. Maklumat HPLC-HR-MS produk telah diringkaskan dalam Jadual 1. Antaranya, substrat kumarin menunjukkan kadar penukaran yang besar. Aktiviti enzim terhadap kumarin dianalisis lebih lanjut. Perlu diingatkan bahawa ketiga-tiga substrat kumarin yang diuji diterima olehCtUGT1mempunyai kumpulan hidroksil pada kedudukan C-7, manakala esculetin (2) mempunyai kumpulan hidroksil tambahan pada kedudukan C-6. Profil HPLC bagi produk terglukosilasi esculetin ditunjukkan dalam Rajah 2. Hanya satu produk diperhatikan, menunjukkan bahawa tindak balas glukosilasi secara regiospesifik berlaku pada kedudukan C-6 atau C-7. Untuk mengesahkan tapak glikosilasi, produk 2a telah dikenal pasti dengan perbandingan dengan glukosida tulen oleh analisis HPLC-UV/HRESI-MS. Apabila menambah cichoriin glukosida tulen (glukosilasi pada 7-kedudukan OH 2) dalam sistem tindak balas, puncak bertindih dengan 2a, profil ko-HPLC mengesahkan lagi bahawa produk glikosilasi 2 dimangkinkan olehCtUGT1ialah cichoriin [33], yang membuktikan bahawa bahagian glukosil dipindahkan secara khusus pada kedudukan C7-OH. Produk 1a juga dikenal pasti melalui perbandingan dengan standard rujukan. Spektrum UV-HPLC bersama-sama analisis HPLC bersama (Rajah 2) mendedahkan bahawa struktur kimia 1a telah dikaitkan sebagai penyaringan [34], iaitu produk terglukosilasi 1 pada kedudukan C7-OH.

Produk 3a telah disediakan daripada tindak balas berskala dan dicirikan secara struktur oleh spektroskopi HRESI-MS, 1H NMR, dan 13C NMR (Rajah S13, S14, dan Nota 4). Dalam isyarat NMR 1H, berbanding dengan substrat 3, isyarat hidroksil fenolik pada kedudukan C{{10}} hilang dan isyarat karbon C-7 beralih δ ​​1.{{25} } ppm ke medan tinggi, manakala isyarat C-6 dan C{15}} beralih ke medan rendah dalam 13C NMR. Penemuan ini mengesahkan bahawa sisa glukopyranosyl telah dilekatkan pada kumpulan hidroksil fenolik pada kedudukan C-7 3 [35]. Selain itu, spektrum 1H NMR menunjukkan isyarat proton anomerik pada δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); komponen gula ditunjukkan sebagai -D-glucopyranose. Keputusan ini ditunjukkanCtUGT1ialah kumarin O-glucosyltransferase yang memangkinkan glikosilasi hidroksil kumarin pada kedudukan 7-OH.

3.6. Pemodelan homologi, dok molekul, dan mutagenesis protein CtUGT1 terarah tapak

Reaksi enzim yang meluas mendedahkannyaCtUGT1boleh memangkinkan glikosilasi tiga kumarin ke dalam produk terglukosilasi yang sepadan, dan kedudukan terglukosilasi secara khusus berlaku pada kedudukan 7- OH. Untuk mengenal pasti sisa utama yang menentukan aktiviti pemangkinanCtUGT1, pemodelan homologi, dok molekul, dan penyiasatan mutagenesis terarah tapak CtUGT1 telah dilakukan. Pemodelan molekul homolog untuk CtUGT1 telah ditubuhkan menggunakan SWISS-MODEL [21-25]. Struktur kristal Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), yang ditentukan pada resolusi 2.1 Å, menunjukkan jumlah skor tertinggi dengan homologi jujukan maksimum dan nilai E yang rendah, dipilih sebagai struktur templat [26]. Penilaian rasional model yang telah ditetapkan telah ditunjukkan dalam plot Ramachandran (Rajah S6), 88.5 peratus daripada sisa dalam model yang telah ditetapkan berada di rantau yang paling digemari. Model homologi CtUGT1 terdiri daripada dua motif lipatan jenis Rossmann yang serupa di terminal N- dan C, masing-masing (Rajah 5A). Domain N-terminal mempunyai tujuh helaian selari yang dikelilingi oleh sepuluh heliks. Domain C-terminal mengandungi enam helaian terkandas yang diapit oleh sembilan heliks (Rajah 5A, S7).

