Pengaktifan Makrofaj Oleh Sakarida Berat Molekul Rendah Daripada Cistanche Deserticola

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

［Tidakcakap］

Untuk menyiasat kesan pengaktifan imun dan mekanisme sakarida berat molekul rendah daripadaCistanche deserticola(LMSC) pada makrofaj peritoneal tetikus, RAW264. 7 sel. RAW264. 7 sel dibahagikan kepada kumpulan kawalan normal, kumpulan kawalan positif LPS, dan kumpulan rawatan LMSC. RAW264. 7 sel telah dirawat dengan pelbagai kepekatan LMSC daripada 3. 91 hingga 62. 5 g·L － 1. Ujian merah neutral digunakan untuk mengesan aktiviti fagositik makrofaj. Pelepasan NO dikesan dengan menggunakan kit NO dan pengaktifan makrofaj tahap ekspresi protein yang berkaitan (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IκB, p-IκB, NF-κB dan p-NF-κB) telah dikesan oleh Western blot. Keputusan menunjukkan bahawa LMSC mempunyai kesan pengaktifan pada makrofaj; ia boleh meningkatkan pelepasan NO dengan ketara dalam RAW264. 7 sel dan menggalakkan ekspresi sitokin TNF- dan IL-6. Selain itu, LMSC dengan ketara meningkatkan fosforilasi IKK, IκB, Dan NF-κB p65. Tambahan pula, manitol adalah salah satu juzuk utama dalam LMSC dengan ketara meningkatkan aktiviti fagositik makrofaj. Keputusan ini menunjukkan bahawa LMSC boleh mengaktifkan makrofaj dengan mengawal selia laluan isyarat NF-κB, dan manitol mungkin merupakan salah satu komponen aktif utama dalam LMSC．

［Kata kunci］ Sakarida berat molekul rendah; Cistanche deserticola; pengaktifan imun; makrofaj; faktor keradangan; NF-κB

Cistanche deserticola YC Maialah tumbuhan yang tergolong dalam genusCistanche deserticolaYC Ma. Batangnya yang berisi boleh digunakan sebagai ubat. Ia mempunyai fungsi yang menyuburkan buah pinggang, menyuburkan pati dan darah, dan melembabkan usus. Ia dikenali sebagai "ginseng padang pasir". Komponen kimia Cistanche termasuk glikosida phenylethanoid, glikosida iridoid, gula, lignan, dan banyak jenis lain. Kajian farmakologi moden mendapati bahawa Cistanche mempunyai banyak aktiviti biologi seperti pelindung saraf, anti-tumor, pengawalan imun, anti-radang, dan antioksidan [1]. Kajian telah menunjukkan bahawa rebusan Cistanche dan polisakarida boleh meningkatkan keupayaan fagosit dan fungsi rembesan makrofaj dengan ketara [2-3]. Walau bagaimanapun, tiada laporan mengenai penyelidikan aktiviti karbohidrat rendah molekulnya. Oleh itu, kajian ini menggunakan sistem kultur in vitro RAW264. 7 makrofaj peritoneal tikus untuk meneroka aktiviti imunomodulator dan mekanisme berkaitan karbohidrat berat molekul rendah Cistanche. Penyelidikan ini boleh memberikan lebih banyak bukti eksperimen untuk pemahaman yang menyeluruhKesan imunomodulator Cistanchepada masa hadapan, untuk terus membimbing aplikasi klinikalnya.

Cistanche deserticola mempunyai banyak kesan, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Bahan

RAW264. 7 sel telah dibeli dari Pusat Sel Akademi Sains Perubatan China; serum lembu janin (FBS) dibeli daripada PAN Biotech, Jerman; antibiotik dan medium DMEM telah dibeli daripada Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolysaccharide daripada Escherichia coli O55:B5 (LPS) telah dibeli daripada Syarikat Sigma, Amerika Syarikat. Kit nitrik oksida (NO) telah dibeli dari Institut Kejuruteraan Bio Nanjing Jiancheng. Kit chemiluminescence ECL dibeli dari Thermo Fisher, Amerika Syarikat; antibodi dibeli daripada Cell Signaling Technology, Amerika Syarikat; Jumlah glikosida cistanche cistanche, gula berat molekul rendah cistanche dan polisakarida cistanche dibuat sendiri oleh kumpulan penyelidikan kami. Pecahan jisim bagi jumlah glikosida cistanche ialah 78.76 peratus . Pecahan jisim gula berat molekul rendah daripadaCistanche deserticolaialah 58. 00 peratus dan pecahan jisim bagiCistanche deserticolapolisakarida ialah 65. 24 peratus . Tanon-5200Sistem pemisahan pengimejan berbilang gel telah dibeli daripada Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Pembaca plat mikro Sunrise-Basic telah dibeli daripada syarikat TECAN.

