MiR-199-3p Meningkatkan Penjanaan Semula Otot Dan Memperbaiki Otot Umur Dan Distrofi Otot

Sila hubungi oscar.xiao@wecistanche.com untuk mendapatkan maklumat lanjut

Eksperimen parabiosis mencadangkan bahawa faktor molekul yang berkaitan dengan peremajaan dan penuaan beredar dalam darah. Di sini, kami menunjukkan bahawa miR-199-3p, yang beredar dalam darah sebagai miRNA bebas sel, berkurangan dengan ketara dalam darah tikus tua berbanding tikus muda; dan miR-199-3p mempunyai keupayaan untuk meningkatkan pembezaan miogenik dan penjanaan semula otot. Pentadbiran miR-199 mimik, yang membekalkan miR-199-3p, kepada tikus tua mengakibatkan hipertrofi gentian otot dan kehilangan kekuatan otot yang tertangguh. Pentadbiran sistemik miR-199 meniru kepada tikus mdx, model haiwan terkenal Duchenne muscular dystrophy (DMD), telah meningkatkan kekuatan otot tikus dengan ketara. Jika digabungkan, miR-199-3}p tanpa sel dalam darah mungkin mempunyai kesan anti-penuaan seperti kesan ahypertropik dalam gentian otot yang sudah tua dan boleh berpotensi sebagai terapeutik RNA baru untuk DMD serta penyakit berkaitan usia. Penemuan ini memberi kita pandangan baharu tentang miRNA yang beredar dalam darah sebagai molekul berkaitan usia.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Fungsi penting, seperti daya otot, operasi sistem saraf, fungsi pernafasan, pertahanan terhadap jangkitan, dan ketahanan terhadap penyakit, menurun dengan penuaan. Penyakit dan disfungsi yang berkaitan dengan penurunan fungsi tersebut semakin meningkat dan menjadi masalah utama dalam masyarakat yang semakin tua. Pelbagai perubahan, seperti perubahan metabolik dan peraturan gen, berlaku dalam badan dengan penuaanl-3; dan mengkaji perubahan tersebut boleh membantu memahami penuaan dan menyediakan strategi untuk menangani masalah yang dihadapi oleh masyarakat yang semakin tua. Biomolekul (termasuk gen) yang berkaitan dengan penuaan telah dikenal pasti dan mungkin berguna dalam penyelidikan penuaan; cth, ungkapan -galactosidase dan plolnk4a dikaitkan dengan penuaan selular4-6, dan model tetikus yang tidak mempunyai gen klotho dikenali sebagai model penuaan dengan beberapa fenotip, menyerupai penuaan pramatang manusia.

Parabiosis ialah penyatuan antara dua individu yang berkongsi sistem vaskular yang sama, dan boleh dijana secara eksperimen melalui pembedahan8. Eksperimen dengan parabiosis, di mana tikus muda dan tua digabungkan untuk berkongsi sistem vaskular yang sama, menunjukkan bahawa proses penuaan dalam haiwan muda telah dipercepatkan, manakala haiwan tua telah diremajakan9-12. Penemuan ini amat mencadangkan bahawa faktor-faktor tertentu yang berkaitan dengan peremajaan dan penuaan wujud, dan beredar bersama darah dalam sistem vaskular; walau bagaimanapun, faktor peredaran tersebut masih belum difahami sepenuhnya.

Cistanche boleh anti-penuaan

MicroRNAs (miRNAs) ialah 21-23-RNA bukan pengekodan kecil yang panjang nukleotida, yang diproses daripada transkrip yang lebih panjang (pri-mary miRNA) melalui pencernaan, dengan kompleks mikropemproses dalam nukleus dan Dicer dalam sitoplasma, dan digabungkan ke dalam kompleks pembungkaman yang disebabkan oleh RNA(RISC)14,15.MiRNA dalam RISC berfungsi sebagai perantara dalam pembungkaman gen, di mana terjemahan RNA messenger (mRNA) yang mempunyai pelengkap separa kepada miRNA dihalang atau mRNA yang membawa urutan hampir pelengkap kepada miRNA adalah dihadaml4,15.Ekstrak Cistanche Anti RadiasiOleh itu, miRNA memainkan peranan penting dalam peraturan gen melalui menekan ekspresi gen sasaran mereka. Beribu-ribu gen miRNA telah ditemui dalam haiwan dan tumbuhan [lihat pangkalan data mikroRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Profil ekspresi miRNA telah diperiksa dan ekspresi khusus peringkat tisu dan perkembangan serta ekspresi miRNA yang berkaitan dengan penyakit telah dikesanl6-21. Peraturan gen yang melibatkan miRNA berkait rapat dengan pelbagai fungsi penting dan fenomena kehidupan, termasuk penyakit14,16,21-24

