Analisis Meta Mengenalpasti Metilasi DNA Berkaitan Dengan Fungsi Dan Kerosakan Buah Pinggang

edmund.chen@wecistanche.com

Kronikpenyakit buah pinggangadalah beban kesihatan awam yang utama. Nisbah albumin-ke-kreatinin kencing yang tinggi adalah ukurankerosakan buah pinggang,dan digunakan untuk mendiagnosis dan peringkat kronikpenyakit buah pinggang. Untuk meluaskan pengetahuan mengenai mekanisme pengawalseliaan yang berkaitan denganfungsi buah pinggangdan penyakit, kami menjalankan kajian persatuan seluruh epigenome berasaskan darah untuk anggaran kadar penapisan glomerular (n=33,605) dan nisbah albumin-ke-kreatinin kencing (n=15,068) dan mengesan 69 dan tujuh tapak CpG di mana metilasi DNA dikaitkan dengan sifat masing-masing. Majoriti penemuan ini menunjukkan persatuan yang konsisten secara arah dengan hasil klinikal masing-masing kronikpenyakit buah pinggangdan albuminuria meningkat sederhana. Persatuan metilasi DNA denganfungsi buah pinggang, seperti CpG di JAZF1, PELI1 dan CHD2 telah disahkan dalamtisu buah pinggang. Metilasi pada PHRF1, LDB2, CSRNP1 dan IRF5 menunjukkan kesan kausal padafungsi buah pinggang. Analisis pengayaan mendedahkan laluan yang berkaitan dengan hemostasis dan penghijrahan sel darah untuk anggaran kadar penapisan glomerular, dan pengaktifan dan tindak balas sel imun untuk CpG yang berkaitan dengan nisbah albumin-ke-kreatinin kencing.

Kata kunci:penyakit buah pinggang; kerosakan buah pinggang; fungsi buah pinggang; tisu buah pinggang; struktur buah pinggang

kronikpenyakit buah pinggang(CKD) adalah beban kesihatan awam yang utama. Ia memberi kesan kepada lebih daripada 10 peratus orang dewasa di seluruh dunia dan lebih daripada 40 peratus orang berumur 70 tahun ke atas1,2. CKD ialah punca utama kematian di seluruh dunia3, dan merupakan penyumbang utama kepada morbiditi dan mortaliti kardiovaskular2,4,5. CKD ditakrifkan sebagai kehadiran berterusan keabnormalanbuah pinggangstruktur atau fungsi. Thefungsi buah pinggangukuran yang paling biasa digunakan ialah kadar penapisan glomerular, biasanya dianggarkan daripada kepekatan kreatinin serum (eGFR), dan nisbah albumin-ke-kreatinin (UACR)6. UACR dinaikkan ialah ukuran bagikerosakan buah pinggang, digunakan untuk mendiagnosis dan peringkat CKD7, dan dikaitkan dengan diabetes dan hipertensipenyakit buah pinggang8. Walaupun UACR sederhana tinggi adalah faktor risiko penyakit kardiovaskular, tanpa bergantung kepada yang lainfungsi buah pinggang markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 lokus genetik yang dikaitkan denganfungsi buah pinggang10,12,13. Varian indeks di lokus berkaitan eGFR yang diketahui menerangkan anggaran 8.9 peratus varians eGFR12.Meta-analisis GWAS baru-baru ini bagi kawasan kromatin terbuka bersepadu eGFR dengan set kecil polimorfisme nukleotida tunggal (SNP)10. Keputusan daripada kajian ini menyokong kepentingan peraturan transkrip yang diubah sebagai mekanisme yang menyumbang kepada CKD. Untuk menyiasat metilasi DNA, berkenaan denganfungsi buah pinggang, kajian persatuan seluruh epigenome (EWAS) bagi eGFR dan CKD telah dijalankan. Sebagai pengawal selia utama transkripsi yang boleh dinilai dengan cara yang cekap kos dan pemprosesan tinggi, metilasi DNA telah dikaji di tapak CpG (CpGs) dengan resolusi asas tunggal. Kami sebelum ini menjalankan EWAS termasuk 4859 orang dewasa daripada dua kajian berasaskan populasi dan mengenal pasti 18 tapak yang disahkan, berbeza metilasi dalam darah keseluruhan yang dikaitkan dengan eGFR14. Walaupun kajian ini mendedahkan pandangan tentang mekanisme pengawalseliaan genbuah pinggangfungsi, CpG yang berkaitan menjelaskan hanya 1.2 peratus daripada varians eGFR. Kajian terdahulu yang lain tertumpu kepada pesakit CKD dan/atau pesakit kencing manis atau pesakit dengan jangkitan Human Immunodeficiency Virus, atau dihadkan oleh saiz sampel yang kecil, kekurangan replikasi, pelarasan yang hilang untuk pengganggu yang berpotensi, atau gabungannya14–19. Kajian lain memberi tumpuan kepada corak metilasi DNA pesakit kencing manispenyakit buah pinggang(DKD) pesakit20–22.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG

Di sini, kami menjalankan EWAS sebanyakfungsi buah pinggangciri untuk mengenal pasti CpG tambahan yang berkaitan dengan mekanisme pengawalseliaan gen yang berpotensi penting kepada CKD. Kami melanjutkan bekas EWAS untuk eGFR dan CKD dengan meningkatkan saiz sampel dengan ketara kepada 33,605 individu. Selain itu, kami memasukkan UACR dan albuminuria (microalbuminuria) yang meningkat secara sederhana sebagai ciri tambahan. EWAS telah dijalankan dalam kebanyakan kajian berasaskan populasi yang menyesuaikan jantina, umur, diabetes, hipertensi, indeks jisim badan (BMI), status merokok, dan bahagian sel darah putih yang paling banyak. Kami mereplikasi keputusan EWAS kami dalam sampel berasingan, mengaitkan tapak CpG dengan tahap ekspresi gen dalam tisu yang berbeza, menggunakan penemuan pada hasil klinikal, dan menilai sebab akibat antara metilasi DNA danfungsi buah pinggang(Tambahan Rajah 1).

Keputusan

Kaji ciri sampel. Dalam penyiasatan ini, 36 kajian dengan sejumlah 33,605 peserta menyumbang kepada EWAS eGFR dan 15,068 kepada EWAS UACR. Ciri-ciri terkumpul mereka ditunjukkan dalam Jadual 1, dan penerangan kajian individu disediakan dalam Data Tambahan 1 dan 2.

EWAS eGFR dan UACR.Kami menyiasat persatuanbuah pinggangciri-ciri dengan metilasi DNA dalam darah sehingga 441, 870 CpGs, pertindihan CpG yang diliputi oleh Illumina MethylationnEPIC BeadChip dan array Illumina HumanMethylation450 BeadChip, yang digunakan untuk pengukuran oleh semua kecuali satu kajian (Data Tambahan 3). Semua kajian melakukan pembersihan data tatasusunan dan menggunakan skrip yang dibangunkan secara berpusat untuk penyediaanbuah pinggangnilai sifat, yang kemudiannya berkaitan dengan metilasi DNA menggunakan model regresi linear terlaras kovariat dengan nilai metilasi sebagai pembolehubah bersandar mengikut protokol kajian yang telah ditetapkan (lihat Kaedah). Kami memerhatikan tiada atau sedikit inflasi dalam EWAS khusus kajian (eGFR min inflasi=1.00, UACR min inflasi=1.00, Data Tambahan 1 dan 2). Dalam EWAS trans-etnik terlaras pelbagai pembolehubah, 69 CpG dikaitkan dengan ketara dengan eGFR dan direplikasi (Rajah 1A, Data Tambahan 4, lihat Kaedah), termasuk yang dilaporkan sebelum ini14. Tapak yang direplikasi menunjukkan corak metilasi lebih rendah yang jelas (60 CpGs, Pbinom=2.2E−10; Rajah 1A).