2. Kaedah

2. 1 Kaedah merah neutral untuk mengukur aktiviti fagositik makrofaj

Ambil makrofaj peritoneal tetikus dalam fasa pertumbuhan logaritma, selepas trypsinization, kira sel, laraskan bilangan sel kepada 5 × 104 sel/mL dan inokulasi dalam 96-plat kultur sel perigi, 100 μL/telaga , pada 37 darjah Dikultur dalam keadaan 5 peratus CO2, selepas sel melekat pada dinding, buang supernatan kultur, tambah medium DMEM (10 peratus FBS ditambah 1 peratus P /S), LPS (1 mg·L － 1) dan Cistanche cistanche masing-masing Jumlah glikosida,Cistanchejumlah polisakarida, dan gula berat molekul rendah Cistanche cistanche (masing-masing 3.91 ~ 62.5 g·L -1, ditapis dengan membran penapis sebelum pentadbiran) telah dikultur. Selepas pengkulturan selama 48 jam, tambahkan 100 μL larutan garam fisiologi merah neutral 0.075 peratus kepada setiap telaga, teruskan pengkulturan selama 4 jam, aspirasikan supernatan, basuh 3 kali dengan PBS, tambah lisat sel (asid asetik glasier -etanol 1:1) 100 μL, letakkan pada suhu 4 darjah selama 2 jam, dan ukur penyerapan (A540 nm) selepas sel-sel dilisiskan.

2. 2 Pengesanan jumlah pelepasan NO dalam supernatan sel

Inokulasi RAW264. 7 sel dalam 48-plat perigi (1 × 105 sel/mL, 500 μL/telaga), aspirasikan medium kultur sel selepas pengeraman semalaman, tambah medium DMEM (10 peratus FBS tambah 1 peratus P/S), 500 μL setiap satu LPS (1 mg·L -1) dan jumlah glikosida cistanche cistanche, jumlah polisakarida dan gula dengan berat molekul rendah (masing-masing 3.91 ~ 62.5 g·L -1). Selepas 24 jam kultur induksi, supernatan dikumpulkan. Tentukan kepekatan NO dalam supernatan sel setiap kumpulan dengan kit NO, ikut arahan, dan akhirnya mengesan penyerapan (A570 nm) dengan pembaca plat mikro

2. 3. Western blot

Inokulasi RAW264. 7 sel dalam 6-plat perigi, aspirasikan medium kultur sel selepas pengeraman semalaman, tambah medium DMEM (10 peratus FBS campur 1 peratus P/S), LPS (1 mg·L － 1) danCistanchejumlah Polisakarida dan gula berat molekul rendah (3.91 ~ 62.5 g·L -1) adalah setiap 2 mL, dan supernatan dibuang selepas 24 jam kultur aruhan. Sel-sel telah dibasuh dua kali dengan PBS dan dibuang. Selepas trypsinization, sel-sel dipipet ke bawah. Empar, keluarkan supernatan, tambah 100 μL Penampan Lisis NP40 dan lisis pada ais selama 40 minit. Selepas sentrifugasi, supernatan diambil, dan kepekatan protein ditentukan oleh kaedah BCA, dan kepekatan protein setiap histon diselaraskan secara sama rata. Ambil jumlah sampel protein yang sama dan asingkan pada 12 peratus SDS-PAGE di bawah tekanan tetap. Kemudian gunakan tangki elektroforesis pemindahan Bio-Rad untuk memindahkan membran dengan arus malar 350 mA selama 1 jam, dan pindahkan protein ke membran PVDF (prarawatan membran PVDF: rendam dalam metanol dan seimbangkan dengan penimbal pemindahan). Selepas menyekat dengan susu skim 5 peratus (dikonfigurasikan dengan TBST yang mengandungi 0.1 peratus Tween-20) selama 1 jam pada suhu bilik, membran dibasuh 3 kali dengan TBST dan membran diinkubasi dalam pelarut antibodi primer protein pada 4 ijazah semalaman. Membran dibasuh 3 kali dengan TBST setiap hari, dan pelarut yang sepadan ditambah untuk mengeram selama 1 jam. Membran telah dibasuh 3 kali dengan TBST, dan jalur telah dibangunkan dengan pembangun chemiluminescence ECL.