MiRNA hadir di luar, serta di dalam sel25. Sebagai contoh, miRNA hadir dalam darah sebagai nukleotida bebas sel dan beredar dalam sistem vaskular2627. MiRNA bebas sel tersebut (cf-miRNAs) digabungkan ke dalam vesikel kecil yang dipanggil vesikel ekstraselular atau dikaitkan dengan protein, dengan itu mendapat perlindungan daripada nuklease ekstrasel25,28. Kehadiran beberapa cf-miRNA mungkin penting; contohnya, perkaitan penting antara cf-miRNA dan penyakit tertentu telah dikesan26,27,29-31. Cf-miRNA mungkin mencerminkan perubahan dalam keadaan fizikal; oleh itu, miRNA sedemikian mungkin menjadi biomarker yang berpotensi untuk memantau sistem penyelenggaraan hayat, serta penyakit.

Kajian ini dijalankan untuk mengkaji persatuan antara cf-miRNA dan penuaan, dan cf-miRNA dalam darah tikus muda dan tua telah disiasat. Hasilnya mendedahkan perubahan dalam cf-miRNA antara darah tikus muda dan tua. Antara miRNA sedemikian, miR-199-3p telah menurun dengan ketara dalam darah tua berbanding dengan darah muda. Menariknya, miR-19-3p mempunyai keupayaan untuk mempertingkatkan pembezaan dan penjanaan semula otot, dan pemberiannya kepada tikus tua menghasilkan pengembangan gentian otot. Apabila miR-199-3p diperkenalkan ke dalam tikus mdx, model haiwan Duchenne muscular dystrophy (DMD) kekuatan otot tikus telah meningkat dengan ketara. Kajian ini memberikan pandangan baharu tentang cf-miRNA peredaran darah dari segi penuaan, keupayaan terpendam dan aplikasi perubatan.

Keputusan

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-bulan) C57BL/6J tikus, menggunakan microarray DNA untuk mengenal pasti perbezaan berkaitan umur. Profil cf-miRNA mempamerkan perbezaan ketara antara tikus muda dan tua, iaitu, cf-miRNA yang berat sebelah terhadap darah tikus muda dan tua telah dikesan (Jadual 1). Daripada miRNA tersebut, miRNA miogenik (cth, miR-1 dan miR-133)1833 terdapat dalam kumpulan miRNA yang banyak terdapat dalam darah muda; dalam erti kata lain, miRNA miogenik adalah kurang ketara dalam darah tua (Jadual 1).herba cistanchePerbezaan dalam miRNA antara darah muda dan tua telah disahkan oleh tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (qRT-PCR; Rajah la), dan selanjutnya dihasilkan semula menggunakan sumber RNA yang diekstrak daripada vesikel kecil, yang dipanggil exosomes, diasingkan daripada plasma ( Tambahan Rajah.1).

Eksperimen kultur sel, sebaliknya, mendedahkan bahawa serum tikus muda mempunyai keupayaan untuk mendorong pembezaan miogenik, dan keupayaannya lebih kuat daripada tikus tua (Rajah 1b). Faktor pertumbuhan seperti insulin I (IGF-I), yang merupakan faktor utama yang mampu mendorong pembezaan miogenik dalam darah34,35, telah diperiksa; walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara diperhatikan antara darah muda dan tua (Rajah lc). Oleh itu, faktor selain IGF-I dalam darah muda mungkin terlibat dalam pembezaan miogenik.

miR-199-3p mampu mendorong pembezaan miogenik dengan kuat. Kami menyiasat kesan miRNA yang banyak dalam darah muda pada pembezaan miogenik. Peniruan miRNA sintetik telah diperkenalkan ke dalam sel C2C12, garisan sel myoblast tikus, dan ekspresi penanda pembezaan myogenik, gen myogenin (Myog) dan myosin rantai berat 1 (Myh1), telah diperiksa. Hasilnya tidak dijangka dan menarik minat kami:miR-199-3p, yang diramalkan sebagai miRNA negatif disebabkan oleh sedikit maklumat tentang pembezaan miogenik, secara nyata mendorong ekspresi Myog dan Myh1 (Rajah 2a, b). Di samping itu, aruhan miR-199-3p adalah lebih kuat daripada miRNA miogenik konvensional: ekspresi rantai berat myosin dengan kehadiran miR-199-3p adalah sangat luar biasa (Rajah 2b, c).