Rajah 1 keputusan EWAS bagi eGFR dan UACR. Plot Chicago hasil kajian persatuan seluruh epigenome (EWAS) untuk anggaran kadar penapisan glomerular (eGFR) (A) dan nisbah albumin-ke-kreatinin (UACR) (B) urin menggunakan penemuan gabungan dan sampel replikasi. Tapak-tapak tersebut disusun mengikut kedudukan kromosomnya pada paksi-x, dengan nilai –log10 P-nilai persatuan Wald-test yang disediakan pada paksi-y. CpG berkorelasi positif dengan sifat diplot di bahagian atas, tapak dengan korelasi negatif di bahagian bawah. Garis mendatar bertitik mewakili tahap keertian (nilai P <1.1e−7). tapak="" replika="" novel="" diwarnakan="" dalam="" oren,="" tapak="" replika="" yang="" diketahui="" diwarnai="" dengan="" warna="" biru="" dan="" tapak="" yang="" dikaitkan="" tambahan="" dengan="" sifat="" binari="" masing-masing="">penyakit buah pinggang[CKD]/ mikroalbuminuria [MA]) ditandakan dengan salib.

Dalam meta-analisis, nilai-P terendah diperhatikan untuk persatuan eGFR yang diketahui termasuk cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-value=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, P-value=3.2E−24), dan cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-value=8 .7E−20)14, diikuti dengan fifinding baharu pada cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, nilai P=1.1E−17). 69 replikasi CpG berkaitan eGFR sahaja menjelaskan 15.7 peratus variasi eGFR dalam sampel kajian berasingan 1888 peserta (lihat Kaedah). Apabila menambahkan semua kovariat (jantina, umur, diabetes, hipertensi, BMI, merokok dan perkadaran sel darah putih) pada model perkaitan, jumlah perkadaran varians yang dijelaskan dalam eGFR meningkat kepada 36.3 peratus , dengan variasi 2.4 peratus dikaitkan dengan 69 CpGs bebas daripada kovariat lain.

Dalam analisis trans-etnik UACR, tujuh CpG dikaitkan dan direplikasi dengan ketara (Rajah 1B, Data Tambahan 5, lihat Kaedah). Daripada penemuan, cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-value=2.6E−13) dan cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, P-value=9.9E−13) mempunyai nilai-P perkaitan meta-analisis terkecil. Pada enam daripada tujuh CpG, metilasi yang lebih rendah dikaitkan dengan UACR yang lebih tinggi. Oleh kerana bilangan tapak yang direplikasi, kuasa ujian binomial adalah terhad (6 CpGs, pbinom=0.13; Rajah 1B). CpG yang direplikasi menjelaskan 3.9 peratus dan model penuh 14.6 peratus daripada variasi dalam tahap UACR, dengan 0.07 peratus dikaitkan dengan CpG secara bebas daripada kovariat lain.

Terdapat pertindihan yang rendah antara EWAS yang direplikasi dan lokus GWAS yang dilaporkan sebelum ini untuk kedua-dua eGFR (tindih=10 daripada 69; Data Tambahan 4) dan UACR (tindih=1 daripada 7; Data Tambahan 5). Tiada pertindihan CpG yang direplikasi antara eGFR dan UACR, yang menunjukkan profil metilasi DNA khusus sifat dalam darah. Malah di antara 967 dan 270 persatuan yang menjurus (nilai P <1e−05) bagi="" gabungan="" meta-analisis="" sampel="" penemuan="" dan="" replikasi="" untuk="" egfr="" dan="" uacr,="" masing-masing,="" hanya="" 10="" tapak="" yang="" bertindih="" antara="" kedua-dua="" sifat.="" keputusan="" terperinci="" daripada="" meta-analisis="" ini="" untuk="" semua="" persatuan="" yang="" menjurus="" disediakan="" dalam="" data="" tambahan="" 6="" (egfr)="" dan="" 7="">Heterogenitas keturunan dan keteguhan penemuan. Untuk menilai sama ada keputusan persatuan pada eGFR dan UACR mungkin didorong oleh keturunan tertentu, kami melakukan meta-analisis EWAS berstrata keturunan bagi sampel keturunan Eropah (EA) dan keturunan Afrika Amerika (AA) dengan hasil daripada pelbagai kajian yang menyumbang kepada kedua-dua ini. etnik. Perbandingan hasil perkaitan CpG yang direplikasi dalam sampel EA (Negar=23,671; nUACR=9806) dengan sampel AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) dalam atau dalam tempoh 50 bp daripada 69 CpG yang direplikasi telah dinilai untuk menilai sama ada kehadiran SNP boleh menjejaskan pengikatan probe. Empat probe terletak berhampiran SNP biasa (Data Tambahan 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), yang bagaimanapun, tidak dikaitkan dengan sebarang sifat GWAS mengikut sumber PhenoScanner V2 (diakses 02/12/2021, pGWAS <5e−8, termasuk="" snp="" proksi="" dengan="" eur="" r²=""> 0.8)23. Ini menunjukkan bahawa keputusan EWAS tidak mungkin dikelirukan oleh sifat biasa yang diketahui berkaitan denganfungsi buah pinggangoleh variasi urutan DNA yang berdekatan. SNP dalaman probe yang lebih daripada lima pangkalan dari hujung 3'-probe secara amnya didapati tidak mempunyai akibat yang boleh diabaikan24.

Kaitan dengan CKD dan mikroalbuminuria.Daripada 69 CpG yang dikaitkan dengan eGFR, 53 juga dikaitkan dengan CKD lazim dalam analisis meta sebanyak 25,609 individu termasuk 2376 kes dengan arah kesan yang konsisten (nilai-P < 0.="" 05/69;="" data="" tambahan="" 4,="" rajah="" tambahan="" 3a).="" korelasi="" antara="" kesan="" egfr="" dan="" ckd="" adalah="" tinggi="" (r="-0.93;" rajah="" 3a).="" dalam="" kohort="" bebas="" daripada="" 551="" pesakit="" ckd,="" 65="" cpg="" adalah="" konsisten="" secara="" arah="" dengan="" meta-analisis="" egfr="" dan="" lima="" direplikasi="" (nilai="" p=""><0.05 9,="" r="0.77;" rajah="" tambahan="" 4,="" data="" tambahan="" 4,="" lihat="" kaedah).="" dalam="" kohort="" yang="" sama,="" egfr="" berkaitan="" cpgs="" cg18194850="" (p-value="1.6E−5)" dan="" cg07242931="" (p-value="2.3E−5)" juga="" dikaitkan="" dengan="" masa="">kegagalan buah pinggangatau akutkecederaan buah pinggang(Data Tambahan 8, lihat Kaedah). Kesemua tujuh CpG yang dikaitkan dengan UACR juga dikaitkan secara signifikan dengan mikroalbuminuria dalam sampel 7279 individu termasuk 1186 kes dengan arah kesan yang sama seperti untuk UACR (nilai-P < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98;="" rajah="" 3b,="" data="" tambahan="" 5,="" rajah="" tambahan="">

Korelasi dengan ekspresi gen. Untuk mendapatkan pandangan tentang kemungkinan mekanisme fungsi CpG yang berkaitan dengan eGFR dan UACR, kami menguji korelasi tahap metilasi DNA mereka dengan tahap mRNA gen yang dikodkan dalam cis dalam darah keseluruhan serta dalam monosit darah (lihat Kaedah, Data Tambahan 9 ). Cg17944885 berkaitan eGFR yang diketahui pada kromosom 19 berhampiran ZNF788 dikaitkan dengan transkrip yang dikodkan oleh protein jari zink 240 kb jauh 439 (ZNF439, Jadual 2). Di samping itu, metilasi cg04864179 pada faktor pengawalseliaan interferon 5 (IRF5) dikaitkan dengan kedua-dua transkrip mRNA yang dikodkan oleh IRF5 dan transportin 3 (TNPO3) berdekatan (Tambahan Rajah 5A). Daripada persatuan UACR, kedua-dua CpG yang direplikasi cg02711608 dan cg22304262 pada keluarga pembawa bahan terlarut 1 ahli 5 (SLC1A5) mendedahkan persatuan yang ketara dengan tahap mRNA SLC1A5, dan cg23570810 pada interferon-induced citra transkrip 1 (protein transkrip transkrip 1) 1 (protein transmembran1 transkrip) 2). Semua keputusan analisis ekspresi gen disediakan dalam Data Tambahan 9.