Untuk memperjelaskan lagi poket aktif bagiCtUGT1, dok molekul telah dilakukan. Oleh kerana UGT85H2 hanya mempunyai struktur bentuk apo, satu lagi homolog UGT74F2 dengan kedua-dua UDP dan asid salisilik sebagai dua ligan telah dipilih sebagai templat kawalan. UDPG disediakan sebagai penderma gula. Dua substrat kumarin 1 dan 2 telah disediakan sebagai penerima gula masing-masing. Tapak pengikatan penderma dan penerima glikosil dikira dan dilabuhkan secara berasingan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5. Keputusan menunjukkan bahawa kedua-dua dua poket pengikat terletak di dalam celah dalam dalam kawasan interaksi domain terminal N dan C yang padat padat. -terminal domain daripadaCtUGT1dan rapat secara ruang antara satu sama lain (Rajah 5A). Terminal C bagiCtUGT1terutamanya terlibat dalam hubungan dengan penderma glikosil seperti yang diterangkan dalam UGT tumbuhan lain, dan kebanyakan sisa di sekeliling adalah hidrofilik dan sangat terpelihara. Seperti kotak PSPG biasa, sisa W377 dalam motif ini boleh membentuk ikatan hidrogen dengan kumpulan glukosa UDPG (Rajah 5B); N378 dan S379 dalam motif ini boleh membentuk ikatan hidrogen dengan kumpulan difosfat UDPG (Rajah 5B). Di samping itu, menurut keputusan dok, sisa-sisa W356 dan Q359 mungkin berinteraksi dengan kumpulan uridin melalui interaksi ikatan hidrogen untuk menstabilkan penderma dalam poket aktif. Untuk mengesahkan fungsi sisa utama yang diramalkan ini, sejumlah 16 tapak telah dipilih dan tertakluk kepada mutagenesis pengimbasan alanin. Aktiviti pemangkinan mutan ini telah diuji menggunakan kesemua enam substrat positif yang dinyatakan di atas. Analisis HPLC menunjukkan bahawa, apabila sisa G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397, dan D398 telah bermutasi menjadi alanin, aktiviti glikosilasi protein hilang sepenuhnya terhadap semua substrat yang diuji. Keputusan ini mencadangkan bahawa 16 residu di atas adalah sisa utama yang menentukan pengikatan penderma UDPG dan aktiviti glikosilasiCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 peratus ) seperti V14, V132, E153, T212 dan I209 (Gamb. S8). Diramalkan bahawa sisa hidrofobik yang mengelilingi cincin aromatik ini boleh membentuk interaksi van der Waals dengan substrat dalam poket pengikat.