Untuk menjelaskan hubungan antara miR-199-3p dan pembezaan miogenik, kami menyiasat miR-199-3p selular dan ekstraselular (exoso-mal) semasa pembezaan miogenik, dan juga kesan perencat miR-199-3p pada pembezaan. Ungkapan endogen (selular)miR-199-3p telah dikawal selia selepas permulaan pembezaan. Exosomal miR-19-3p dinaikkan sekali dan menurun selepas itu (Tambahan Rajah 2a). Rawatan perencat menindas ekspresi penanda pembezaan miogenik, Myog, Myh1, dan creatine kinase (Ckm) (Tambahan Rajah 2b).pertumbuhan zakar cistancheOleh itu, penemuan mencadangkan bahawa miR-199-3p mengambil bahagian dalam pembezaan miogenik.

Mereka bentuk miR-199 meniru. Kami mereka bentuk miR-199 mimik supaya mimik boleh menghasilkan miR-199-3p dengan cekap sebagai pengantara fungsian (helai panduan) dalam pembungkaman gen. Mimik miRNA yang direka telah disaring dan miR199#4 dipilih sebagai mimik miR-199 yang kompeten (Tambahan Rajah 3). Selepas itu, miR199#4 digunakan dalam kedua-dua eksperimen in vivo dan in vitro.

Gen sasaran miR-199-3p dalam pembezaan miogenik. Untuk mengenal pasti gen sasaran untuk miR-199-3p di bawah pembezaan miogenik, kami mencari gen calon daripada pangkalan data TargetScan dan memfokuskan pada gen Lin28b dan Suz12, yang kedua-duanya dinyatakan dalam myoblast C2C12. Lin28b dan Suz12 mempunyai jujukan pengikatan miR-199-3p yang diduga dalam kawasan 3'yang tidak diterjemahkan (UTR; Rajah 3a). Kami menunjukkan bahawa jujukan putatif adalah tapak pengikatan tulen untuk miR-19-3p, menggunakan gen wartawan Luciferase yang membawa jujukan pengikatan dan jujukan tidak sepadan yang sepadan (Rajah 3a, b). Gen Luciferase yang membawa jujukan pengikatan putatif telah ditindas dengan ketara oleh miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) dan pSuz12-(973)], manakala jujukan tidak sepadan, yang mempunyai mutasi penggantian asas dalam benih [pLin28b-(81)mut, rantau, membatalkan kesan penindasannya [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, dan Apabila miR-199 mimic diperkenalkan kepada sel C2Cl2, ungkapan Lin28b dan Suz12 telah ditindas secara konsisten (Rajah 3c). Untuk menilai sama ada penindasan Lin28b dan/ atau Suz12 secara langsung menyumbang kepada pembezaan miogenik, perencatan khusus Lin28b dan Suz12 telah dilakukan dengan pembungkaman gen, menggunakan inter-ference RNA (RNAi; Rajah 3d, e). Seperti yang dijangkakan, ungkapan penanda pembezaan myo-genik, seperti Ckm, Myh1, dan Myog telah dikawal selia di bawah pembungkaman gen Lin28b dan Suz12 (Rajah 3f, g).

Memandangkan Lin28b ialah protein pengikat RNA yang terlibat dalam pemprosesan miRNA3637, kami menyiasat kesan miR-19 mimik melalui Lin28b pada pemprosesan miRNA miogenik. Tahap miR-1, miRNA miogenik utama, telah diperiksa kerana pemprosesan prekursornya dikawal oleh Lin28b37. MiR-1 matang telah meningkat dengan ketara oleh miR-199 rawatan mimik (Rajah 3h), menunjukkan bahawa miR-199-3p boleh mengawal selia ekspresi fungsi miR-1 melalui penindasan daripada sasarannya Lin28b. Secara keseluruhan, penemuan mencadangkan bahawa miR-199-3p terlibat dalam pembezaan miogenik melalui penindasan gen sasarannya, Lin28b dan Suz12.

