Metformin Mengurangkan Kemerosotan Neurokognitif dalam Penuaan Melalui Pengaktifan Laluan AMPK/ BDNF/PI3K BAHAGIAN 1
Jun 01, 2023
Melambatkan kemerosotan neurokognitif yang berkaitan dengan usia telah menjadi satu cabaran. Kami menilai kesan terapeutik metformin dalam penuaan yang disebabkan oleh d-galaktosa. Selain itu, kami mengkaji potensi mekanisme molekul yang boleh bertanggungjawab terhadap kesan anti-penuaan metformin. Tiga puluh ekor tikus jantan dibahagikan sama kepada 1—kumpulan kawalan, yang menerima larutan garam, kumpulan 2—d-galaktosa (D-gal), yang menerima d-galaktosa (100 mg/kg/hari) dengan lavage gastrik selama lapan minggu, dan kumpulan yang dirawat 3-d-galaktosa ditambah Metformin (D-gal ditambah Met), yang menerima d-galaktosa ditambah metformin (200 mg/kg/hari) dengan lavage gastrik selama lapan minggu. Penilaian neurokognitif telah dilakukan. Pengukuran keradangan, tekanan oksidatif, dan biomarker BDNF telah dilakukan. Ekspresi gen AMPK dan PI3K dinilai. Tisu hippocampal dibedah untuk kajian histopatologi dan imunohistokimia. D-gal mengakibatkan kemerosotan neurokognitif, peningkatan biomarker radang, penanda tekanan oksidatif yang diubah, penurunan BDNF dan penurunan ekspresi sinaptophysin dan Bcl2 dengan peningkatan ekspresi Caspase-3, dan pengawalan rendah gen AMPK dan PI3K. Perubahan neurodegeneratif hadir dalam hippocampus. Metformin memulihkan perubahan neurodegeneratif yang disebabkan oleh D-gal dengan ketara. Kami menyimpulkan bahawa metformin boleh mengurangkan defisit neurokognitif yang disebabkan oleh usia melalui pemulihan neuroinflammation, pengecilan tekanan oksidatif, pengurangan apoptosis, serta promosi keplastikan sinaptik. Mekanisme ini boleh dimediasi melalui pengaktifan laluan AMPK/BDNF/PI3K.
Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan boleh menghilangkan spesies oksigen reaktif, menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.
Klik pada Cistanche dalam bahasa Urdu tentang ANTI PENUAAN
【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Singkatan
D-gal d-galaktosa
Spesies oksigen reaktif ROS
IL-1 Interleukin-1
IL-1 Interleukin-1
IL-6 Interleukin-6
IL-10 Interleukin-10
TNF- Faktor nekrosis tumor
BDNF Faktor neurotropik yang berasal dari otak
Kinase protein diaktifkan AMP AMPK
PI3K/Akt Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B
Tindak balas rantai polimerase transkripase terbalik RT-PCR
EPM Bertingkat ditambah labirin
Kependaman Pemindahan TL
MDA Malondialdehid
SOD Superoxide dismutase
Liang peralihan kebolehtelapan mitokondria MPTP
H&E Haematoxylin dan eosin
iNOS Sintase nitrik oksida yang boleh diinduksi
NF-κB Faktor nuklear-κB
LTP Potensi jangka panjang
Kehilangan berterusan fungsi fisiologi, ketangkasan mental dan ingatan yang berlaku dengan penuaan adalah proses pelbagai rupa yang mungkin dicetuskan oleh kematian sel neuron1. Jangka hayat di banyak negara diunjurkan melebihi 85 tahun menjelang 20302. Disebabkan penurunan kualiti hidup warga tua dan perbelanjaan ekonomi dan peribadi yang berkaitan, masalah kognitif yang berkaitan dengan penuaan telah muncul sebagai isu sosial yang penting. Di samping itu, penuaan otak adalah punca utama perkembangan penyakit neurodegeneratif yang kerap berkembang secara tidak dapat dipulihkan3. Terdapat sedikit atau tiada rawatan berkesan yang tersedia pada masa ini untuk kemerosotan neurokognitif yang berkaitan dengan penuaan4.
d-galaktosa (D-gal), monosakarida yang banyak terdapat dalam produk susu, biasanya ditukar kepada glukosa oleh enzim. Walau bagaimanapun, pentadbiran D-gal sistemik jangka panjang boleh menimbulkan bahaya kesihatan yang besar5. Penyelidikan terdahulu mencadangkan bahawa penghantaran D-gal sistemik yang berterusan kepada tikus boleh mengubahnya menjadi model penuaan dan gangguan neurodegeneratif yang berkaitan dengan usia6. Model penuaan D-gal mempunyai beberapa kelebihan berbanding model penuaan semula jadi, termasuk keupayaan untuk menumpukan perhatian semata-mata pada proses penuaan. Dalam model penuaan semula jadi, komorbiditi termasuk diabetes dan hipertensi adalah pembolehubah yang merumitkan7.