Kesan pada tisu buah pinggang.Untuk menilai sama ada kesan metilasi yang diperhatikan dalam darah diterjemahkan kepadatisu buah pinggang,kami menggunakan model regresi untuk menguji perkaitan CpG yang direplikasi untuk signifikan (kadar penemuan palsu (FDR) < 0.05) dan perkaitan konsisten arah dengan eGFR danbuah pinggangfibrosis, masing-masing, dalam 506 microdissectedtisu buah pinggangsampel. Dalam sampel ini,buah pinggang-Metilasi DNA berasaskan tisu daripada CpG berkaitan eGFR yang direplikasi cg23597162 di JAZF1, cg26099045 berhampiran PELI1, dan cg12644285 pada CHD2 dikaitkan dengan ketara dengan eGFR dengan arah kesan yang sama seperti dalam darah (Tambahan Rajah 26, Tambahan) . Tambahan pula, CpG yang sama pada PELI1 dan enam tambahan

tapak (cg20146909 di LRRC8D, cg25767870 berhampiran FAM46C, cg16618493 di ZBTB7B, cg10632966 berhampiran RPEL1, cg01068906 pada NOD2, dan cg032973731 pada KDNK)buah pinggangsampel tisu dengan arah kesan yang konsisten (iaitu songsang) (Tambahan Rajah 6B, Jadual 2). Daripada tapak UACR yang direplikasi, tahap metilasi DNA dalambuah pinggangtisu cg00008629 di PTBP3 dan cg24859433 berhampiran IER3 dikaitkan dengan fibrosis dan menunjukkan arah kesan yang sama (Tambahan Rajah 6D, Jadual 2). Selaras dengan penemuan EWAS, tiada perkaitan penting CpGs UACRassociated dengan eGFR dalam penderma sampel buah pinggang ditemui (Tambahan Rajah 6C, Data Tambahan 10).

Kesan penyebab antara metilasi DNA danfungsi buah pinggangsifat. Untuk menilai sama adafungsi buah pinggangciri-ciri memberi kesan kepada metilasi DNA atau sebaliknya, kami menjalankan analisis rawak Mendelian (MR) dua-arah sampel dua arah bagi CpG yang berkaitan dengan ketara. Analisis MR arah hadapan mencadangkan bahawa CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1), dan cg04864179 (IRF5) mempengaruhi tahap eGFR (Jadual 3). Anggaran kebolehwarisan bagi empat CpG ini berbeza-beza antara tiga set data daripada populasi keturunan Eropah, tetapi secara konsisten lebih tinggi daripada min kebolehwarisan merentas semua CpG yang dinilai dalam setiap tiga kajian: 0.34 (causal eGFR CpGs) berbanding 0.16 (tatasusunan HM450K) berdasarkan Hannon et al.25, 0.55 vs. 0.19 untuk Dongen et al.26, dan 0.51 vs. 0.19 untuk McRae et al.27. Tiada persatuan kausal yang ketara telah dikenal pasti untuk mana-mana CpG yang berkaitan dengan UACR. Untuk MR terbalik, satu-satunya kesan ketara ialah eGFR pada cg23597162 (JAZF1) apabila menggunakan kaedah varians songsang utama. Walau bagaimanapun, tiada kesan ketara dikenal pasti/dicerap dalam pelbagai analisis sensitiviti MR terbalik. Analisis biarkan satu keluar tidak menunjukkan sebarang petunjuk bahawa keputusan MR mungkin didorong oleh satu SNP. Tambahan pula, tidak termasuk SNP yang dikaitkan dengan diabetes mellitus jenis 2 menjadi faktor risiko utama untukpenyakit buah pinggangtidak menghasilkan penemuan yang berbeza. Keputusan untuk semua analisis MR primer dan kepekaan ditunjukkan dalam Data Tambahan 11 dan 12 dan Rajah Tambahan 7. Analisis kepekaan menyokong penemuan utama keputusan MR ke hadapan yang ketara (FDR < 0.05,="" lihat="" kaedah)="" dengan="" anggaran="" kesan="" konsisten="" arah,="" menunjukkan="" hubungan="" sebab="" akibat="" daripada="" metilasi="" dna="" kepada="" egfr="" tetapi="" bukan="">

Pengikatan faktor transkripsi, tanda histon dan analisis pengayaan laluan. Kami melakukan analisis tapak pengikatan faktor transkripsi, tanda histon dan analisis pengayaan laluan berdasarkan 967 CpG yang menunjukkan perkaitan yang tidak senonoh dengan eGFR (Pvalue <1e−05; data="" tambahan="" 6)="" dan="" 270="" cpgs="" yang="" menunjukkan="" persatuan="" sugestif="" dengan="" uacr="" (p-value="">< 1e−5;="" data="" tambahan="" 7)="" dalam="" meta-analisis="" untuk="" memaksimumkan="" kuasa="" statistik="" analisis="" pengayaan="" (lihat="" kaedah)="" 14="" pertama,="" kami="" menilai="" sama="" ada="" cpg="" berkaitan="" egfr="" lebih="" disukai="" dipetakan="" ke="" tapak="" mengikat="" 169="" faktor="" transkripsi="" (tf)="" berdasarkan="" kromatin="" data="" penjujukan="" dna="" immunoprecipitation="" (chip-seq)="" daripada="" projek="" encode="" yang="" diagregatkan="" oleh="" panggilan="" konsensus="" merentas="" 91="" jenis="" sel="" manusia="" (161="" trek="" tf)="" dan="" ditambah="" dengan="">buah pinggangtrek berasaskan tisu (lihat Kaedah). Selepas pembetulan ujian berbilang untuk 169 TF, lapan TF menunjukkan pengayaan yang ketara untuk CpG berkaitan eGFR (FDR < 0.05;="" rajah="" 4a,="" data="" tambahan="" 13),="" termasuk="" cebpb="" (nilai-p="1." 75e−06,="" trek="" silang="" tisu)="" dan="" ep300="" (nilai-p="7.49E−09," trek="" silang="" tisu).="" ini="" konsisten="" dengan="" dapatan="" daripada="" chu="" et="" al.14="" dalam="" subset="" yang="" lebih="" kecil="" iaitu="" 4859="" peserta="" daripada="" 33,605="" peserta="" yang="" dianalisis="" di="" sini.="" cpg="" yang="" berkaitan="" dengan="" uacr="" telah="" diperkaya="" dalam="" tapak="" pengikatan="" 56="" tf="" (rajah="" 4b,="" data="" tambahan="" 14)="" dengan="" perkaitan="" terkuat="" untuk="" polr2a="" (nilai="" p="6.93E−19)," fos="" (nilai="" p="" {{32="" }}.28e−12)="" dan="" ep300="" (nilai-p="">

buah pinggangCpG yang berkaitan dengan fungsi diperkaya secara meluas untuk beberapa tanda histon, dengan 82 daripada 195 kombinasi jenis sel tanda histon yang ketara (FDR q < 0.05)="" untuk="" egfr="" (rajah="" 4c,="" data="" tambahan="" 15)="" dan="" 79="" daripada="" 195="" untuk="" uacr="" (rajah="" 4d,="" data="" tambahan="" 16).="" pengubahsuaian="" histon="" h3k4me1,="" tanda="" yang="" tertumpu="" pada="" penambah="" aktif="" dan="" prima,="" telah="" diperkaya="" untuk="" semua="" jenis="" sel="" untuk="" cpg="" berkaitan="" uacr,="" dan="" hampir="" semua="" jenis="" sel="" untuk="" cpg="" berkaitan="" egfr.="" manakala="" cpg="" berkaitan="" uacr="" menunjukkan="" pengayaan="" untuk="" tanda="" promoter="" h3k4me3="" dalam="" 34="" jenis="" sel,="" hanya="" empat="">

jenis menunjukkan pengayaan untuk tapak berkaitan eGFR. Sebaliknya, tanda berkaitan badan gen H3K36me3 menunjukkan pengayaan yang lebih luas untuk CpG berkaitan eGFR (30 jenis sel) daripada CpG berkaitan UACR (lima jenis sel). Berbanding dengan H3K3me1/3 dan H3K36me3, yang semuanya telah dikaitkan dengan gen aktif (penambah, promoter aktif, transkripsi aktif), H3K9me3 dan H3K27me3, yang umumnya dikaitkan dengan heterochromatin28-31 konstitutif dan fakultatif, tidak diperkaya dengan ketara untuk UACR- CpG yang berkaitan dalam mana-mana jenis sel yang diuji (Rajah 4D, Data Tambahan 16). Pengayaan gen yang terlibat olehfungsi buah pinggangCpG yang berkaitan telah dinilai dalam Gene Ontology (GO), Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG) dan pangkalan data Reactome (lihat Kaedah)32–35. Pengayaan yang ketara diperhatikan untuk 27 istilah (25 GO, satu KEGG, satu Reactome; Data Tambahan 17, Rajah 5A) untuk eGFR, dan 91 istilah (87 GO, empat Reactome; Data Tambahan 18, Rajah 5B) untuk UACR (Rajah 5B) 5B). Laluan yang berkaitan dengan penghijrahan khusus jenis sel darah putih, terjemahan mRNA, hemostasis dan pembekuan, serta tindak balas insulin menunjukkan pengayaan yang ketara untuk eGFRassociated CpGs (FDR < 0.05;="" rajah="" 5a).="" laluan="" dengan="" nilai="" p="" pengayaan="" terendah="" untuk="" tapak="" berkaitan="" uacr="" didominasi="" oleh="" pengaktifan="" dan="" tindak="" balas="" sel="" imun,="" dan="" laluan="" berkaitan="" interferon="" (rajah="" 5b).="" laluan="" tambahan="" yang="" diperkaya="" termasuk="" penghijrahan="" sel="" darah="" putih,="" seperti="" untuk="" keputusan="" egfr="" (data="" tambahan="">

Kaitan dengan persatuan EWAS yang diketahui dengan ciri-ciri lain. Memandangkan pengayaan laluan berkaitan tindak balas imun yang diperhatikan, keputusan metilasi DNA termasuk CpG berhampiran gen laluan interferon, dan hakikat bahawa status metilasi DNA kebanyakannya dinilai dalam leukosit, kami menilai sama ada penemuan kami mungkin didorong oleh kesan mengelirukan tindak balas imun atau status keradangan. Oleh itu, kami melakukan carian CpG yang direplikasi dalam EWAS yang besar pada tahap protein C-reaktif (CRP) serum sensitif tinggi (CRP)36. Hanya dua CpG, yang juga dikaitkan dengan metilasi DNA dan eGFR dalamtisu buah pinggang,cg09610644 di BDH1 dan cg12644285 di CHD2, adalah antara tapak berkaitan CRP. Oleh itu, kekeliruan umum keputusan kami melalui status keradangan seperti yang dianggarkan oleh CRP nampaknya tidak mungkin.

Sesetengahfungsi buah pinggang-CpG berkaitan yang dikenal pasti dalam kajian ini dikaitkan dengan beberapa ciri lain berdasarkan EWAS yang diterbitkan. Dua puluh satu tapak eGFR dikaitkan dengan tekanan darah, penggunaan alkohol, BMI, jantina, reseptor faktor nekrosis tumor larut 2, dan/atau status merokok, dan lima tapak UACR sebelum ini dikaitkan dengan penggunaan alkohol, status merokok, BMI, pencapaian pendidikan, -glutamyl transferase, reseptor faktor nekrosis tumor larut 2, diabetes mellitus jenis 2, dan/atau beberapa metabolit serum (Jadual 2, Data Tambahan 19). Tiga daripada CpG ini (semua tapak UACR) dikaitkan dengan lebih daripada dua ciri, iaitu cg02711608 dalam SLC1A5 (dengan -glutamyl transferase, -glutamylthreonine, BMI, penggunaan alkohol), cg18181703 dalam SOCS3 (dengan diabetes mellitus jenis 2, status merokok, BMI , reseptor faktor nekrosis tumor larut 2), dan cg24859433 berhampiran IER3 (dengan status merokok, pencapaian pendidikan, 4-vinilphenol_sulfat). Tambahan Rajah 5B menunjukkan CpG, cg26099045, yang dikaitkan dengan eGFR dan fibrosis dalamtisu buah pinggangdalam analisis kami, dan juga dikaitkan dengan seks dan merokok dalam EWAS sebelumnya. Akhirnya, cg17944885 pada ZNF788 dikaitkan juga dengan eGFR dalam sampel pesakit DKD22.

Perbincangan

Dalam EWAS inifungsi buah pinggang, kami mengenal pasti dan mereplikasi tahap metilasi DNA darah sebanyak 69 CpG yang dikaitkan dengan eGFR. Daripada jumlah ini, 60 tapak sebelum ini tidak dilaporkan, begitu juga dengan kesemua tujuh CpG yang dikenal pasti berkaitan dengan UACR. Majoriti CpG berkaitan eGFR dan UACR juga dikaitkan dengan hasil klinikal mereka, iaitu CKD dan mikroalbuminuria, dan oleh itu mungkin mempunyai potensi untuk stratifikasi individu yang berisiko. Varians eGFR yang dikaitkan dengan 69 CpG ini ialah 2.4 peratus — dua kali ganda berbanding EWAS14 yang terdahulu, dan setanding dengan varians yang dijelaskan oleh 29 SNP yang ditemui oleh GWAS yang merangkumi saiz sampel tiga kali lebih tinggi untuk penemuan lokus37,38. Ini menunjukkan bahawa metilasi DNA pembezaan pada CpG individu yang dikira daripada darah menerangkan lebih banyak varians eGFR daripada SNP biasa individu pada saiz sampel yang diberikan. Untuk UACR, nampaknya saiz sampel yang lebih besar berbanding dengan eGFR diperlukan untuk mendedahkan bilangan CpG yang berkaitan dengan sifat yang serupa. Memandangkan albumin dan kreatinin untuk pengiraan UACR diukur dalam air kencing berbanding dengan kuantifikasi kreatinin daripada serum untuk anggaran GFR, perbezaan ini tidak dijangka, dan ia adalah selaras dengan pemerhatian daripada GWAS sifat-sifat ini10,13. Tambahan pula, variasi genetik nampaknya mempengaruhifungsi buah pinggangciri melalui laluan yang berbeza daripada perubahan dalam metilasi DNA. Ini disokong oleh pertindihan rendah antara tapak EWAS dan GWAS yang direplikasi untuk kedua-dua eGFR dan UACR.

Meta-analisis EWAS ini termasuk sampel populasi dan etnik yang berbeza. Kami memerhatikan korelasi yang tinggi bagi anggaran kesan yang diperoleh daripada subsampel besar individu EA dengan kesan yang dianggarkan dalam individu AA (Rajah 2). Walaupun terdapat kemasukan data daripada sebilangan besar individu yang bukan keturunan EA, keputusan keseluruhan EWAS trans-etnik mungkin didorong oleh data daripada individu keturunan EA, yang mewakili 70 peratus (eGFR) / 65 peratus (UACR) kajian kami (Data Tambahan 3 dan 4). Untuk menangani batasan ini, analisis masa depan dengan perkadaran sampel bukan EA yang meningkat diperlukan untuk penilaian yang boleh dipercayai dan terperinci antara heterogeniti keturunan. Potensi untuk menterjemah pandangan daripada EWAS sifat kuantitatif dalam kebanyakan kajian berasaskan populasi kepada orang yang menghidap penyakit ini digambarkan oleh fakta bahawa anggaran kesan pada 65 daripada 69 CpG berkaitan eGFR diperhatikan dalam arah yang sama dalam kohort 551 pesakit CKD, menunjuk ke arah mekanisme yang boleh digunakan merentasi julat luas tahap eGFR (Rajah 3). Lebih-lebih lagi,

cg07242931 dalam MAN1C1 dan cg18194850 dalam SUCLG2 bukan sahaja dikaitkan dengan eGFR, tetapi meramalkan masa untukkegagalan buah pinggangatau akutkecederaan buah pinggang(Data Tambahan 8). Bukti lanjut untuk penglibatan SUCLG2, yang menyandikan subunit succinyl-CoA synthetase, dalam penyakit buah pinggang telah dicadangkan oleh GWAS pada pesakit diabetes.penyakit buah pinggangdalam orang India Amerika (SNP=rs4453858, nilai-P=2E−6)39. Variasi genetik dalam gen ini juga dikaitkan dengan paras kencing suksinil-karnitin (C4DC, SNP=rs115560420, P-value=7E−15)40. C4DC ialah produk metabolik daripada kitaran asid trikarboksilik, yang dimangkinkan di bawah penglibatan succinyl-CoA synthetase, dan paras C4DC yang lebih tinggi dalam darah yang dikaitkan dengan eGFR41 yang lebih rendah. Walau bagaimanapun, carian dalam keputusan loci sifat kuantitatif metilasi (meQTL) GoDMC (//www.godmc.org.uk)42 tidak mendedahkan perkaitan penting kedua-dua SNP ini dengan cg18194850, menunjukkan tiada hubungan langsung antara SNP ini dan tapak CpG.