Peningkatan penjanaan semula otot oleh miR199#4 dalam tikus kecederaan otot.khasiat cistanche salsaKami meneliti kesan miR-199 mimik (miR199#4) dalam vivo menggunakan model kecederaan otot (Rajah 4a, b). Tikus C57BL/6J berusia lapan minggu telah disuntik dengan BaClz ke tibialis anterior(TA) untuk menyebabkan kecederaan otot, dan miR19#4 diberikan ke tapak yang rosak 24 jam kemudian. Dua hari selepas pentadbiran miR199#4, ekspresi gen penanda myogenik telah diperiksa. Ekspresi myog telah meningkat dengan ketara dan pembezaan myogenic 1(Myod1) dan faktor myogenic 5 (Myf5) juga dikawal oleh pentadbiran miR199#4 (Rajah 4c). Data adalah konsisten dengan keputusan in vitro yang diterangkan di atas (Rajah 2).

Analisis imunohistokimia bagi otot penjanaan semula dilakukan 9 hari selepas pentadbiran miR199#4. Kawasan keratan rentas gentian otot yang menjana semula (myofibers), yang dicirikan oleh nukleus pusat, telah diperiksa (Rajah 4b). Purata kawasan keratan rentas myofibers penjanaan semula yang dirawat dengan miR199#4 adalah lebih besar daripada myofibers kawalan yang dirawat dengan dupleks RNA kawalan tidak menyenyapkan (nsCont; Rajah 4d), dengan perbezaan menghampiri kepentingan statistik. Sebagai tambahan kepada purata luas keratan rentas, histogram terbahagi saiz bagi luas keratan rentas menunjukkan peningkatan dalam myofibers yang diperbesarkan dengan kehadiran miR199#4(Rajah.4e).

Kesan hipertropik miR199#4 pada gentian otot yang sudah tua. Kami meneliti kesan miR199#4 pada tikus berumur(~24bulan). Tikus tua mempamerkan penurunan ketara dalam otot miR-199-3p (Rajah 5a), seperti dalam cf-miR-19-3}p yang beredar dalam darah, berbanding tikus muda. Kami memberikan miR199#4 kepada otot TA tikus tua, dan 2 hari kemudian otot TA diperiksa dengan analisis imunohistokimia (Rajah 5b). Purata luas keratan rentas myofibers yang dirawat dengan miR199#4 adalah jauh lebih besar daripada myofibers kawalan yang dirawat dengan nsCont (Rajah 5c). Selaras dengan ini, analisis histogram terbahagi saiz menunjukkan peningkatan ketara dalam myofibers yang diperbesarkan dengan kehadiran miR199#4(Gamb.5d).

Memandangkan cf-miR-199-3p yang beredar dalam darah berkurangan pada tikus tua, kami memperkenalkan miR199#4 ke dalam darah beredar tikus tua melalui sia-sia ekor. Selepas pentadbiran intravena miR19 # 4, kawasan keratan rentas myofibers telah diperiksa dan dianalisis, seperti yang diterangkan di atas. Keputusan, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5e, adalah konsisten dengan keputusan pentadbiran tempatan miR199#4 kepada otot yang sudah tua (Rajah 5c, d).

Perlu diingatkan bahawa terdapat perbezaan dalam gentian otot yang diperbesarkan antara model kecederaan otot dan tikus tua. Nukleus pusat dilihat dalam gentian otot yang menjana semula (Rajah 4b), tetapi myofibers tersebut hampir tidak dikesan dalam tikus tua yang dirawat dengan miR199#4 (Rajah 5b). Ini menunjukkan bahawa gentian otot yang sedia ada mungkin membesar pada tikus tua selepas rawatan miR199#4. Kami membuat hipotesis bahawa mekanisme lain yang berbeza daripada penjanaan semula otot mungkin terlibat dalam pembesaran myofiber pada tikus tua, dan mencadangkan penglibatan laluan atrofi otot.cistanche tubulosa dos redditGen Atroginl dan MuRFI berkait rapat dengan atrofi otot38, dan tahap ekspresinya meningkat dengan ketara pada otot yang berumur berbanding dengan otot muda (Rajah 6a). Kami memeriksa tahap Atroginl dan MuRFI dalam otot tikus tua selepas pentadbiran sistemik miR199 # 4. Atroginl dan MuRFI telah dikurangkan dengan ketara dalam pelbagai otot oleh pentadbiran miR19#4 (Rajah 6b), menunjukkan bahawa penindasan laluan atrofi otot oleh miR199#4 boleh menyebabkan pengembangan myofiber pada tikus tua.