D-gal dianggap menghasilkan anomali biokimia yang serupa dengan yang dilihat pada otak manusia yang semakin tua, seperti pengurangan aktiviti enzim antioksidan dan pengecilan neuron kolinergik. Produk akhir glikasi lanjutan, yang dikaitkan dengan kedua-dua penuaan normal dan patofisiologi banyak penyakit, dihasilkan oleh interaksi D-gal dengan kumpulan amino protein. Haiwan yang dibekalkan D-gal menyebabkan keradangan saraf, kerosakan mitokondria, dan kerosakan oksidatif daripada pembangunan Spesies Oksigen Reaktif (ROS) bersama-sama dengan masalah dalam pelaziman kebaharuan, kekurangan dalam pembelajaran spatial dan fungsi kognitif8.
Keradangan boleh menjadi faktor utama kemerosotan kognitif di kalangan warga tua. Tahap interleukin-6, IL-1 yang tinggi, tumor necrosis factor- , dan protein C-reaktif telah dikaitkan dengan peningkatan risiko morbiditi dan kematian di kalangan warga emas9. Rawatan d-galaktosa kronik dalam tikus yang disebabkan oleh pengaktifan laluan isyarat apoptosis neuron dan neuroinflammation dalam korteks serebrum dan hippocampus1.
Penuaan mengakibatkan penurunan dalam faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF) yang merupakan protein penting yang terlibat dalam perubahan plastik yang berkaitan dengan pembelajaran dan ingatan serta pengantara penting untuk percambahan dan integriti neuron10.
Penemuan sebatian baru yang melambatkan penuaan dan menyokong prestasi kognitif telah menjadi salah satu cabaran terbesar. Metformin cepat menembusi penghalang darah-otak dan terkumpul di beberapa kawasan otak, termasuk kelenjar pituitari dan hippocampus11. Telah ditunjukkan bahawa pentadbiran metformin jangka panjang mengurangkan permulaan komplikasi patologi berkaitan usia dan memanjangkan umur panjang pada manusia12. Tambahan pula, metformin telah ditunjukkan untuk memperbaiki gangguan kognitif dan gangguan tingkah laku seperti kebimbangan dalam kedua-dua individu diabetes dan bukan diabetes13,14 dan pesakit dengan penyakit neurodegenerative15. Walau bagaimanapun, mekanisme asas kesan metformin dalam meningkatkan kemerosotan neurokognitif berkaitan usia adalah rumit dan belum difahami sepenuhnya.
Kesan neuroprotektif metformin mungkin disebabkan terutamanya oleh pengaktifan laluan isyarat AMP-Activated Protein Kinase (AMPK)11. Pengaktifan AMPK mengawal selia ekspresi BDNF, yang mempunyai peranan penting dalam penghantaran sinaptik dan penyatuan memori10. Sebagai tambahan kepada sifat pengaktifan AMPK yang mantap ini, keputusan sebelumnya telah menunjukkan bahawa metformin boleh meningkatkan ingatan melalui pemulihan tekanan oksidatif, penurunan neuroinflammation, dan perencatan apoptosis, yang mungkin mengembangkan tanda klinikalnya dalam bidang gangguan neurodegeneratif14. Metformin ialah pengaktif kuat laluan phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) yang merupakan laluan isyarat kritikal yang penting dalam menghalang apoptosis dan menggalakkan kemandirian sel16.
Mengambil kira faedah metformin, yang termasuk keselamatan, kemampuan dan kebolehgunaannya; kami mengkaji kesan neuroprotektif pentadbiran metformin terhadap kemerosotan neurokognitif yang disebabkan oleh penuaan akibat d-galaktosa pada tikus. Selain itu, mekanisme molekul asas kesan perlindungan ini telah disiasat.