2. 4 analisis data

Data dinyatakan sebagai x ± s, dan kepentingan perbezaan diuji menggunakan perisian statistik GraphPad Prism 6 untuk analisis varians sehala. Ambil P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Keputusan

3. 1. Kesan gula berat molekul rendah Cistanche cistanche, jumlah glikosida, dan jumlah polisakarida ke atas aktiviti fagosit RAW264. 7 sel

Penyelidikan mengenai komponen kimia Cistanche menunjukkan bahawaCistancheterutamanya mengandungiglikosida fenilethanoid, glikosida iridoid, dan karbohidrat. Dalam eksperimen ini, jumlah glikosida cistanche (termasuk glikosida phenethyl alkohol dan glikosida iridoid), gula molekul rendah dan gula dipilih. Tiga tapak aktif jumlah polisakarida telah disiasat untuk kesannya terhadap pengaktifan RAW264. 7 sel. Kedua-dua Cistanche cistanche polysaccharide dan cistanche gula berat molekul rendah boleh meningkatkan aktiviti fagositik RAW264 dengan ketara. 7 sel, tetapi aktiviti fagositik daripada jumlah kumpulan pentadbiran glikosida tidak berubah dengan ketara. Di samping itu, LPS ubat kawalan positif juga meningkatkan aktiviti fagositik RAW264 dengan ketara. 7 sel, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1. Keputusan di atas menunjukkan bahawa gula dengan berat molekul rendah dan polisakarida Cistanche mungkin mempunyai kesan mengaktifkan RAW264. 7 sel.

3. 2. Kesan jumlah glikosida Cistanche, gula molekul rendah, dan jumlah polisakarida ke atas kandungan oksida nitrik (NO) dalam supernatan sel

Untuk menyiasat lebih lanjut kesan pengaktifan tiga tapak aktif Cistanche pada RAW264. 7 sel, kandungan NO dalam supernatan sel yang dirangsang oleh ubat yang berbeza telah ditentukan. Keputusan menunjukkan bahawa pelepasan NO dalam kumpulan LPS adalah lebih tinggi daripada kumpulan kawalan kosong (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchetidak mempunyai kesan yang ketara. Keputusan di atas menunjukkan bahawa kedua-dua polisakarida dan gula berat molekul rendah Cistanche boleh menggalakkan pembebasan NO daripada RAW264. 7 sel. Antaranya, kesan gula bermolekul rendah Cistanche amat ketara, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2.

3. 3. Kesan gula berat molekul rendah Cistanche cistanche terhadap ekspresi protein TNF- dan IL-6 dalam RAW264. 7 sel

TNF- ialah mediator keradangan penting yang muncul dalam proses pengaktifan RAW264. 7 sel, yang boleh menggalakkan sintesis dan pembebasan sitokin lain (seperti IL-6). Keputusan menunjukkan bahawa ungkapan TNF- dan IL-6 telah meningkat dengan ketara selepas gula berat molekul rendah Cistanche cistanche dirangsang, menunjukkan bahawa gula berat molekul rendah Cistanche mungkin menggalakkan ekspresi TNF - dan IL-6 dalam RAW264. 7 sel, dengan itu mengaktifkan imuniti selular Fagositosis, lihat Rajah 3.

3. 4. Kesan pengawalseliaan gula berat molekul rendah Cistanche cistanche pada laluan isyarat IKK /IκB /NF-κB

Untuk meneroka mekanisme potensi gula berat molekul rendah Cistanche cistanche dalam mengaktifkan RAW264. 7 sel, penulis menyiasat kesan pengawalseliaannya pada laluan isyarat klasik IKK /IκB /NF-κB. Gula berat molekul rendah cistanche cistanche boleh meningkatkan fosforilasi NF-κB dan fosforilasi protein isyarat utama huluannya IKK dan IκB , dan mengurangkan ekspresi jumlah protein IκB, menunjukkan bahawa ia mempunyai kesan pengaktifan pada IKK / Laluan isyarat IκB /NF-κB. LPS ubat kawalan positif juga mempunyai kesan pengawalseliaan yang serupa. Ringkasnya, gula bermolekul rendah Cistanche boleh mengaktifkan laluan isyarat IKK /IκB /NF-κB, seterusnya menyebabkan sintesis dan pembebasan sitokin seperti TNF- dan IL-6, dan akhirnya menyebabkan imuniti pengaktifan RAW264. 7 sel, lihat Rajah 4.

3. 5. Penapisan bahan aktif dengan kesan pengaktifan makrofaj dalam gula berat molekul rendah Cistanche

Makmal kami telah menganalisis gula molekul rendah yang terkandung dalamCistanchepada peringkat awal dan mendapati ia mengandungi manitol (16.53 peratus), sukrosa (8.34 peratus), fruktosa (25.38 peratus), dan glukosa (7. 75 peratus), dan bahan-bahan lain. Jadi penulis menggunakan kaedah merah neutral untuk menyaring kesan pengaktifan komponen di atas pada makrofaj. Mannitol boleh meningkatkan aktiviti fagositik makrofaj dengan ketara dalam cara yang bergantung kepada dos, manakala kesan komponen lain tidak ketara. Ini menunjukkan bahawa manitol mungkin salah satu komponen aktif utama dalam gula berat molekul rendah Cistanche cistanche untuk mengaktifkan makrofaj, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5.

4. Perbincangan

Cistanche cistanche, tumbuhan parasit dari keluarga Lydanaceae, telah dilaporkan mempunyai kesan imunomodulator, jadi ia harus mengandungi bahan imunomodulator. Dalam eksperimen ini, penulis menyaring aktiviti fagositik makrofaj peritoneal tikus pada bahagian yang disucikanCistanchedan mendapati bahawa gula dengan berat molekul rendah dan polisakarida Cistanche mempunyai kesan pengaktifan makrofaj, tetapi jumlah glikosida Cistanche tidak jelas. Pada masa yang sama, penulis mendapati bahawa gula dengan berat molekul rendah boleh mengaktifkan makrofaj pada kepekatan yang lebih rendah, jadi penulis memilihCistanchegula dengan berat molekul rendah sebagai fokus penyelidikan seterusnya.

Dengan meneliti kesan gula cistanche berat molekul rendah pada ekspresi sitokin TNF- dan IL-6, penulis mendapati bahawa gula cistanche berat molekul rendah secara signifikan meningkatkan ekspresi TNF- dan IL-6, yang seterusnya membuktikan bahawa gula cistanche berat molekul rendah mempunyai kesan ke atas tikus. Makrofaj peritoneal mempunyai kesan pengaktifan. Oleh itu, penulis meneroka lebih lanjut mekanisme tindakannya yang berpotensi. Mempunyai penyelidikan

Ditunjukkan bahawa lipopolysaccharide bakteria (LPS) boleh mendorong pengaktifan makrofaj tikus dan sel glial tikus melalui laluan isyarat seperti JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK dan MAPK [4-8]. Laluan NF-κB diiktiraf sebagai laluan klasik, jadi protein isyarat pada laluan ini telah diuji dalam eksperimen ini. Keputusan menunjukkan bahawa gula berat molekul rendah Cistanche boleh meningkatkan fosforilasi NF-κB dengan ketara dan fosforilasi protein isyarat hulu utama IKK dan IκB, menunjukkan bahawa gula berat molekul rendahCistancheboleh mengaktifkan gergasi peritoneal tetikus melalui laluan isyarat IKK /IκB /NF-κB. Sel-sel faj melepaskan sitokin radang dan kemudian memainkan peranan dalam mengaktifkan imuniti selular.

Pada peringkat awal makmal, komposisi kimia ekstrak gula berat molekul rendahCistanche deserticolatelah dianalisis secara sistematik. Didapati bahawa gula dengan berat molekul rendah terutamanya mengandungi monomer seperti manitol, sukrosa, fruktosa, dan glukosa. Kajian lanjut mendapati bahawa manitol boleh meningkatkan aktiviti fagositik makrofaj dengan ketara. Oleh itu, adalah spekulasi bahawa manitol mungkin merupakan komponen utama gula dengan berat molekul rendah yang mengaktifkan fungsi imun selular.

Secara ringkasnya, kajian ini menggunakan makrofaj dalam sistem kultur Vitro dan mendapati bahawa gula dengan berat molekul rendahCistanchemempunyai kesan pengaktifan yang ketara pada makrofaj, dan boleh mengaktifkan makrofaj peritoneal tetikus melalui laluan isyarat NF-κB, dan kemudian memainkan peranan. Manitol dalam gula dengan berat molekul rendah mungkin memainkan peranan penting dalam mengaktifkan aktiviti fagositik makrofaj.

Rujukan

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Teknik penanaman Cistanche padang pasir dan perumah Tamarix [M]. Beijing: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Gambaran keseluruhan penyelidikan tentang kesan farmakologi daripadaCistanche deserticolapolisakarida [J]. Makanan dan Dadah, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Pengaktifan makrofaj Polisakarida Cistanche [J]. Buletin Farmakologi Cina, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Aktiviti biologi dan mekanisme lipopolysaccharide bakteria [J]. Kajian Sains perubatan, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS melalui laluan p38 /MAPK dan Pengaktifan NF-κB mendorong ekspresi HIF-1 dalam RAW264. 7 sel [J]. Jurnal Universiti Perubatan Chongqing, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. Laluan isyarat JAK2/STAT3 terlibat dalam poli lipo pengaktifan mikroglia［J］ yang disebabkan oleh Gula. Jurnal Universiti Perubatan Tentera Ketiga, 2009, 31(12):1119.

[7] Lagu Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Glikosida Mulbascum menghalang keradangan yang disebabkan oleh lipopolysaccharide mikroglia BV-2 dan mekanismenya [J]. Jurnal Perubatan Cina Tradisional Cina, 2016, 41(13): 2506.