MiR199#4 melambatkan kehilangan kekuatan otot pada tikus tua. Kesan miR199#4 pada fungsi otot pada tikus berumur adalah menarik. Ujian kekuatan cengkaman dilakukan pada tikus tua sebelum dan selepas pentadbiran sistemik miR199#4. Eksperimen dilakukan secara dua buta; Suntikan RNA dan ujian cengkaman 100 peratus telah dijalankan oleh penguji yang berbeza tanpa berkongsi maklumat i. Tikus C57BL/6 (80-minggu) jantan telah diuji cengkaman, kemudian 1 minggu kemudian, tikus itu disuntik secara intravena dengan miR199#4 dan nsCont, dan diuji cengkaman sekali lagi. Perubahan dalam kekuatan otot selepas suntikan miR199#4 ialah MiR199#4 meningkatkan kekuatan otot tikus mdx. Memandangkan miR199#4 mempunyai kesan positif pada otot, kami menjalankan eksperimen untuk menilai kesan pentadbiran miR199#4 dalam tikus mdx, model haiwan DMD32 yang terkenal. Tikus mdx berusia lapan minggu telah disuntik secara intravena dengan miR199#4(1.6 mg/kg) dua kali (selang 1 minggu), dan ujian cengkaman dijalankan 1 minggu selepas pentadbiran terakhir. Eksperimen telah dilakukan secara dua buta seperti ditunjukkan dalam Rajah.7. Keputusan (Rajah 8a) menunjukkan peningkatan ketara dalam kekuatan otot dalam tikus mdx yang dirawat dengan miR199#4 berbanding tikus mdx yang dirawat dengan nsCont. Di samping itu, penurunan ketara dalam aktiviti creatine kinase (CK) dan miR bebas sel-1 diperhatikan dalam darah tikus mdx yang dirawat dengan miR199#4(Rajah 8b, c), yang merupakan tanda-tanda penyakit yang mungkin. penambahbaikan.

Sebagai reagen penghantaran ubat, atelocollagen adalah likat dan sukar dikendalikan, dan tikus yang dirawat dengan atelocollagen kelihatan mengalami kesan negatif akibat kenderaan. Oleh itu, kami mencari alternatif kepada atelocollagen untuk memperbaiki sistem penghantaran ubat (DDS) kami dan mendapati liposom kationik DC-CHOL/DOPE sebagai reagen DDS baharu yang sama atau lebih tinggi daripada atelocollagen (Tambahan Rajah 4). Pengagihan ubat miR199#4 dengan liposom kationik menunjukkan bahawa miR19#4 yang diberikan telah dihantar ke otot dan secara konsisten diambil dalam jumlah yang banyak dalam hati (Tambahan Rajah 5). MiR199#4 ekstraselular yang dihantar ke otot boleh berfungsi sebagai perantara dalam pembungkaman gen dan menyumbang kepada peraturan gen yang terlibat dalam peningkatan kekuatan otot.

Kami cuba mengenal pasti biomolekul yang berkaitan dengan peningkatan berikutan pentadbiran miR199#4. Pelbagai poli-peptida yang berkaitan dengan DMD telah diperiksa oleh western blotting; walau bagaimanapun, isyarat berbeza yang berkaitan dengan peningkatan tidak dikesan dalam kajian ini (Tambahan Rajah 6). Kami akan membincangkan perkara ini dengan lebih lanjut dalam bahagian berikut.

Perbincangan

Biomolekul berubah secara kualitatif dan kuantitatif dengan penuaan--3. Menangkap perubahan tersebut dan mengkajinya adalah penting untuk memahami penuaan, dan mungkin mendedahkan strategi untuk menangani masalah dalam masyarakat yang semakin tua. Kajian parabiosis di mana haiwan muda dan tua digabungkan untuk berkongsi sistem vaskular yang sama telah memberikan cerapan penting tentang penuaan dan peremajaan9-l2. Penemuan menunjukkan bahawa terdapat faktor peremajaan dan penuaan dalam darah yang beredar muda dan tua, masing-masing. Kajian terdahulu melaporkan pelbagai molekul sebagai calon yang berkaitan dengan peremajaan dan penuaan, tetapi hasilnya adalah kontroversi.