Bahan dan kaedah
Haiwan.Tikus jantan Tirty Wister albino seberat 200–250 gram telah digunakan dalam eksperimen selepas mendapat kelulusan yang diperlukan daripada Jawatankuasa Etika Penyelidikan di Fakulti Perubatan, Universiti Menoufa, Mesir (nombor pendaftaran 10/2022 PHYS 9). Prosedur percubaan mengikut garis panduan ARRIVE. Tikus-tikus tersebut ditempatkan dalam sangkar dawai (80×40×30 cm). Semua haiwan diberikan akses penuh kepada makanan dan air semasa tempoh kajian selepas menyejukkannya selama 2 minggu pada keadaan persekitaran yang berterusan dan kitaran cahaya/gelap 12:12-h.
Reka bentuk eksperimen.Haiwan dibahagikan secara rawak kepada tiga kumpulan (10/kumpulan):
1. Kumpulan kawalan: Menerima larutan garam melalui gavage oral.
2. kumpulan d-galaktosa (D-gal): Menerima d-galaktosa (Sigma-Aldrich St. Louis, Amerika Syarikat) yang dilarutkan dalam larutan garam dalam dos 100 mg/kg berat badan melalui lavage gastrik selama lapan minggu berturut-turut17
3. Kumpulan rawatan d-galaktosa tambah Metformin (D-gal tambah Met): Diterima d-galaktosa (dengan dos yang sama dalam kumpulan D-gal) ditambah metformin (Sigma-Aldrich St. Louis, Amerika Syarikat) yang dilarutkan dalam larutan garam dalam dos 200 mg/kg/hari melalui lavage gastrik selama lapan minggu berturut-turut16
Selepas tamat lapan minggu, penilaian neurobehavioral semua tikus telah dilakukan. Selepas itu, tikus dibius dan dikorbankan dengan pemanjangan dan terkehel serviks. Otak diekstrak dan dibasuh dengan garam penampan fosfat (pH 7.4). Hemisfera kiri ditimbang dan dibahagikan kepada dua bahagian; satu daripadanya digunakan untuk analisis biokimia dan separuh lagi digunakan untuk kajian RT-PCR. Hemisfera kanan telah ditetapkan dalam salin formalin 10 peratus untuk penilaian histopatologi dan imunohistokimia tisu hippocampal.
Ujian neurobehavioral.Pengecaman objek novel. Ujian pengecaman objek baru digunakan untuk menilai keupayaan tikus untuk mengenali objek baru dalam persekitaran yang biasa. Setiap tikus mempunyai tiga hari ujian, yang merangkumi tiga fasa: pelaziman, latihan, dan ujian. Tikus diletakkan ke dalam radas medan terbuka (50 cm × 50 cm × 40 cm) semasa fasa pelaziman, dan mereka diberi sepuluh minit untuk penyesuaian tanpa sebarang item. Setiap tikus disimpan di dalam ruang dengan dua objek yang sama selama lima minit semasa fasa latihan. Selepas dua puluh empat jam, setiap tikus diletakkan di dalam bilik selama lima minit semasa fasa ujian, yang melibatkan penggantian salah satu objek lama dengan yang baru. Jam randik digunakan untuk memasa tempoh penerokaan objek. Indeks diskriminasi [=(masa penerokaan objek novel–masa penerokaan objek keluarga)/jumlah masa penerokaan×100 peratus ] digunakan untuk menilai prestasi kognitif tikus. Alkohol digunakan untuk membersihkan kawasan lapang dan objek di antara tikus18.
Labirin air Morris. Maze air Morris digunakan untuk mengkaji kesan metformin terhadap pembelajaran dan ingatan spatial. Sebuah kolam diperbuat daripada keluli tahan karat, mempunyai diameter 210 cm dan ketinggian 50 cm termasuk pelantar melarikan diri yang tenggelam 1 cm di bawah permukaan air. Air dikekalkan pada 24±1 darjah . Tugas pemerolehan telah diuji selama lima hari ujian dengan empat percubaan setiap hari. Masa yang diperlukan untuk sampai ke platform rahsia semasa setiap percubaan telah direkodkan sebagai kependaman melarikan diri. Maksimum 60 saat diberikan kepada tikus untuk mengesan pelantar tersembunyi. Had masa maksimum 60 saat telah ditetapkan, dan tikus dibimbing secara manual ke platform tersembunyi. Satu percubaan siasatan telah dijalankan 24 jam selepas percubaan terakhir pada hari kelima. Pelantar telah dikeluarkan dan tikus diletakkan ke dalam kolam dari kuadran bertentangan dengan kuadran latihan. Kemudian, tikus itu dibenarkan berenang bebas selama 60 saat. Masa yang dihabiskan dalam kuadran sasaran direkodkan19.