4. Perbincangan

Glikosilasi adalah salah satu langkah pengubahsuaian yang paling penting dalam banyak laluan biosintesis metabolit sekunder. Glikosilasi boleh meningkatkan bioavailabiliti produk semula jadi dengan meningkatkan keterlarutan airnya dan mengurangkan ketoksikannya. Coumarin dianggap sebagai bentuk paling ringkas dalam kelas besar bahan fenolik yang berlaku secara semula jadi yang dibina daripada cincin -pyrone yang digabungkan dengan cincin benzena. Kedua-dua sebatian berasaskan coumarin semulajadi dan sintetik telah menarik banyak perhatian daripada ahli kimia perubatan dan saintis reka bentuk ubat sebagai akibat daripada sifat farmakologi dan biologi yang pelbagai [36]. Pengubahsuaian glikosilasi selanjutnya bagi kumarin boleh membantu memperkayakan kepelbagaian struktur sebatian ini dan juga meningkatkan keterlarutan dan bioavailabilitinya. Dalam tumbuhan, proses glikosilasi sedemikian dimangkinkan oleh UDP-glycosyltransferase. Walaupun berbilang UGT telah dikenal pasti daripada tumbuhan yang berbeza, sehingga kini, kebanyakan UGT yang dilaporkan terlibat dalam pengubahsuaian glikosilasi flavonoid. Hanya UGT terhad dilaporkan boleh menerima kumarin sebagai substrat. Dalam kajian ini, gen glikosiltransferase baruCtUGT1diklon daripada herba tradisional CinaCistanche tubulosa. Penjajaran jujukan dan keputusan analisis filogenetik menunjukkan bahawaCtUGT1jauh dari segi filogenetik daripada kebanyakan UGT flavonoid yang dilaporkan, dan hampir dengan UGT fenilpropanoid. Ujian enzim yang meluas mendedahkan bahawa CtUGT1 tidak dapat memangkinkan glikosilasi sebatian fenil etanol untuk membentuk PhG, yang merupakan komponen kimia utamaCistanche tubulosa. Sebaliknya, ia boleh mengenali kumarin sebagai substratnya, dan menjalankan tindak balas glikosilasi. Penjelasan struktur produk menunjukkan bahawa tapak glikosilasi dimangkin olehCtUGT1secara khusus berlaku pada kedudukan C7-OH kumarin. Menggunakan CtUGT1, tiga glikosida kumarin termasuk skimming (1a), cichoriin (2a), dan 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) berjaya disintesis secara enzimatik dan dikenal pasti secara struktur. Ketiga-tiga sebatian ini dilaporkan sebagai molekul aktif secara farmaseutikal. Sebagai contoh, 1a telah dianggap mempunyai pelbagai aktiviti farmakologi, termasuk aktiviti renoprotektif, anti-radang, anti-kanser, dan sifat anti amoebik [37]. 2a menunjukkan aktiviti antibakteria yang tinggi terhadap beberapa bakteria Gram-positif seperti Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus [38]. 3a boleh membantu tumbuhan untuk meningkatkan keupayaan tindak balas mereka terhadap bahan kimia dan toksin [39].

Sebagai tambahan kepada kumarin, ujian enzim yang meluas mendapati bahawaCtUGT1juga menunjukkan aktiviti glukosilasi yang boleh diperhatikan terhadap substrat benzofenon 4, substrat isoflavon 5, dan substrat antrakuinon 6, yang menunjukkan bahawa CtUGT1 mempunyai toleransi substrat tertentu. Namun begitu,CtUGT1tidak dapat memangkinkan biosintesis komponen glikosida dalamCistanche tubulosaseperti phenylethanoid glycosides (PhGs), lignanoid glycosides, dan iridoid glycosides. Selain itu, menurut penyiasatan sebelumnya, tiada glikosida kumarin diasingkan daripadaCistanche tubulosa. Jadi, fungsi in vivo bagiCtUGT1masih perlu diterokai lagi. Aktiviti glukosilasi CtUGT1 terhadap substrat kumarin menjadikan enzim ini alat yang berguna untuk pengubahsuaian glikosilasi enzimatik kumarin dan juga menunjukkan bahawa enzim metabolik sekunder tumbuhan boleh melakukan aktiviti pemangkinan yang tidak dapat dinilai yang jauh di luar fungsi asalnya.

Pengisytiharan Kepentingan Bersaing

Penulis mengisytiharkan bahawa tidak ada konflik kepentingan.

Pengakuan

Kerja ini disokong kewangan oleh Yayasan Sains Semula Jadi Beijing (No. Geran 7192112); Program Penajaan Saintis Elit Muda oleh CAST (No. Geran CACM− 2018− QNRC1− 02); Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (No. Geran 81402809); Dana Biasiswa Negeri Majlis Biasiswa China (No. Geran 201906555010) dan Yayasan Sains untuk Sarjana Muda Elit Universiti Perubatan Cina Beijing (No. Geran 2018-JYB-XJQ006).

Lampiran A. Data tambahan

Data tambahan kepada artikel ini boleh didapati dalam talian di https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Daripada: ' Pengklonan molekul dan pencirian biokimia bagi coumarin glycosyltransferase baruCtUGT1daripadaCistanche tubulosa' olehXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Rujukan