Oleh kerana metilasi DNA ialah pengawal selia utama ekspresi gen, kami menilai korelasi tapak metilasi DNA yang berkaitan dengan sifat dengan tahap mRNA gen dalam cis. Gen yang tahap mRNAnya berkorelasi dengan ketara denganfungsi buah pinggangtapak metilasi DNA yang berkaitan adalah berkaitan dengan laluan interferon (kedua-duanya untuk eGFR dan UACR). Walaupun penemuan ini bersetuju dengan keputusan pengayaan laluan untuk UACR (Rajah 5B, Data Tambahan 18), bilangan korelasi yang ketara antara CpG Berkaitan UACR dan tahap transkrip adalah agak rendah. Ini tidak menghairankan memandangkan saiz sampel yang agak kecil bagi 1915 individu yang tersedia untuk analisis ini dan liputan terhad sumber transkriptomi. Menariknya, antara penemuan penting untuk UACR, dua CpG pada keluarga pembawa zat terlarut 1 ahli 5 (SLC1A5) dikaitkan dengan ekspresi gen pembezaan dan juga dengan tekanan darah. Metilasi DNA pada SLC1A5, yang mengodkan pengangkut asid amino neutral yang bergantung kepada natrium, boleh menjadi elemen tambahan yang menyumbang kepada korelasi yang diketahui antara UACR dan tekanan darah.

Transkrip yang dinyatakan secara signifikan tidak selalu dikodkan oleh gen terdekat (cg17944885 berhampiran ZNF788), atau tapak CpG dikaitkan dengan pelbagai gen dalam cis (cg04864179 pada IRF5). Khususnya, korelasi metilasi DNA pada cg04864179 dengan tahap transkrip IRF5 adalah ketara. Memandangkan keputusan MR yang ketara bagi CpG ini dengan eGFR, metilasi DNA pada IRF5 mungkin mempengaruhi eGFR yang dimediasi oleh ekspresi gennya. Mengambil kira transformasi sifat persatuan genetik yang mendasari (lihat Kaedah), kami mendapati bahawa peningkatan dalam metilasi DNA sepuluh sisihan piawai menghasilkan 3.2 peratus lebih tinggi eGFR. Walaupun kesan anggaran ini sangat kecil, pengaruh kausal corak metilasi dalam sel darah pada CKD juga disokong oleh MR berasaskan ringkasan dengan dataset meQTL yang berbeza dalam kajian baru-baru ini, di mana kesan sebab akibat adalah konsisten secara arah dengan keputusan kami22. Dengan menggunakan kolokalisasi berbilang sifat, mereka juga menunjukkan bahawa kesan genetik lokus ini pada eGFR telah dimediasi oleh metilasi IRF5 dan ekspresi gen dalam darah. Tambahan pula, kolokalisasi ekspresi gen IRF5 dengan eGFR ditunjukkan dalam kedua-dua petak tiub dan glomerularbuah pinggangtisu43. Apabila mentafsir kesan kausal yang diperhatikan dalam kajian kami, perlu diingat bahawa analisis MR untuk CpG cg04864179 menunjukkan heterogeniti yang ketara (p <0.05) di="" kalangan="" instrumen="" (data="" tambahan="" 11="" dan="" rajah="" tambahan="" 7.="">

IRF5 mengekod ahli keluarga faktor pengawalseliaan interferon (IRF). Kumpulan ahli keluarga IRF mengandungi faktor transkripsi dengan peranan yang berbeza, seperti modulasi aktiviti sistem imun, pertumbuhan dan pembezaan, serta kawalan ekspresi gen untuk tindak balas interferon terhadap jangkitan virus. IRF5 boleh mempengaruhi tindak balas sel imun. Pelbagai kajian menyokong bahawa perubahan dalam metilasi IRF5 mungkin menjejaskanfungsi buah pinggangmelalui laluan imun: SNP dalam IRF5 dikaitkan dengan SLE melalui perubahan dalam ekspresi IRF5 dalam monosit darah44–46. SLE ialah penyakit autoimun yang dicirikan oleh pengaktifan laluan IFN yang boleh menjejaskanbuah pinggangsebagai lupus nefritis47. Perencatan hiperaktivasi IRF5 dalam model tetikus SLE yang dilindungi daripada serangan dan keterukan lupus nefritis, dan dipertingkatkanfungsi buah pinggangdan patologi48,49. Walaupun EWAS kami tidak menumpukan pada kajian pesakit SLE, kesan kecil metilasi IRF5 pada hasil yang berkaitan dengan buah pinggang, yang dimediasi sekurang-kurangnya sebahagiannya oleh ekspresinya dan laluan IFN berikutnya, mungkin dikesan sebagai kesan ke atas eGFR dalam populasi umum.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG

Beberapa CpG yang berkaitan dengan eGFR yang mana metilasi DNA dikira daripada sel darah juga dikaitkan dengan eGFR danbuah pinggangfibrosis apabila metilasi DNA dikira daripadabuah pinggangtisu, walaupun saiz sampel adalah jauh lebih kecil berbanding dengan dataset EWAS. Ini menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya beberapa penemuan yang diperoleh daripada darah boleh diterjemahkan kepada tisu sasaran khusus ciri tambahan. Di sini, darah danbuah pinggangadalah dua tisu sasaran khusus ciri utama, sejakfungsidaripadabuah pinggangialah penapisan darah untuk membuang bahan buangan. Analisis pengayaan bagifungsi buah pinggangCpG yang berkaitan menunjukkan peranan penting dalam peraturan transkrip. Kami mendapati pengayaan meluas bagi H3K4me1/3 dan H3K36me3. H3K4me1/ 3 dikaitkan dengan penambah prima dan aktif serta promoter aktif dan H3K36me3 berkait rapat dengan kawasan transkripsi genom50. Peranan peraturan transkrip disokong lagi oleh isyarat pengayaan faktor transkripsi terkuat CpGs yang berkaitan dengan UACR, iaitu POLR2A, subunit terbesar enzim utama yang mensintesis mRNA dalam eukariota.

Had potensi yang berkaitan dengan analisis MR termasuk instrumen yang sah tidak tersedia untuk semua CpG untuk MR hadapan. Memandangkan semua instrumen CpG dipilih daripada kawasan cis, iaitu rantau genetik yang sama, kemungkinan semua instrumen CpG adalah sama ada sah atau tidak sah, dengan itu mengehadkan bilangan kaedah MR berbeza yang boleh digunakan untuk menguji keteguhan keputusan51. MR terbalik adalah terhad dalam kuasa kerana saiz sampel kecil yang tersedia untuk anggaran persatuan metilasi SNP-DNA. Kajian meQTL yang lebih besar seperti GoDMC tidak dapat menyimpan hasil perkaitan untuk semua SNP (iaitu, di atas pemotongan nilai P perkaitan tertentu) kerana sebab teknikal, dan oleh itu tidak boleh digunakan untuk MR terbalik dua sampel. Oleh itu, penemuan yang tidak penting mesti ditafsirkan dengan berhati-hati. Di samping itu, tafsiran saiz kesan kausal adalah sukar, kerana persatuan genetik yang mendasari dikira pada skala sisihan piawai tahap metilasi DNA. Satu lagi had potensi kajian ialah eGFR, CKD, dan UACR adalah fenotip yang dianggarkan daripada parameter asas yang berbeza dan mempunyai pengaruh pelbagai faktor. Oleh itu, kami melakukan beberapa analisis untuk memastikan bahawa keputusan EWAS kami tidak didorong oleh pengacau yang diketahui, termasuk diabetes jenis 2, potensi pengacau hubungan antara DNAm danfungsi buah pinggang. Pertama, persatuan EWAS dalam setiap kohort telah diselaraskan untuk pengacau untuk menghapuskan kesannya dalam kohort. Kedua, EWAS dilakukan dalam setiap kohort secara berasingan dan kemudian meta-analisis, yang sepadan dengan pelarasan contohnya, untuk kelaziman diabetes merentas kohort. Akhirnya, kami menyemak persatuan CpG kami yang direplikasi dalam kajian EWAS diabetes yang diterbitkan. Daripada semua persatuan CpG kami yang direplikasi, hanya CpG yang berkaitan dengan UACR cg18181703 di SOCS3 menunjukkan kaitan dengan diabetes jenis 2. CpG ini juga dikaitkan dengan status merokok, BMI, dan paras darah reseptor faktor nekrosis tumor larut 2. Dengan mengambil kira bahawa EWAS kami juga telah diselaraskan untuk status merokok dan BMI, kami menganggap kesan cg18181703 pada UACR adalah pada sekurang-kurangnya separa bebas daripada diabetes jenis 2, BMI dan keadaan merokok. Walaupun kami mengawal beberapa faktor yang diketahui ini, faktor lain seperti kovariat yang tidak diukur tidak dapat dilaraskan secara eksplisit dalam analisis dan mungkin mempengaruhi penemuan.

Kajian EWAS selanjutnya dengan peningkatan saiz sampel dan dengan metilasi DNA yang dikira daripada tisu tambahan serta analisis fungsian diperlukan untuk meluaskan pengetahuan kami tentang mekanisme pengawalseliaanfungsi buah pinggang, dan akhirnya meningkatkan ramalan dan rawatanbuah pinggangpenyakit. Ini berlaku khusus untuk UACR, memandangkan bilangan persatuan CpG penting yang diperhatikan lebih rendah. Ringkasnya, meta-analisis EWAS berskala besar ini meluaskan bilangan CpG yang dikaitkan dengan eGFR dan CKD dan mendedahkan tujuh persatuan untuk UACR dan mikroalbuminuria. Metilasi DNA di tapak ini menjelaskan sebahagian besar varians eGFR, dan metilasi pembezaan pada empat CpG menunjukkan bukti untuk hubungan sebab akibat yang berpotensi kepada eGFR. Pencirian komprehensif CpG yang direplikasi di kalangan pesakit dengan CKD, dalamtisu buah pinggang,untuk ekspresi gen pembezaan, dan untuk laluan diperkaya dan tanda epigenetik memberikan pandangan tentangfungsi buah pinggang-peraturan transkrip yang berkaitan.

Kaedah

Gambaran keseluruhan.Kami menyediakan meta-analisis kolaboratif berdasarkan model data pengedaran dan prosedur kawalan kualiti. Untuk memaksimumkan penyeragaman fenotip merentas kajian, pelan analisis dan skrip baris arahan (https://github.com/ generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) telah dicipta dan disediakan kepada semua kajian yang mengambil bahagian ( kebanyakannya kajian berasaskan populasi; Data Tambahan 1 dan 2). Fail ringkasan yang dijana secara automatik telah disemak secara berpusat. Selepas kelulusan fenotaip, kajian menjalankan EWAS mereka dan memuat naik hasil serta maklumat metilasi DNA agregat ke pelayan pusat. Kawalan kualiti EWAS dilakukan dengan skrip tersuai untuk menilai inflasi, kawalan positif, pengedaran probe CpG dan membandingkan merentas kajian keseluruhan pengagihan saiz kesan, ralat standard dan nilai P. Semua protokol kajian telah diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan masing-masing. Semua peserta dalam semua kajian memberikan persetujuan termaklum bertulis.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL

Definisi fenotip.Nilai kreatinin yang diperoleh dengan ujian Jaffé sebelum 2009 telah ditentukur dengan mendarab dengan 0.9552. Kajian menganggarkan GFR dengan KronikPenyakit buah pinggangPersamaan Kerjasama Epidemiologi (CKD-EPI)53. eGFR telah diwinsorikan pada 15 dan 2{16}}0 ml min−1 setiap 1.73 m2. CKD ditakrifkan sebagai eGFR di bawah 60 ml min−1 setiap 1.73 m2. Nilai UACR yang diukur dalam mg/g telah diubah log semula jadi sebelum semua analisis. Mikroalbuminuria ditakrifkan sebagai 1 untuk UACR > 30 mg/g dan sebagai 0 untuk nilai UACR < 10="">

Kuantifikasi metilasi DNA dan kawalan kualiti.Untuk kuantifikasi metilasi DNA, DNA genom telah diekstrak daripada darah periferi. Tahap metilasi DNA dikira menggunakan tatasusunan Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC), tatasusunan Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) atau tatasusunan Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). Prapemprosesan data metilasi DNA dilakukan mengikut protokol kajian individu termasuk pembetulan latar belakang, normalisasi kuantil, penapisan probe, penapisan sampel, pemadanan SNP ke lokasi probe kawalan SNP, penapisan outlier dan pembetulan jenis ujian (Data Tambahan 3). Tahap metilasi di setiap tapak diwakili dan dianalisis sebagai -nilai. Kuar CpG yang bertindih dengan SNP telah dijelaskan. Setiap kajian mengira min dan sisihan piawai bagi setiap tapak CpG dan statistik ringkasan ini dibandingkan antara kajian untuk perbezaan sistematik merentas CpG dan disusuli dengan penganalisis kajian individu

Penilaian kovariat.Metilasi DNA dan kovariat diukur pada titik lawatan/masa yang sama. Diabetes lazim ditakrifkan sebagai glukosa plasma berpuasa Lebih daripada atau sama dengan 126 mg/dl, glukosa plasma tidak berpuasa Lebih daripada atau sama dengan 200 mg/dl, rawatan untuk diabetes, atau laporan sendiri diagnosis diabetes. Hipertensi lazim ditakrifkan sebagai tekanan darah sistolik Lebih daripada atau sama dengan 140 mm Hg, tekanan darah diastolik Lebih daripada atau sama dengan 90 mm Hg, atau rawatan untuk hipertensi. Jika tekanan darah yang diukur tidak tersedia, hipertensi ditakrifkan dengan melaporkan diri. Status merokok semasa ditakrifkan menggunakan maklumat yang dilaporkan sendiri. BMI (kg/m2) dikira menggunakan ukuran berat dan ketinggian seperti yang dinilai dalam setiap kajian. Umur dimasukkan sebagai nilai berterusan dalam model persatuan. Struktur populasi dalam kajian bukan keluarga telah diselaraskan oleh komponen utama genetik (PC). Perkadaran jenis sel darah putih dianggarkan berdasarkan metilasi DNA54. Kovariat teknikal tambahan termasuk PC probe kawalan55, pusat kajian, kelompok pemprosesan, ID sentrix tatasusunan dan kedudukan sentrix.