Eksperimen kultur sel in vitro kami menggunakan sera muda dan tua adalah serupa dengan eksperimen parabiosis (Rajah lb), dan kami mendapati miR-199-3p, yang berubah mengikut umur, dalam darah yang beredar; miRNA dikenal pasti berkurangan dengan ketara dalam darah tua (Jadual 1 dan Rajah la). Selain itu, ekspresi otot (selular)miR-199-3p berkurangan dengan ketara dalam otot tua berbanding otot muda (Gamb. 5a); oleh itu, cf-miR-199-3p dalam darah mungkin berkait dengan otot miR-199-3p. Penurunan ekspresi miR-199-3p dengan penuaan juga diperhatikan dalam sel stem mesenchymal yang diperoleh daripada sumsum tulang rhesus macaque39. Oleh itu, ekspresi miR{10}}p selular mungkin berada di bawah kawalan berkaitan umur. Berbeza dengan miR-19-3p, ekspresi miRNA miogenik selular, seperti miR-1 dan miR-133, kekal tidak berubah pada otot muda dan tua (Rajah 5a), tetapi tahap miRNA ekstraselular mereka dalam darah berkurangan dengan ketara pada tikus tua (Rajah la). Perbezaan antara miR-199-3p dan miRNA miogenik(miR-1 dan-133) mungkin mencerminkan perbezaan dalam pemprosesan cf-miRNA dan/atau dalam kawalan berkaitan umur cf-miRNA di antara mereka . Untuk menjelaskan perbezaan ini, kajian lanjut perlu dijalankan pada masa hadapan.

Kajian terdahulu mencadangkan bahawa miR-199-3p mengambil bahagian dalam pelbagai fungsi selular dan fenomena penting melalui penindasan gen sasarannya; contohnya, miRNA mungkin menggalakkan percambahan dan penghijrahan sel hujung endothelial dan memodulasi permulaan akil baligh, masing-masing, melalui regulasi rendah semaphorin-3A gen40 yang disasarkan dan melalui penindasan gen sasaran (Cdc42, Map3k2, Map3k4, dan Taok1) terlibat dalam laluan p38MAPK41. Kajian ini mendapati bahawa miR{11}}p terlibat dalam pembezaan miogenik melalui penindasan gen sasarannya, Lin28b dan Suz12 (Gamb. 3). Lin28b ialah protein pengikat RNA dan menghalang kematangan miRNA, termasuk miR-1, yang merupakan miRNA khusus otot dan menggalakkan myogenesis37. Penindasan Lin28b oleh miR-19-3p menyebabkan peningkatan dalam miR matang-1 (Rajah 3), yang mungkin membenarkan pembezaan miogenik diteruskan.

Suzl2 ialah subunit teras kompleks penindasan policomb 2 (PRC2), yang mengambil bahagian dalam menindas kromatin42. Regulasi gen PRC2 terlibat dalam penyelenggaraan sel stem, perkembangan embrio, percambahan dan pembezaan sel, termasuk pembezaan miogenik42.PRC2 hadir pada lokus khusus otot senyap, seperti Myog dan kinase kreatin otot (MCK) dalam myoblast yang tidak dibezakan, tetapi dipisahkan daripada lokus sedemikian dalam myotubes yang dibezakan43. Pendiaman gen terhadap Suz12 oleh RNAi menyebabkan peningkatan ekspresi gen miogenik (Rajah 3). Penindasan penambah protein zeste homolog 2 (Ezh2), satu lagi subunit teras PRC2, juga menyebabkan pembezaan miogenik44. Penemuan ini menunjukkan bahawa perencatan pembentukan PRC2 akibat penindasan subunit terasnya boleh mencetuskan penciptaan keadaan genomik untuk pembezaan otot. Oleh itu, penindasan Suz12 oleh miR-199-3p boleh menyebabkan pembezaan miogenik. Secara keseluruhan, miR-19-3p mungkin memainkan peranan penting dalam pembezaan miogenik melalui perencatan dua laluan bebas yang melibatkan Lin28b dan Suzl2, yang masing-masing terlibat dalam pengekalan keadaan myoblast yang tidak dibezakan.