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Analisis filogenetik keluarga multigene UDPglycosyltransferase Arabidopsis thaliana, J. Biol. Kimia. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: glikosidase mutan untuk sintesis oligosakarida, J. Am. Kimia. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Biosintesis gula luar biasa dan glikopelbagaian produk semula jadi, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Kemajuan pada glikosilasi in vivo dan in vitro flavonoid, Appl. mikrobiol. Bioteknol. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Pengklonan molekul dan pencirian UDP-glukosa: benzenoid/fenilpropanoid glucosyltransferase meruap dalam bunga petunia, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases daripada tumbuhan, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Meneroka kepentingan fungsi enzim sterol glycosyltransferase, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Glukosyltransferase alkaloid steroid dalam vivo utama daripada kentang, Fitokimia. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Aktiviti antioksidan limonoid sitrus, flavonoid dan kumarin, J. Agric. Kimia Makanan. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Aktiviti antiviral angelicin terhadap virus gammaherpes, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, derivatif berasaskan Coumarin dengan aktiviti anti-HIV yang kuat, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Aktiviti antioksidan dan potensi hepatoprotektif Cedrelopsis grevei pada tekanan oksidatif yang disebabkan oleh cypermethrin dan kerosakan hati pada tikus jantan, BMC Complement. Altern. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: nukleus berpotensi untuk molekul anti-radang, Med. Kimia. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, derivatif Coumarin sebagai agen antikanser untuk terapi kanser paru-paru: ulasan, Agen Anti Kanser Med. Kimia. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: perancah semula jadi, istimewa dan serba boleh untuk sebatian bioaktif, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/molekul23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, pengklonan dan pencirian glucosyltransferase yang bertindak balas pada 7-kumpulan hidroksil flavonol dan 3-kumpulan hidroksil kumarin daripada sel tembakau, Arch. Biokim. Biophys. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosintesis glikosida kumarin oleh akar berbulu transgenik Polygonum multiflorum, Biosci. Bioteknol. Biokim. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Pengklonan molekul dan pencirian coumarin glucosyltransferase dalam akar berbulu Pharbitis nil (Ipomoea nil), Kultus Tisu Tumbuhan. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Pencirian molekul dan struktur Cglycosyltransferase rambang dari Trollius Chinensis, Angew. Kimia. Int. Ed. En. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: analisis genetik evolusi molekul versi 7.0 untuk set data yang lebih besar, Mol. biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: pemodelan homologi struktur dan kompleks protein, Res Asid Nukleik. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Pemodelan struktur protein perbandingan automatik dengan SWISS-MODEL dan pemapar Swiss-Pdb: perspektif sejarah, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, Repositori SWISS-MODEL-ciri dan fungsi baharu, Nukleik Asid Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisKekangan jarak bersama yang digunakan pada anggaran kualiti model, Bioinformatik. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Memodelkan struktur kuaternari protein homo- dan hetero-oligomer di luar interaksi binari oleh homologi, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, struktur Kristal Medicago truncatula UGT85H2-memahami asas struktur bagi flavonoid (iso) pelbagai fungsi glycosyltransferase, J. Mol. biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Penilaian model protein dengan profil tiga dimensi, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: program untuk menyemak kualiti stereokimia struktur protein, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: meningkatkan kelajuan dan ketepatan dok dengan fungsi pemarkahan baharu, pengoptimuman yang cekap dan multithreading, J. Comput. Kimia. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Perbezaan dalam konjugasi glukosa asid salisilik oleh UGT74F1 dan UGT74F2 daripada Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases dalam sintesis produk semula jadi tumbuhan: pencirian keluarga supergen, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Pengubahan kekhususan penderma gula bagi glikosiltransferase tumbuhan oleh mutasi titik tunggal, Arch. Biokim. Biophys. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glukosilasi sebatian fenolik oleh Pharbitis nil akar berbulu: I. Glukosilasi coumarin dan derivatif flavon, Biosci. Bioteknol. Biokim. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hidrolisis glukosida semula jadi toksik yang dimangkin oleh cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. J. Org. Kimia. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformasi derivatif hydroxycoumarin oleh sel penggantungan kultur Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Kemajuan terkini agen antikanser berasaskan coumarin: kajian terkini, Bioorg. Kimia. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Kesan terbitan kumarin, 4-methylumbelliferone, pada percambahan benih dan penubuhan anak benih di Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Lapan sesquiterpenoid jenis eudesmane dan eremophilane baharu daripada Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Penentuan dan kajian farmakokinetik skimming oleh UHPLC-MS/MS dalam plasma tikus, J. Pharm . Berbiomed. dubur. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.