Kaedah statistik dan meta-analisis. Untuk memastikan kuasa setanding antara tapak yang dianalisis hanya CpG autosomal yang diukur oleh kedua-duanya, EPIC dan HM450K, dimasukkan dalam analisis. Setiap kajian melakukan analisis regresi linear yang dipisahkan oleh kumpulan keturunan. Untuk menilai keteguhan keputusan EWAS, analisis adalah terhad kepada kajian dan subsampel individu keturunan Eropah. Metilasi DNA -nilai telah dimodelkan sebagai pembolehubah bersandar dengan sifat sama ada nilai eGFR atau UACR berterusan atau pembolehubah CKD perduaan atau mikroalbuminuria: Metilasi DNA ~ sifat campur jantina ditambah umur ditambah PC genetik ditambah perkadaran sel darah putih ditambah kovariat teknikal serta diabetes ditambah hipertensi ditambah BMI ditambah merokok semasa Peserta memerlukan maklumat lengkap untuk semua pembolehubah dan statistik ringkasan kajian dan dimasukkan hanya jika sekurang-kurangnya 50 peserta untuk eGFR/UACR dan 50 kes/kawalan untuk CKD/microalbuminuria tersedia, masing-masing. Setiap EWAS khusus kajian telah diselaraskan untuk inflasi sebelum analisis meta oleh pendekatan BACON jika anggaran inflasi adalah lebih besar atau sama dengan satu (Tambahan Rajah 8)56. Kajian dibahagikan kepada penemuan dan replikasi mengikut susunan kronologi sumbangan kepada meta-analisis Konsortium CKDGen (Data Tambahan 1 dan 2). Meta-analisis berwajaran songsang-varians kesan tetap seperti yang dilaksanakan dalam pakej R 'metafor' (versi 2.1-0) telah dilakukan untuk kajian penemuan, kajian replikasi dan untuk anggaran kesan penemuan dan replikasi yang terhasil. CpGs dikecualikan jika kurang daripada separuh saiz sampel masing-masing tersedia dalam sama ada penemuan atau replikasi atau jika anggaran heterogen I2 lebih besar 95 peratus. Replikasi yang berjaya bagi CpG yang berkaitan ditakrifkan sebagai arah konsisten anggaran kesan antara penemuan (cakera neGFR=22,347, cakera nUACR=11,458) dan replikasi (repl neGFR=11,258 , nUACR repl=3610) meta-analisis, kepentingan terlaras Bonferroni bagi nilai-P penemuan (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Analisis ekspresi gen.Kesan daripadafungsi buah pinggangCpG yang berkaitan dengan sifat telah diuji untuk perkaitan dengan ekspresi gen dalam darah menggunakan dua set data: (1) tahap mRNA monosit daripada 1202 peserta kajian MESA dan (2) mRNA darah keseluruhan daripada 713 individu daripada Kajian KORA F4 57,58. Sebagai langkah awal, carian tahap metilasi CpG dengan tahap mRNA yang tersedia dalam hasil persatuan daripada kajian MESA telah dilakukan. Untuk carian ini, hasil perkaitan dengan nilai P < 1e{{10}}="" telah="" tersedia.="" analisis="" telah="" diterangkan="" secara="" terperinci="" dalam="" kennedy="" et="" al.59.="" secara="" ringkas,="" ekspresi="" gen="" dinilai="" menggunakan="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" dan="" v4.0="" expression="" beadchips,="" dan="" metilasi="" dna="" oleh="" tatasusunan="" illumina="" hm450k.="" nilai="" ungkapan="" telah="" dinormalisasi="" menggunakan="" penjelmaan="" penstabilan="" varians.="" 13,933="" transkrip="" daripada="" tatasusunan="" v3.0="" dan="" v4.0,="" yang="" dinyatakan="" dengan="" ketara="" di="" atas="" tahap="" latar="" belakang="" (pengesanan="" p-nilai=""><0.01) dalam="" sekurang-kurangnya="" 5="" peratus="" subjek.="" analisis="" persatuan="" dalam="" mesa="" dilakukan="" sebagai="" model="" campuran="" linear="" menggunakan="" nilai="" ekspresi="" gen="" yang="" diubah="" log="" sebagai="" pembolehubah="" bersandar,="" nilai="" beta="" metilasi="" dna="" sebagai="" pembolehubah="" bebas="" dengan="" umur,="" jantina,="" etnik="" dan="" pusat="" kajian="" ditambah="" sebagai="" kovariat="" ke="" dalam="" model.="" ujian="" persatuan="" kedua="" dilakukan="" dalam="" dataset="" kora="" f4.="" perkaitan="" tahap="" metilasi="" pada="" cpg="" yang="" direplikasi="" dengan="" tahap="" ekspresi="" gen="" gen="" dalam="" lingkungan="" ±500="" kb="" telah="" dikira="" menggunakan="" log2-paras="" mrna="" diubah="" yang="" diperoleh="" daripada="" tatasusunan="" ekspresi="" gen="" illumina="" human="" ht-12v3.="" nilai="" ekspresi="" gen="" telah="" diregres="" pada="" nilai="" beta="" metilasi="" dna="" yang="" diselaraskan="" untuk="" jantina="" dan="" umur.="" sebelum="" analisis="" faktor="" teknikal,="" serta="" perkadaran="" jenis="" sel="" darah,="" telah="" ditarik="" balik="" daripada="" tahap="" mrna="" dan="" metilasi="" dna,="" dan="" sisanya="" dimasukkan="" ke="" dalam="" model="" persatuan="" akhir.="" pemeriksaan="" anotasi="" dan="" kawalan="" kualiti="" probe="" ekspresi="" gen="" adalah="" berdasarkan="" jadual="" yang="" disediakan="" dalam="" schurmann="" et="" al.60.="" persatuan="" ekspresi="" gen="" cpg="" dalam="" darah="" yang="" tersedia="" dalam="" keputusan="" mesa="" dan="" mempunyai="" nilai="" p=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metilasi DNA dalam tisu buah pinggang.Analisis menggunakan metilasi DNA dalamtisu buah pinggangdengan eGFR dan fibrosis dilakukan menggunakan data daripada 506 microdissectedtisu buah pinggangsampel menggunakan Illumina EPIC BeadChip. Sampel tisu buah pinggang dikumpulkan secara berasingan, dan berbeza daripada sampel darah yang dianalisis dalam meta-analisis EWAS. Sampel-sampel ini dikumpul daripada bahagian nephrectomies tumor yang tidak terjejas dan disediakan seperti yang diterangkan sebelum 61. Secara ringkasnya, perisian SeSAMe62 digunakan untuk melaksanakan prapemprosesan dan kawalan kualiti termasuk pengesanan berasaskan intensiti rendah, pembetulan bleed-through dalam penolakan latar belakang, pembetulan bias pewarna tak linear, kawalan untuk penukaran bisulfit, pengiraan nilai beta, dan anggaran pecahan leukosit. Nilai beta CpG yang dikaitkan dengan eGFR dan UACR dan maklumat klinikal telah diekstrak untuk analisis persatuan. Model regresi digunakan untuk menguji persatuan beta metilasi DNA CpG akhir sebagai pembolehubah bersandar dengan tahap eGFR dan fibrosis, masing-masing, sebagai pembolehubah bebas diselaraskan untuk jantina, umur, PC genetik (1-5), status diabetes, status hipertensi. , BMI, ID sentrix tatasusunan, kedudukan sentrix, dan kawalan penukaran bisulfit dan anggaran pecahan leukosit.

Penyiasatan sasaran probe eGFR dalam pesakit CKD. Perkaitan 69 CpG yang dikaitkan dan disahkan eGFR daripada populasi umum dengan eGFR dalam Kronik JermanPenyakit buah pinggang (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g−1). Susulan pesakit untuk titik akhir klinikal masih berterusan. Titik akhir kajian direkodkan secara berterusan dalam cara piawai berdasarkan surat keluar hospital dan sijil kematian dan termasuk peristiwa berkaitan buah pinggang serta kematian. Reka bentuk kajian dan populasi kajian yang diambil diterangkan dengan lebih terperinci dalam penerbitan terdahulu63,64. Kajian GCKD telah diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan dan didaftarkan dalam pendaftaran kebangsaan untuk kajian klinikal (DRKS 00003971). Subset daripada 559 pesakit dengan CKD dikaitkan dengan lupus eritematosus sistemik, nefropati membran, glomerulosklerosis segmental fokus atau polikistik dominan autosomalpenyakit buah pinggangtelah dipilih untuk kuantifikasi metilasi DNA dan diukur menggunakan tatasusunan Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). Perkaitan dengan eGFR dinilai secara analog kepada analisis utama (lihat Kaedah statistik dan meta-analisis), selain daripada pelarasan untuk merokok yang dikodkan 0/1/2 untuk perokok tidak pernah/bekas/semasa. Untuk menilai perkaitan metilasi DNA dengan masa untukkegagalan buah pinggangdaripada kemasukan kajian, model regresi Cox telah dipasang untuk setiap CpG, dan secara analog untuk titik akhir gabungankegagalan buah pinggangdan akutkecederaan buah pinggang.Selain peramal metilasi DNA, model telah diselaraskan untuk umur, jantina, dan subjenis CKD. Model regresi Cox menyediakan anggaran untuk nisbah bahaya (HR) khusus sebab dengan kehadiran peristiwa yang bersaing, iaitu, sebarang kematian lain kecuali kematian berkaitan buah pinggang. Analisis bahaya subagihan juga telah dijalankan untuk menilai potensi kesan tidak langsung melalui acara yang dipertandingkan. Andaian bahaya berkadar dinilai berdasarkan sisa Schoenfeld berskala. Penilaian grafik untuk dua CpG yang berkaitan tidak mendedahkan bukti pelanggaran utama (Tambahan Rajah 9).

Plot dan anotasi persatuan wilayah. Plot untuk Rajah Tambahan 5 telah dicipta menggunakan pakej 'Gviz' 65 dan 'rtracklayer' 66 R. Maksimum 40 tapak dalam 50,000 bp hulu atau hiliran tapak CpG yang diminati telah disertakan dalam plot. Jika selang itu mengandungi lebih daripada 40 tapak, kawasan yang diplot dikurangkan kepada jarak tapak terjauh ditambah 10,000 bp. Bahagian Gen RefSeq adalah berdasarkan trek UCSC NCBI RefSeq dengan simbol gen daripada pakej R 'org.Hs.eg.db', bahagian CpG Islands adalah berdasarkan trek UCSC CpG Islands, bahagian Roadmap chromHMM adalah berdasarkan Peta jalan 15- menyatakan model chromHMM janinbuah pinggangepigenome (ID Epigenome Peta Jalan: E086)67 dan bahagian Common SNPs adalah berdasarkan UCSC Common SNPs(151) track68. Akhir sekali, plot korelasi CpG di bahagian bawah rajah adalah berdasarkan data sampel metilasi DNA kajian KORA F4 menggunakan tatasusunan Illumina HumanMethylation450 BeadChip, dengan tapak yang hilang berwarna kelabu muda.