Ujian tambah-maze (EPM) tinggi. EPM ialah teknik yang mantap untuk menilai tingkah laku seperti kebimbangan pada tikus. Ia diperbuat daripada kayu dan terdiri daripada lengan terbuka dan tertutup (50 cm panjang × 10 cm lebar). Kedua-dua lengan tertutup itu dikelilingi oleh dinding setinggi 40 cm. Lengan dilekatkan oleh platform persegi tengah (10×10 cm). Radas itu berada 50 cm di atas lantai. Setiap tikus diletakkan di tengah-tengah radas menghadap lengan tertutup dan dibiarkan bergerak bebas selama lima minit. Masa yang dihabiskan dalam lengan terbuka dan tertutup direkodkan. Selain itu, penyertaan tangan terbuka telah direkodkan dalam 20. Kami juga mengukur Kependaman Pemindahan (TL) yang digunakan untuk menilai ingatan dan pembelajaran. Pada hari pertama (sesi pemerolehan), setiap tikus didedahkan kepada EPM selama 90 saat. Masa yang diambil oleh tikus untuk mencapai lengan tertutup direkodkan sebagai TL. Tikus yang gagal masuk dalam lengan tertutup dalam 90s dikecualikan daripada kajian. Pada hari kedua (sesi pengekalan), setiap tikus dimasukkan ke dalam lengan terbuka, dan TL direkodkan untuk maksimum 90 s21.
Analisis biokimia.Tisu otak disapu dengan larutan PBS, kemudian dihomogenkan dalam penampan sejuk 5 ml setiap tisu gram. Sentrifugasi tisu otak dilakukan pada 4000 rpm selama 15 minit, kemudian supernatan dikeluarkan dan disimpan pada suhu -80 darjah sehingga pengukuran Malondialdehyde (MDA) dan Superoxide Dismutase (SOD) dengan menggunakan colorimetric konvensional (QuantiChrom™, BioAssay Systems, USA), serum Tumor Necrosis Factor (TNF- ), Interleukin 10 (IL-10), dan Brain-Derived Neurotropic Factor (BDNF) dengan menggunakan kit ELISA (Quantikine, syarikat Abcam, Cambridge, UK) mengikut pengilang arahan.
Ujian kuantitatif ekspresi gen AMPK dan PI3K menggunakan teknik tindak balas rantai polimerase transkripase terbalik (RT‑PCR).Tisu otak telah disediakan untuk pengasingan RNA total menggunakan Qiagen RN Easy plus Universal Kit dari Amerika Syarikat. Kemudian, kualiti dan ketulenan RNA terjamin. RNA disimpan pada − 8{10}} darjah sehingga digunakan. Kemudian, langkah pertama ialah sintesis cDNA menggunakan QuantiTect Reverse Transcription Kit, Qiagen dari USA, menggunakan Applied Biosystems 2720 thermal cycler (Singapura) untuk satu kitaran sahaja. Primer GAPDH digunakan dalam tindak balas RT-PCR sebagai kawalan pemuatan RNA. Langkah kedua ialah penguatan cDNA: cDNA digunakan dalam PCR masa nyata kuantitatif berasaskan hijau SYBR untuk Kuantitatif Relatif (RQ) ekspresi gen AMPK dan PI3K oleh SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit, Amerika Syarikat, menggunakan primer yang direka bentuk berikut (Midland, Texas ): Primer hadapan untuk AMPK ialah (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC). Dan primer terbalik ialah (TGTGACTTCCAGGTCGGGAGTT). Primer hadapan untuk PI3K ialah (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA), dan primer terbalik ialah (GAAACTTTTTCCCACCACGA). Akhir sekali, analisis data dengan perisian Applied Biosystems 7500 versi 2.0.1 telah dilakukan. RQ ekspresi gen AMPK dan PI3K dilakukan menggunakan kaedah ∆∆Ct perbandingan, di mana jumlah gen sasaran (AMPK dan PI3K) mRNA dinormalisasi kepada gen rujukan endogen (GAPDH) dan relatif kepada kawalan.