Kesan miR-199-3p pada pembezaan miogenik juga telah ditunjukkan dalam vivo (Rajah 4). Kerosakan otot mencetuskan pro-liferasi dan pembezaan sel akibat penjanaan semula otot. Pengenalan miR199#4, yang membekalkan miR-199-3p, ke tapak yang rosak meningkatkan penjanaan semula otot dan myofiber penjanaan semula yang diperluas (Gamb. 4). Ekspresi gen miogenik secara konsisten dikawal selia di bawah rawatan miR199#4 (Rajah 4). Dari sudut pandangan praktikal, miR199#4 mungkin berkesan dan berguna untuk rawatan pembedahan.

Apabila miR199#4 diberikan kepada tikus tua yang tidak mempunyai miR-199-3p peredaran darah, tikus mempamerkan myofibers yang mengembang dengan ketara (Rajah 5) dan melambatkan kehilangan kekuatan otot dengan penuaan (Rajah 7). Myofibers yang berkembang dalam tikus tua berbeza daripada myofibers yang menjana semula, yang diperbesarkan dengan kehadiran miR199#4; yang pertama berasal daripada myofibers sedia ada, dan yang kedua adalah daripada neo-myofibers (myofibers baru lahir). Oleh itu, terdapat mekanisme bebas yang berbeza dalam pembesaran gentian otot. Kajian kami mencadangkan bahawa (i) dalam kes terdahulu, perencatan atrofi otot akibat penindasan Atroginl dan MuRFI oleh rawatan miR199 # 4 membawa pembesaran myofibers yang berumur, dan (ii) dalam kes kedua, penindasan gen sasaran, Lin28b dan Suz12, menyebabkan pembesaran myofibers yang menjana semula. Secara keseluruhannya, gen berbeza (berbilang) yang dikawal oleh miR-19-3p mungkin terlibat dalam hipertrofi otot dalam situasi yang berbeza. Penemuan juga mencadangkan bahawa miR-199-3p mungkin mempunyai sekurang-kurangnya kesan antipenuaan pada otot dan miR199#4 yang membekalkan miR-199-3p mungkin berpotensi sebagai ubat RNA baharu untuk penyakit otot berkaitan usia, seperti sarcopenia.

Berdasarkan keberkesanan tinggi miR199#4 pada otot, kami memberikan miR199#4 kepada tikus mdx, model DMD yang terkenal, dan memperoleh hasil yang luar biasa: pentadbiran sistemik miR199#4 meningkatkan kekuatan otot pada tikus sebanyak ~20 peratus ( Rajah 8a). Untuk memahami mekanisme pemulihan kekuatan otot, kami cuba mengenal pasti biomolekul yang telah diperbaiki (atau dipengaruhi) oleh miR-199-3p. Walau bagaimanapun, dengan pengecualian penambahbaikan CK darah dan cf-miR-1 (Rajah 8b, c), kami tidak dapat mengesan peningkatan tersebut pada tahap molekul. Kesukaran dalam pengesanan ini mungkin disebabkan oleh populasi sel yang kompleks, yang terdiri daripada gabungan sel-sel otot yang menjana semula dan mengganggu dalam tikus mdx. Walaupun miR199#4 menghasilkan peningkatan, bunyi latar belakang yang tinggi yang disebabkan oleh populasi sel yang kompleks akan menyembunyikan bukti peningkatan. Untuk menyelesaikan masalah ini, kajian yang lebih meluas menggunakan populasi sel otot homogen yang diperoleh daripada tikus mdx atau memfokuskan pada pelbagai tisu, termasuk otot perlu dijalankan.

Walaupun mekanisme molekul pemulihan kekuatan otot oleh miR199#4 masih tidak diketahui, dos miR19#4 untuk kekuatan otot yang lebih baik patut diberi perhatian. Dua kali pentadbiran ~1.6 mg/kg miR199#4 meningkatkan kekuatan otot dalam tikus mdx. Dos berkesan nampaknya lebih rendah daripada oligonukleotida antisense untuk ekson melangkau terhadap gen distrofin mutan dalam vivo45-47. Sebab mengapa miR199#4 mampu meningkatkan kekuatan otot pada dos yang lebih rendah mungkin disebabkan oleh mekanisme tindakannya yang berbeza berbanding dengan oligonukleotida antisense. Mekanisme tindakan miR19#4 ialah pembungkaman gen pemangkin. Sebaliknya, mekanisme oli-gonukleotida antisense adalah berdasarkan hibridisasi fizikal. Oleh itu, perbezaan dalam dos yang sesuai untuk menunjukkan keberkesanan ubat mungkin disebabkan oleh mekanisme tindakan yang berbeza.