Varians dijelaskan oleh metilasi DNA.Peratusan varians fenotip yang dijelaskan oleh 69 CpG replikasi yang dikaitkan dengan eGFR dianggarkan menggunakan data 1,888 peserta daripada kajian KORA FF4, susulan tujuh tahun kajian KORA F457,58. KORA FF4 bukan sebahagian daripada meta-analisis EWAS. Walau bagaimanapun, 988 individu termasuk dalam analisis varians yang dijelaskan bertindih dengan peserta KORA F4 EWAS. Dalam set data ini, varians yang dijelaskan oleh semua CpG secara bebas daripada kovariat dianggarkan sebagai perbezaan dalam R2 model asas termasuk CpG dan yang tanpa. Model asas ditakrifkan sebagaibuah pinggangsifat ~ jantina tambah umur ditambah perkadaran sel darah putih ditambah kencing manis ditambah hipertensi ditambah BMI serta merokok semasa denganbuah pinggangsifat yang mewakili eGFR dan UACR. Untuk dua CpG berkaitan eGFR (cg06008406, cg20004659), tiada data tersedia dalam dataset KORA FF4.

Analisis rawak Mendelian dua arah.Dalam MR hadapan, menggunakan pakej 'TwoSampleMR' R69, kami menyiasat potensi kesan penyebab metilasi DNA pada CpG yang direplikasi pada eGFR dan UACR. MR menggunakan instrumen genetik untuk meminimumkan berat sebelah disebabkan oleh penyebab yang mengelirukan dan terbalik70. Instrumen genetik untuk metilasi DNA (meQTL) masing-masing tersedia untuk 47 dan lima CpG untuk eGFR dan UACR, seperti yang dikenal pasti sebelum ini oleh GoDMC dalam sehingga 27,750 individu42. Data GWAS ringkasan keturunan Eropah pada eGFR10 dan UACR13 digunakan sebagai data hasil masing-masing. Penapis digunakan untuk kemasukan meQTL (pSNP <1e−5 dengan="" metilasi="" dna="" dalam="" rantau="" cis="" ±="" 500kb,="" ketidakseimbangan="" hubungan="" r2=""><0.2 dalam="" rantau="" 1mb,="" penapisan="" steiger,="" maf=""> 0.05). Kami melakukan MR berwajaran songsang serta analisis sensitiviti MR (mod mudah, mod berwajaran, median berwajaran dan MR Egger), atau triangulasi dengan menganggar nisbah Wald sekiranya hanya satu instrumen bagi setiap tapak CpG tersedia71–73. Anggaran kesan yang diperoleh daripada MR bergantung pada unit set data asas, dan dalam kes ini sepadan dengan perubahan per unit dalam satu sisihan piawai tahap metilasi pada eGFR yang diubah log semula jadi, dan sisihan piawai UACR yang diubah log semula jadi, masing-masing. Dalam MR terbalik, kami mengkaji potensi kesan sebab akibatfungsi buah pinggangciri-ciri pada metilasi DNA, menggunakan SNP penting seluruh genom daripada GWAS trans-etnik pada eGFR10 dan UACR13 sebagai instrumen genetik untuk eGFR dan UACR, masing-masing. Untuk memaksimumkan kuasa pada data hasil, kami melakukan analisis meta skor z bagi persatuan SNP-CpG daripada kajian KORA F4 (n=1662) ​​dan FHS (n=3868). Anggaran kesan gabungan dan ralat piawai mereka meQTL termasuk dalam MR dianggarkan daripada saiz sampel, kekerapan alel dan z-skor74. Penapis digunakan untuk kemasukan SNP (nilai P <5e−8>buah pinggangsifat, nilai P sebelah satu < 0.05="" dengan="" nitrogen="" urea="" darah="" untuk="" instrumen="" egfr,="" nilai="" p="" heterogeniti="" keturunan="" lebih="" besar="" daripada="" atau="" sama="" dengan="" 0.0="" 1,="" penapisan="" steiger,="" maf=""> 0.05). Kami melakukan MR berwajaran varians songsang dengan kesan rawak berganda (kerana bilangan instrumen yang cukup tinggi dari lokus berbeza tersedia bagi setiap sifat)51 dan analisis sensitiviti MR (mod mudah, mod berwajaran, median berwajaran, dan MR Egger)71-73. Sebagai analisis sensitiviti tambahan yang menangani varian pleiotropik, kami mengecualikan dalam jumlah 35 instrumen yang dikaitkan dengan diabetes mellitus jenis 2 dalam GWAS75 baru-baru ini termasuk 898, 130 individu: sebelas SNP yang mempunyai hubungan P-nilai <5e−8 dengan="" diabetes,="" dan="" 24="" tambahan.="" instrumen="" yang="" berada="" dalam="" ketidakseimbangan="" pautan="" (r2=""> 0.2 dalam 1 Mb, panel rujukan 1000 G EUR) dengan SNP yang berkaitan dengan diabetes. Ketidakseimbangan hubungan telah dinilai melalui LDlink76. Untuk MR terbalik, anggaran kesan memberikan perubahan per unit dalam eGFR yang diubah log semula jadi, dan sisihan piawai UACR yang diubah log semula jadi, masing-masing, pada sisihan piawai tahap metilasi DNA. Pelarasan ujian berbilang nilai-P mengikut Benjamini-Hochberg FDR <0.05 telah="" digunakan="" bagi="" setiap="" sifat="" buah="" pinggang,="" dan="" untuk="" mr="" ke="" hadapan="" dan="" belakang="" secara="" berasingan77.="" heterogeniti="" p-nilai="" diperolehi="" daripada="">

Analisis pengayaan.Untuk memaklumkan potensi kesan fungsi CpG yang berkaitan, kami menilai pengayaan CpG ini di tapak DNase I atau pengubahsuaian histon (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), set gen berdasarkan istilah dan laluan GO dalam pangkalan data KEGG dan Reactome32 –35. Analisis pengayaan TFBS telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini secara terperinci14. Secara ringkas, ujian pengayaan dinilai menggunakan eForge78 menggunakan pilih atur dengan padanan untuk penyetempatan wilayah pulau gen dan CpG semasa pensampelan. Data diperoleh daripada sama ada projek ENCODE (125 sampel) atau Roadmap Epigenomics (299 sampel) yang dijana oleh kaedah Hotspot67,79,80. CpG yang dikaitkan dengan eGFR dan UACR, masing-masing, pada nilai P < 1e−05="" dalam="" meta-analisis="" digunakan="" sebagai="" input="" (data="" tambahan="" 6="" dan="" 7),="" dan="" 10,000="" pensampelan="" semula="" dijalankan,="" penapis="" kedekatan="" aktif="" dan="" menganggap="" fdr=""><0.05 sebagai="" penting="" (data="" tambahan="" 13="" dan="" 14).="" analisis="" pengayaan="" tanda="" histon="" dilakukan="" secara="" analog="" (data="" tambahan="" 15="" dan="" 16).="" pengayaan="" dalam="" set="" gen="" atau="" laluan="" dinilai="" menggunakan="" pakej="" metilgsa="" dan="" versi="" r="" 3.6.181.="" kaedah="" ujian="" pengayaan="" adalah="" methylglm="" yang="" melaksanakan="" pelarasan="" regresi="" logistik="" untuk="" bilangan="" probe="" setiap="" gen="" dan="" latar="" belakang="" autosomal="" yang="" bertindih="" 450k="" dan="" tatasusunan="" epic.="" set="" gen="" atau="" laluan="" dengan="" 100-500="" gen="" telah="" diuji="" (tetapan="" lalai).="" kami="" menganggap="" set="" gen="" atau="" laluan="" untuk="" diperkaya="" dengan="" ketara="" pada="" fdr=""><0.05 membetulkan="" untuk="" pelbagai="" ujian="" dalam="" setiap="" pangkalan="" data="" menggunakan="" kaedah="" benjamini="" dan="" hochberg="" (data="" tambahan="" 17="" dan="">