Penilaian histopatologi tisu otak.Pemeriksaan histologi. Tisu otak telah ditetapkan dalam larutan formalin 10 peratus, tertanam dalam parafin, dan bahagian koronal bersiri dengan ketebalan 5 μm diperolehi. Bahagian hippocampus otak kemudiannya diwarnai dengan Hematoxylin dan Eosin (H&E) untuk pemeriksaan dengan mikroskop cahaya.
Pewarnaan imunohistokimia pada hippocampus. Pewarnaan imunohistokimia caspase-3 (nombor CAT: ab32351, syarikat Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, Amerika Syarikat) dan synaptophysin (nombor CAT: ab32127, syarikat Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, arnab Amerika Syarikat) dilakukan dengan menggunakan rabbit antibodi monoklonal. Untuk Bcl-2 (nombor CAT: ab59348, syarikat Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, Amerika Syarikat), ia berlaku dengan menggunakan antibodi poliklonal arnab. Mereka diterima dalam satu botol yang mengandungi 1 ml antibodi. Anti-caspase-3, anti-synaptophysin dan anti-Bcl-2 telah digunakan dalam kuantiti cair masing-masing 1:50, 1:400 dan 1:100. Bahagian dipotong pada 5 µm dan diwarnai oleh imunostainer LINK 48 automatik (Dako, Agilent Technologies Inc, Santa Clara, Amerika Syarikat). Untuk mendapatkan semula haba, penimbal sitrat digunakan oleh immunostainer. Slaid diwarnakan secara automatik oleh antibodi cair primer. Kawalan positif untuk tindak balas dilakukan menggunakan bahagian tertentu yang dibenamkan parafin pada tonsil manusia normal, pankreas manusia dan adenoma folikel untuk caspase-3, synaptophysin dan Bcl-2, masing-masing. Kawalan negatif dibuat dengan menggantikan antibodi utama dengan serum bukan imun.
Penilaian penanda histopatologi dan imunohistokimia (caspase-3, synaptophysin, dan Bcl-2) telah dilakukan di kawasan hippocampus yang berbeza termasuk CA1, CA2 dan CA3.
Analisis statistik.Keputusan dinyatakan sebagai min±Sisihan Piawai (SD). Analisis Varians (ANOVA) digunakan untuk analisis statistik kumpulan berbeza, menggunakan perisian Origin® dan kebarangkalian peluang (nilai p). nilai P<0.05 were considered significant.
Kelulusan etika dan persetujuan untuk mengambil bahagian.Kerja ini telah diluluskan oleh dan oleh garis panduan Jawatankuasa Etika Fakulti Perubatan, Universiti Menoufa, Mesir.
Keputusan
Ujian neurobehavioral.Mengenai ujian objek baru, peratusan indeks diskriminasi adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (-37.16±3.31 peratus berbanding 30.16±2.92 peratus, masing-masing, P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).
Berkenaan dengan ujian maze Morris, nilai min tempoh kependaman melarikan diri adalah lebih tinggi dengan ketara pada hari pertama, kedua, ketiga, keempat dan kelima dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (58.16±1.94, 4{ {19}}.62±1.33, 32.75±1.10, 24.37±1.58 dan 15.29±0.98s lwn. 40.16±2.92, 25.16±1.15, 17.04±1.08, ± 1.08, ± 1.08, ± 1.08, ± 5.16±2.92 86 s, masing-masing, P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75, and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s, respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).
Dalam ujian plus-maze yang ditinggikan, nilai purata tempoh yang dibelanjakan oleh tikus dalam lengan terbuka adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (masing-masing 60±6.54s vs. 90.83±3.48s). , P<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).
Ujian biokimia.Nilai purata tahap MDA otak adalah lebih tinggi dengan ketara, manakala nilai purata tahap SOD otak adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (70±3.23 nmol/mg protein dan 13.05±1.{{7 }} Protein U/mg berbanding 33.76±2.13 nmol/mg protein dan masing-masing 29.11±4.34 U/ mg protein, P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and 21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).
Nilai min tahap TNF- otak adalah lebih tinggi dengan ketara, manakala nilai min tahap IL-10 otak adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (67.50 ± 10.03 pg/mg protein dan 72.91 ±8.45 pg/mg protein berbanding 16.61 ±1.21 pg/mg protein dan masing-masing 157.23 ±12.46 pg/mg protein, P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).
Nilai purata tahap BDNF otak adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (masing-masing 125.72 ± 4.17 pg/mg protein berbanding 225.20 ± 5.52 pg/mg protein, P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).
RT‑PCR kuantitatif (qRT‑PCR). Ungkapan gen AMPK dan PI3k (0.52±0.11dan 0.37±0.03, masing-masing, P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan (Rajah 6).
Histopatologi.Noda H&E tisu hippocampal dalam kumpulan kawalan mendedahkan perubahan patologi yang luar biasa. Kumpulan D-gal menunjukkan banyak degenerasi neuron dan badan apoptosis dengan edema dan gliosis yang besar. Walau bagaimanapun, bahagian kumpulan D-gal plus Met menunjukkan sedikit degenerasi neuron dan beberapa badan apoptosis dengan edema ringan dan gliosis fokus ringan (Rajah 7).
Imunohistokimia. Keputusan imunohistokimia mendedahkan bahawa nilai skor H ekspresi sinaptofisin dalam tisu hippocampal adalah jauh lebih rendah (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).
Nilai skor H bagi ekspresi caspase-3 dalam tisu hippocampal adalah lebih tinggi dengan ketara (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group (Fig. 9).
Nilai skor H bagi ekspresi Bcl-2 dalam tisu hippocampal adalah jauh lebih rendah (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).
Perbincangan
Peningkatan purata jangka hayat meningkatkan risiko penyakit di kalangan warga emas, terutamanya dalam arena kognitif yang mungkin, sekurang-kurangnya sebahagiannya, disebabkan oleh kehilangan neuron di otak. Adalah diterima baik bahawa suntikan jangka panjang d-galaktosa menyumbang kepada kemajuan penuaan dan sedikit kerosakan neuron dan kecacatan ingatan. Oleh kerana penuaan D-galinduced disertai oleh neurodegeneration, ia boleh menjadi model yang ideal untuk mengkaji mekanisme molekul yang terlibat dengan neurodegeneration yang berkaitan dengan usia dan untuk menguji pendekatan terapeutik baru22.
Kajian kami menunjukkan bahawa pentadbiran kronik D-gal menjejaskan tingkah laku penerokaan yang disebabkan oleh kebaruan dan ingatan kerja pada tikus. Ini jelas dalam keputusan objek novel, labirin air Morris, dan ujian labirin ditambah tinggi. Keputusan ini adalah selaras dengan kajian lain yang dilaporkan23. Sebaliknya; rawatan dengan metformin meningkatkan memori kerja dan keutamaan untuk kebaharuan jika dibandingkan dengan kumpulan D-gal. Menyokong keputusan kami, kajian terdahulu melaporkan bahawa metformin meningkatkan ingatan jangka pendek dalam tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin24. Didokumentasikan dengan baik bahawa penuaan dikaitkan bukan sahaja dengan penurunan dalam fungsi kognitif tetapi juga dengan perubahan emosi termasuk tingkah laku seperti kebimbangan yang mengakibatkan kemerosotan fungsi25. Dalam kajian ini, keputusan ujian EPM menunjukkan peningkatan tingkah laku seperti kebimbangan dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan. Manakala rawatan dengan metformin melemahkan tingkah laku seperti kebimbangan.
Kajian ini mendedahkan bahawa perubahan neurobehavioral yang disebabkan oleh pentadbiran lisan D-gal disertai oleh gangguan dalam penanda tekanan oksidatif otak. Nilai purata tahap MDA dalam homogenat tisu otak adalah lebih tinggi, manakala aktiviti enzim antioksidan SOD adalah lebih rendah secara signifikan dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan. Keputusan yang sama dilaporkan sebelum ini23,26. D-gal berinteraksi dengan pelbagai amina bebas dalam seni bina protein melalui glikasi bukan enzimatik, menghasilkan penjanaan produk glikasi termaju. Ini menghasilkan penjanaan ROS yang meningkatkan penuaan otak melalui kerosakan oksidatif kepada DNA, lipid, dan protein. Kehilangan ingatan dan gangguan pembelajaran yang disebabkan oleh pentadbiran kronik D-gal boleh dikaitkan dengan penjanaan radikal bebas, mengakibatkan kemerosotan neurogenesis dan, akhirnya, neurodegeneration27. Selain itu, neuron otak lebih mudah terdedah kepada tekanan oksidatif kerana kehadiran kandungan lipid yang tinggi dan penggunaan oksigen yang lebih tinggi26.
Sebaliknya, pentadbiran metformin memulihkan keseimbangan redoks dengan ketara. Bukti menunjukkan bahawa metformin boleh menghalang Liang Peralihan Kebolehtelapan Mitokondria (mPTP) dan mengurangkan pengeluaran ROS dan peroksidasi lipid28. Oleh itu, ini menunjukkan bahawa kesan anti-penuaan metformin mungkin mungkin dimediasi oleh pertahanan antioksidatifnya.
Selain tekanan oksidatif, keradangan juga merupakan mekanisme penting yang mendorong penuaan rawatan D-gal. D-gal menggalakkan penjanaan ROS yang mengaktifkan laluan keradangan3. Neuroinflammation kronik dan rembesan sitokin pro-radang adalah ciri penuaan29. Terdapat persetujuan bahawa sitokin radang terlibat dalam tekanan oksidatif. TNF-, IL-6 dan IL-1 adalah penting dalam pembangunan dan perkembangan tegasan oksidatif. Sitokin ini dikaitkan dengan ROS dan mengaktifkan faktor Nuklear-κB (NF-κB) untuk translokasi ke nukleus dan mengawal ekspresi gen pro-radang seperti iNOS dan COX2, yang terlibat dalam tindak balas keradangan dan imun, dan seterusnya membawa kepada fibrosis, apoptosis, dan tindak balas fasa akut yang menyebabkan kerosakan organ30. Data yang dinyatakan di atas adalah konsisten dengan keputusan kami, kerana tahap TNF-alpha adalah lebih tinggi dengan ketara dan IL-10 adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan D-gal berbanding dengan kumpulan kawalan.
Sebaliknya, rawatan dengan metformin menghasilkan pengurangan ketara dalam penanda keradangan jika dibandingkan dengan kumpulan D-gal. Kesan anti-radang metformin boleh dikaitkan dengan pengaktifan isyarat AMPK, yang menyekat tindak balas keradangan melalui perencatan NF-κB29. Juga, ia mengurangkan pengeluaran sitokin pro-radang dan pengaktifan mikroglial dalam otak yang seterusnya, mengurangkan tekanan oksidatif30
Untuk lebih memahami mekanisme molekul yang mendasari tindakan metformin, kami mengkaji ungkapan protein AMPK dan PI3k. Kajian kami mendedahkan bahawa ekspresi AMPK dikawal dengan ketara dalam kumpulan D-gal jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan, manakala tahapnya dikawal dengan ketara dalam kumpulan yang dirawat metformin jika dibandingkan dengan kumpulan D-gal. Kajian terdahulu melaporkan bahawa pengaktifan AMPK dan tindak balas AMPK berkurangan dengan usia, yang mungkin menjelaskan peraturan metabolik yang diubah, mengakibatkan pengurangan autophagy dan peningkatan tekanan oksidatif31. Metformin didapati mengaktifkan AMPK dengan meningkatkan fosforilasi AMPK pada Tr-17232. AMPK ialah sasaran utama metformin untuk fungsi perlindungannya terhadap gangguan kognisi. Ghadernezhad et al. melaporkan bahawa pengaktifan AMPK yang disebabkan oleh metformin membawa kepada pengaktifan laluan BDNF / P70S6K dalam neuron hippocampal untuk meningkatkan pembentukan ingatan dalam tugas mengelakkan pasif dalam model tikus iskemia / reperfusi serebrum global. Pengaktifan BDNF mempunyai peranan penting dalam pengawalseliaan fungsi neurokognitif seperti pembelajaran, ingatan, penghantaran sinaptik dan keplastikan 33. Beberapa kajian menunjukkan bahawa AMPK boleh bertindak sebagai modulator Potensi Jangka Panjang (LTP), dan ia diperlukan untuk pembentukan ingatan34 . Oleh itu, peningkatan memori yang disebabkan oleh metformin dalam kajian kami boleh dimediasi melalui pengaktifan isyarat AMPK.
【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