Mekanisme di mana organ, tisu atau sel melepaskan miRNA ke dalam darah yang beredar masih belum difahami sepenuhnya, dan peraturan berkaitan usia mengenai pelepasan miRNA tersebut juga tidak jelas. Kajian ini menunjukkan bahawa cf-miR-NA miogenik, termasuk cf-miR-199-3p beredar bersama darah dalam sistem vaskular dan berkurangan dengan penuaan. Cf-miRNA sedemikian mungkin terdapat dalam eksosom, iaitu, ia adalah miRNA eksosom.

MiRNA miogenik mengambil bahagian dalam pembezaan miogenik, penjanaan semula otot, dan penyelenggaraan homeostasis otot33. Kajian terdahulu melaporkan bahawa miRNA miogenik, seperti miR-1 dan miR-133, diperhatikan meningkat dalam darah sebagai tindak balas kepada senaman fizikal4849. Berdasarkan laporan ini, tikus muda yang aktif mungkin mengeluarkan lebih banyak miRNA miogenik ke dalam darah berbanding tikus yang sudah tua bergerak perlahan, dan miRNA ekstraselular sedemikian, termasuk cf-miR-199-3p boleh menyumbang kepada mengekalkan homeostasis otot dalam tikus muda melalui tindakan autokrin. . Walau bagaimanapun, tahap miRNA ekstraselular (eksosomal) tidak selalu dikaitkan dengan tahap miRNA selular, dan perbezaan telah diperhatikan dalam miRNA miogenik dan miR-199-3p antara tikus muda dan tua (Rajah la dan 5a) dan semasa pembezaan miogenik (Tambahan Rajah 2a). Oleh itu, sebagai satu lagi kemungkinan, boleh difikirkan bahawa peraturan berkaitan umur dan berkaitan pembezaan pembentukan eksosom boleh menjejaskan pengeluaran cf-miRNA; khususnya, mungkin terdapat perbezaan dalam pembentukan eksosom antara tikus muda dan tua. Dalam konteks hipotesis ini, kajian lanjut diperlukan untuk menjelaskan pembebasan miRNA miogenik berkaitan usia ke dalam darah.

Selain daripada mekanisme pelepasan, apabila cf-miRNA myogenic muda yang mengandungi cf-miR-199-3p mengalir ke dalam sistem peredaran darah tua daripada sistem vaskular muda oleh parabiosis, cf-miRNA boleh mencetuskan pengaktifan otot dan perencatan otot. atrofi pada bahagian tua; konsep ini disokong oleh bukti daripada tikus tua yang disuntik secara intravena dengan miR19#4 dalam kajian ini (Rajah 5-7). Cf-miRNA dalam darah mungkin berkaitan dengan fungsi homeostatik yang berkaitan dengan usia dan boleh mewakili homeostasis yang diubah. Apabila cf-miRNA tersebut hadir secara ektopik, sebagai contoh, apabila cf-miRNA dalam darah muda dipindahkan ke sistem peredaran darah tua, sesetengah cf-miRNA mungkin menunjukkan kesan meremajakan pada bahagian tua, iaitu, ia mungkin menghasilkan kesan antipenuaan. Sebaliknya, cf-miRNA dalam darah tua mungkin mewakili homeostasis yang diubah dengan penuaan. Apabila cf-miRNA tersebut dipindahkan ke sistem peredaran darah muda, sesetengah cf-miRNA mungkin mencetuskan kemerosotan yang berkaitan dengan penuaan dan mungkin menyebabkan penuaan pramatang pada bahagian muda. Cf-miRNA yang meningkat dengan ketara dalam darah tua mewakili calon yang memerlukan analisis mekanistik terperinci untuk memahami dan mencegah penuaan.

Kesimpulannya, kajian semasa kami telah memberikan pandangan baharu tentang cf-miRNA sebagai molekul berkaitan usia, dan mendedahkan hala tuju penyelidikan baharu untuk menjelaskan hubungan antara penuaan dan RNA berfungsi bebas sel, termasuk cf-miRNA.

Artikel ini dipetik daripada BIOLOGI KOMUNIKASI|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio