Kepekatan Paraquat yang Rendah Mendorong Pengaktifan Awal Kinase Terkawal Isyarat Ekstraselular 1/2, Protein Kinase B, Dan C-Jun N-terminal Kinase 1/2 Laluan: Peranan C-Jun N-Terminal Kinase dalam Kematian Sel yang Dicetuskan Paraquat

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo,Jerman Soler,§ dan Jose´ M. Fuentes

Abstrak:

Paraquat ialah racun herba yang mempunyai potensi risiko untuk mendorong parkinsonisme disebabkan oleh neurotoksisiti yang ditunjukkan dan persamaan strukturnya yang kuat dengan 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP plus ), neurotoksin terkenal yang menyebabkan sindrom klinikal yang serupa. kepadapenyakit Parkinson(PD). Walau bagaimanapun, pada masa ini sangat sedikit yang diketahui tentang laluan isyarat yang diaktifkan oleh paraquat dalam mana-mana sistem sel. Dalam kajian ini, kami telah menyiasat kesan paraquat pada kinase terkawal isyarat ekstraselular 1 dan 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase (JNK), dan protein kinase B (PKB) pengaktifan dalam sel E18. Kepekatan paraquat yang rendah merangsang peningkatan yang sangat awal dalam fosforilasi ERK1/2, JNK1/2, dan PKB. Perencat phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K) wortmannin dan LY 294002 (2-(4-morpholinyl)-8-fenil-4H{{ 19}}benzopyran-4-satu) menghalang peningkatan awal yang disebabkan oleh paraquat dalam fosforilasi PKB. Tambahan pula, peningkatan awal pengaktifan ERK1/2 yang dimediasi paraquat adalah sensitif kepada perencat protein kinase kinase 1 (MEK1) yang diaktifkan mitogen PD 98059(2#-amino-3#-methoxyflflavone), manakala tindak balas JNK1/2 adalah disekat oleh perencat JNK1/2 SP 600125 (antra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-satu). Prarawatan dengan wortmannin, LY 294002, atau PD 98059 tidak menjejaskan kematian sel paraquat dalam sel E18. Sebaliknya, SP 600125 dengan ketara menurunkan kematian sel yang disebabkan oleh paraquat dalam sel E18. Kesimpulannya, kami telah menunjukkan bahawa kepekatan paraquat yang rendah merangsang peningkatan yang sangat awal dalam fosforilasi ERK1 / 2, JNK1 / 2, dan PKB dalam sel E18. Tambahan pula, data yang dibentangkan menunjukkan bahawa perencatan laluan JNK1/2 melindungi sel E18 daripada kematian sel yang disebabkan oleh paraquat dan menyokong fakta bahawa perencatan pengaktifan awal JNK1/2 boleh membentuk strategi yang berpotensi dalam rawatan PD. Kata Kunci: paraquat; kepekatan rendah; JNK; kematian sel; Parkinson.

Herba anti-Parkinson's disease:cistanche

PENGENALAN

Penyakit Parkinson (PD)adalah gangguan neurodegeneratif yang dicirikan oleh kematian neuron dopaminergik dalam sub-Constantia nigra bersama-sama dengan kemasukan intracytoplasmic yang dikenali sebagai badan Lewy (Olanow dan Tatton, 1999). Hanya 5-10 peratus pesakit PD mempunyai bentuk keluarga penyakit ini dengan mod pewarisan dominan autosomal (Gasser, 2001). Faktor genetik adalah penting dalam pesakit muda, tetapi mereka tidak mungkin memainkan peranan utama dalam PD sporadis yang lebih biasa. Sebaliknya, kajian epidemiologi menunjukkan beberapa faktor persekitaran yang meningkatkan risiko mengembangkan PD(penyakit Parkinson). Ini termasuk racun perosak, racun herba, bahan kimia industri, pertanian, dan hidup di persekitaran luar bandar (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner dan BenShlomo, 1999). Hujah yang paling meyakinkan untuk menyokong faktor persekitaran dalam PD berkaitan dengan penemuan kesan biologi MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetrarki-dropyridine). Toksin sistem saraf pusat ini menghasilkan sindrom yang sama secara klinikal dan anatomi denganPD (Kopin dan Markey, 1988; Langston et al., 1983). Dalam pengertian ini, paraquat herbisida yang digunakan secara meluas (1,1#-dimetil-4,4#-bypiridinium) telah dicadangkan sebagai faktor risiko yang diduga berdasarkan kedua-dua homologi strukturnya kepada MPPþ, metabolit aktif MPTP ( Tanner dan Langston, 1990), dan mengenai laporan parkinsonisme yang dikaitkan dengan pendedahan kepada ejen (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al. al., 1992). Walau bagaimanapun, sementara laluan isyarat yang terlibat dalam kematian sel MPPþ terkenal (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), sangat sedikit yang diketahui tentang laluan isyarat yang diaktifkan oleh paraquat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) Bagaimanapun, tiada kajian tentang kejadian awal yang diperhatikan selepas terdedah kepada kepekatan rendah paraquat.

Beberapa rangsangan, termasuk MPPþ dan paraquat, boleh mengaktifkan pelbagai lata isyarat intraselular yang berkait rapat dengan kedua-dua kematian sel dan laluan survival sel. Sebagai contoh, MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) mengaktifkan ahli keluarga kinase protein diaktifkan mitogen (MAPK) dan protein kinase B (PKB). Ahli keluarga TheMAPK diaktifkan oleh MPPþ atau paraquat termasuk kinase terkawal isyarat ekstraselular 1 dan 2 (ERK1/2), kinase terminal c-Jun N (JNK1 dan JNK2), dan p38 MAPK. Umumnya diterima bahawa ERK1/2 dan pengaktifan PKB menggalakkan kelangsungan hidup sel dengan mengaktifkan laluan isyarat anti-apoptosis, manakala pengaktifan JNK1/2 dan p38 MAPK dikaitkan dengan kematian sel neuron (Harper dan LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Pengaktifan laluan phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/PKB terlibat dalam kemandirian neuron (Shin et al., 2001). Khususnya, pengaktifan laluan JNK1/2 boleh memainkan peranan penting dalam ketoksikan MPP dan paraquat (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) dan seterusnya dalam proses selular yang terjejas dalam PD(penyakit Parkinson).

Herb cistanche: Penyakit Anti-Parkinson

BAHAN DAN KAEDAH

Talian sel dan budaya.

Neuroblas otak tikus yang diabadikan secara spontan, sel E18, digunakan dalam kajian ini. Garis sel E18 telah diperolehi melalui pengabadian spontan daripada budaya 18-korteks serebrum tikus janin berusia sehari dan telah disediakan oleh Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Sepanyol) . Sel E18 mewakili neuroblas primitif yang menyatakan NF 68 dan nestin penanda neuron primitif tetapi kekurangan penanda astrocyte, protein berasid fibrillary glial. Selepas induksi pembezaan separa dengan dibutyryl-cAMP, sel menyatakan penanda neuron tambahan seperti NF 145, NF 220, dan enolase khusus neuron (Mun˜oz, komunikasi peribadi). Sel telah ditanam dalam Hanks' F-12 (Hyclone, Brevieres, Perancis) dan ditambah dengan 10 peratus FCS (Hyclone), streptomycin (100 mg/ml) dan penisilin (100 U/ml). Sel telah disemai pada 5 3 10 5 dalam 75-cm2 kelalang kultur tisu (TPP, Trasadingen, Switzerland) dan diinkubasi pada suhu 37 C di bawah 5 peratus CO2/95 peratus atmosfera udara. Kultur dilalui seminggu sekali dengan trypsinization menggunakan larutan trypsin-EDTA (Hyclone).

Rawatan sel.

Sel konfluen (~ 80 peratus ) dalam 75-cm2 kelalang kultur tisu telah ditripsin dan disemai dalam hidangan kultur tisu pada kepekatan 5 3104 sel/cm2. Dua puluh empat jam kemudian, medium telah disedut dan digantikan dengan medium segar sahaja atau medium yang mengandungi kepekatan paraquat yang ditunjukkan. Dalam eksperimen selanjutnya, kepekatan perencat kinase yang berbeza (LY 294002, wortmannin, SP 600125, dan PD(penyakit Parkinson)98059, semuanya dari Tocris, Bristol, United Kingdom) telah ditambah 30 minit sebelum pendedahan paraquat. Oleh kerana perencat kinase telah dibubarkan dalam dimetil sulfoksida, kawalan dibuat dengan kepekatan tertinggi yang digunakan (0.2 peratus vol/vol). Penambahan dimetil sulfoksida tidak menjejaskan nilai daya maju plat kawalan.

Ujian daya maju sel.

Daya maju sel ditentukan oleh ujian colorimetricMTT (Mosmann, 1983). Dalam sel yang berdaya maju, enzim mitokondria suksinat dehidrogenase boleh memetabolismekan MTT menjadi pewarna formazan yang menyerap cahaya pada 570 nm. Untuk eksperimen ini, 24-plat ujian telaga telah digunakan. Pada akhir, setiap rawatan, 100 ll MTT yang disediakan pada kepekatan 5 mg/ml dalam PBS telah ditambahkan pada setiap plat. Selepas 3 jam inkubasi, medium telah direndahkan, dan mendakan formazan telah dilarutkan dengan isopropanol berasid (0.04-0.1 N HCl dalam isopropanol mutlak). Penyerapan pewarna yang ditukar diukur pada panjang gelombang 570 nm dengan penolakan latar belakang pada 630-690 nm. Penyerapan kultur yang tidak dirawat ditetapkan pada 100 peratus.

Untuk mengesahkan keputusan yang diperolehi oleh ujian MTT, kematian sel juga dinilai dengan mengukur pembebasan enzim sitosol laktat dehidrogenase (LDH) ke medium kultur menggunakan kit ujian LDH kolorimetrik (Roche, Indianapolis, IN) mengikut arahan pengilang. . Kebocoran LDH ditakrifkan sebagai nisbah aktiviti LDH dalam medium kultur kepada jumlah aktiviti setiap telaga(3100). Data perbandingan diperoleh menggunakan kedua-dua kaedah.

Penyediaan ekstrak sel dan analisis Western blot.

Berikutan rawatan percubaan, sel-sel (dikultur dalam hidangan 60-mm) dibilas dua kali dengan PBS sejuk dan dikeluarkan dengan mengikis dan kemudian diempar pada 900 3 g selama 5 minit pada suhu 4 C. Sel-sel telah dilisiskan dalam penimbal mengandungi 50mM HEPES, pH 7.5, 300mMNaCl, 1 peratus Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4 dan Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St Louis, MO). Sel telah disentrifugasi pada 13,000 3 g selama 5 minit pada 4 C. Supernatan disimpan pada suhu 80 C sehingga analisis oleh Western blot. Kepekatan protein diukur mengikut Bradford (1976) menggunakan BSA sebagai piawai.

Jumlah protein yang sama (10 LG setiap keadaan) telah diselesaikan dalam elektroforesis gel SDS 12 peratus dan dipindahkan ke membran PVDF mengikut kaedah diubah suai separa konvensional (Fuentes et al., 2000). Secara ringkas, protein dipindahkan (250 mA selama 60 minit) ke membran PVDF menggunakan radas Sel Trans-Blot Mini (Bio-Rad, Hercules, CA). Prosedur untuk pengesanan imun termasuk pemindahan dan penyekatan membran (60 minit pada suhu bilik) dengan TTBS (10mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl dan 0.2 peratus Tween-20) yang mengandungi 10 peratus susu kering tanpa lemak. Membran kemudiannya diinkubasi selama 60 minit pada suhu bilik dengan antibodi primer poliklonal arnab (semuanya dari Cell Signalling, Beverly, MA, dicairkan 1:1000) dalam TTBS - 10 peratus susu kering tanpa lemak atau 5 peratus BSA. Selepas mencuci (untuk dua 5-minit tempoh dengan TTBS), membran diinkubasi (60 minit pada suhu bilik) dengan antibodi sekunder anti-arnab terkonjugasi peroksidase (1:5000 dalam TTBS dengan 10 peratus susu kering tanpa lemak). Selepas mencuci (untuk dua 5-tempoh min dan satu 10-minit tempoh), pengesanan antibodi terikat divisualisasikan oleh chemiluminescence menggunakan reagen ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, Perancis) dan dianalisis mengikut Kuantiti Satu perisian (Bio-Rad). Kandungan aktin dianalisis sebagai kawalan menggunakan antibodi poliklonal arnab (dari Sigma) yang dicairkan 1:2500 dalam TTBSdengan 10 peratus susu kering tanpa lemak).

Analisis statistik.

Setiap eksperimen diulang sekurang-kurangnya tiga kali dengan korelasi yang memuaskan antara keputusan eksperimen individu. Data yang ditunjukkan ialah data percubaan perwakilan; setiap kumpulan adalah purata tiga hingga empat hidangan budaya. Semua data dinyatakan sebagai min ± SEM. Keputusan dianalisis oleh ANOVA. Nilai p kurang daripada 0.05 dianggap penting.

Penyakit anti-Parkinson:Ekstrak Cistanche

KEPUTUSAN

Kesan Sitotoksik Paraquat dalam Sel E18

Seperti yang dilaporkan sebelum ini (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), beberapa garisan sel sensitif terhadap sifat toksik paraquat. Pendedahan kepada paraquat menyebabkan pengurangan yang bergantung kepada dos dalam daya maju sel. (Rajah 1.) Dalam kajian ini, sel E18 yang dirawat dengan paraquat 25lM selama 24 jam menunjukkan kehilangan daya maju sel sebanyak 50 peratus. Daya maju sel dinilai dengan mengukur transformasi kepada MTT menjadi pewarna formazan yang menyerap cahaya pada 570 nm. Ujian ini digunakan secara meluas untuk memantau kematian sel dalam beberapa garisan sel, termasuk sel E18 (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001), dan penghinaan yang berbeza, termasuk paraquat (Chun et al., 2001; Gonzalez -Polo et al., 2004).

Pengaktifan ERK1/2 Disebabkan Paraquat dalam Sel E18

Peningkatan dalam pengaktifan ERK1/2 dalam sel E18 yang dirawat dengan paraquat dipantau oleh Western blotting menggunakan antibodi ERK1/2 (Thr202/Tyr204) phosphospecific ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Eksposisi sel E18neuroblasts dengan paraquat 25lM menghasilkan peningkatan ketara dalam status fosforilasi (Thr202/Tyr204) ERK1/2 (44/42 kDa) (Rajah 2A). Peningkatan maksimum dalam fosforilasi berlaku selepas 5 minit, selepas itu tahap fosforilasi perlahan-lahan menurun kepada hampir tahap basal. Tambahan pula, peningkatan dalam fosforilasi ERK1/2 yang disebabkan oleh paraquat tidak bergantung kepada kepekatan (Rajah 2B). Prarawatan dengan perencat theMEK1, PD(penyakit Parkinson)98059 (50lM; Dudley et al., 1995) menghalang sepenuhnya peningkatan yang disebabkan oleh paraquat dalam ERK1/2fosforilasi (Rajah 3).

Pengaktifan PKB Disebabkan Paraquat dalam Sel E18

Pengaktifan PKB dalam sel E18 dikesan oleh Western blotting menggunakan antibodi spesifik fosfo (Ser473). Rangsangan sel E18 dengan paraquat 25lM menghasilkan peningkatan ketara dalam fosforilasi PKB (Rajah 4A). Peningkatan ini berlaku selepas 20 minit, setanding dengan fosforilasi ERK1/2 selepas tahap fosforilasi perlahan-lahan menurun kepada paras basal hampir (Rajah 4A). Tambahan pula, peningkatan pengantaraan paraquat dalam fosforilasi PKB adalah bergantung kepada kepekatan dengan maksimum pada 25lM paraquat (Rajah 4A). Oleh kerana PI-3K diperlukan untuk pengaktifan PKB, maka peranan PI-3K dalam pengaktifan PKB yang disebabkan oleh paraquat dalam sel E18, oleh itu, diterokai menggunakan PI-3K inhibitor wortmannin dan LY 294002.

Peningkatan pengantaraan paraquat dalam fosforilasi PKB telah disekat sepenuhnya berikutan prarawatan (30 minit) sel E18 dengan 100nM wortmannin dan 30lM LY 294002 (Rajah 5). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa laluan bergantung kepada PI-3K mengantara peningkatan yang disebabkan oleh paraquat dalam fosforilasi PKB dalam sel E18.

Pengaktifan Disebabkan Paraquat JNK1/2 dalam Sel E18

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa paraquat mengaktifkan neuron JNK1/2in (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) dan sel bukan neuron (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). Walau bagaimanapun, kepekatan yang digunakan adalah lebih tinggi daripada yang digunakan dalam kerja ini. Selain itu, masa yang dipilih untuk menggambarkan pengaktifan JNK1/2 juga lebih lama. Pengaktifan JNK1/2 dalam sel E18 dikesan oleh Western blotting menggunakan antibodi JNK (Thr183/Tyr185) phosphospecific. Rangsangan sel E18 dengan paraquat 25lM menghasilkan peningkatan yang ketara dan awal dalam fosforilasi JNK (46/54 kDa) (Rajah 6A). Peningkatan ini adalah maksimum selepas 5 minit selepas itu tahap fosforilasi menurun ke arah tahap basal (Rajah 6A). Walau bagaimanapun, peningkatan paraquatmediated dalam fosforilasi JNK1/2 tidak bergantung kepada kepekatan (Rajah 6B). Peningkatan pengantaraan paraquat dalam fosforilasi JNK1/2 adalah sensitif kepada perencat JNK1/2 SP 600125 (10lM; Rajah 7; Bennett et al., 2001). Akhirnya, paraquat (25lM) tidak merangsang peningkatan yang boleh diukur dalam fosforilasi p38 MAPK dalam sel E18 dalam eksperimen kursus masa yang sama (data tidak ditunjukkan). Eksperimen ini dilakukan menggunakan antibodi p38 MAPK (Thr180/Tyr182) phosphospecific.

Pengukuran Daya Tahan Sel Selepas Rawatan Sel E18 dengan Perencat Paraquat dan Kinase

Setelah menunjukkan bahawa paraquat menghasilkan dalam semua kes pengaktifan awal ERK1/2, PKB, dan JNK1/2 dalam sel E18, kami kemudiannya menentukan peranan pengaktifan pantas laluan kinase ini dalam kematian sel yang disebabkan oleh kepekatan rendah paraquat menggunakan khusus farmakologi. perencat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, pendedahan sel E18 kepada 25lM paraquat yang disebabkan oleh pengurangan ketara dalam daya maju sel (sekitar 50 peratus ). Untuk menyiasat peranan ERK1/2, PKB, dan JNK1/2 dalam kematian sel yang disebabkan oleh paraquat, sel E18 telah diinkubasi selama 30 minit dengan perencat kinase berikut: PD(penyakit Parkinson)98059 (50lM; MEK1/2inhibitor), LY 294002 (30lM; PI-3K inhibitor), wortmannin(100nM; PI-3K inhibitor) dan SP 600125 (10lM; JNK1/2 inhibitor). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8 (dan ia diringkaskan dalam Jadual 1), wortmannin, LY 294002, dan PD 98059 tidak mempunyai kesan ketara ke atas kehilangan daya maju sel yang disebabkan oleh paraquat 25lM.

PERBINCANGAN

Baru-baru ini, pelbagai kajian telah meningkatkan minat terhadap kemungkinan neurotoksin persekitaran seperti racun perosak mungkin berkaitan dengan perkembangan PD bukan genetik.(penyakit Parkinson)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz dan Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ adalah salah satu racun herba yang mungkin terlibat dalam PD, kerana struktur kimia yang sama dengan MPPþ dan korelasi yang kuat antara kejadian penyakit dan jumlah PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz dan Yu, 2000). Walau bagaimanapun, mekanisme ketoksikan neuron yang berlaku kurang pendedahan kepada paraquat paras rendah belum ditentukan. Walau apa pun, karya terdahulu tidak berminat dengan proses awal yang dibuktikan selepas eksposisi kepada paraquat. Penemuan utama kajian ini ialah kami telah menunjukkan bahawa sel E18neuroblast yang terdedah kepada kepekatan rendah paraquatrapid meningkatkan fosforilasi diaktifkan bagi laluan isyarat antiapoptosis umumnya PI-3K/PKB dan MEK ERK dan juga JNK1/ secara amnya proapoptotik 2 MAPK. Sebaliknya, paraquat tidak merangsang peningkatan terukur yang bergantung kepada masa atau kepekatan dalam fosforilasi p38 MAPK. Seperti yang dinyatakan di atas, kami menggunakan kepekatan paraquat yang rendah. Kaitan fakta sama ada paraquat boleh masuk ke dalam otak atau tidak kerana ia adalah molekul bercas telah diperdebatkan. Walau bagaimanapun, penemuan baru-baru ini (Shimizu et al., 2001) mendedahkan bahawa paraquat boleh menggunakan pam asid amino neutral untuk masuk ke dalam otak. Penemuan yang dibentangkan dalam kerja ini menunjukkan bahawa hanya kepekatan paraquat yang rendah diperlukan dalam sel untuk merangsang dengan cepat beberapa laluan isyarat termasuk NK, yang terlibat dalam proses kematian sel. Pengaktifan awal ini disebabkan kepekatan paraquat yang rendah dicadangkan, buat kali pertama, dalam kerja sekarang.

Sedikit perhatian telah didedikasikan untuk mengkaji perubahan dalam tahap fosforilasi PKB atau ERK1/2 yang disebabkan oleh paraquat (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Walau apa pun, laporan terdahulu (Peng et al., 2004) menggunakan kepekatan paraquat yang agak tinggi (400lM), mengukur tahap fosforilasi ERK selepas pendedahan 12-18 jam. Pada masa ini, mereka tidak melihat perubahan dalam tahap p-ERK. Dalam kerja kami, kami mengesan pengaktifan awal (5-10 min) dan penting ERK1/2 (Rajah 2A). Pengaktifan ini menurun secara perlahan ke tahap basal. Dalam keadaan kami, tahap ERK1 / 2 terfosforilasi (selepas 12-18h) adalah sama seperti dalam kawalan, menunjukkan bahawa laluan ini tidak aktif pada masa ini (data tidak ditunjukkan) seperti yang diterangkan oleh Peng et al. (2004). Pengaktifan ini tidak bergantung kepada kepekatan, menunjukkan keputusan bahawa rangsangan teguh ERK diperoleh dan dikekalkan dengan kepekatan paraquat yang sangat rendah. Perubahan dalam tahap PKB terfosforilasi masih belum diterangkan selepas pendedahan paraquat. Kami menunjukkan dalam Rajah4 bahawa keputusan bergantung pada masa dan kepekatan, menunjukkan kesan maksimum selepas 20-eksposisi min dengan paraquat 25lM. Iaitu, peningkatan awal paraquat-mediated dalam fosforilasi PKB adalah setanding dengan yang diperhatikan untukERK1/2. Data ini mendedahkan peningkatan awal dalam mengaktifkan fosforilasi kedua-dua laluan survival PKB dan ERK. Tiada data tentang pengaktifan awal PKB atau ERK dalam kematian sel yang disebabkan oleh paraquat. Walau bagaimanapun, kajian terdahulu (Halvorsen et al., 2002) menerangkan peningkatan awal yang sama dalam kedua-dua laluan dalam sel neuroblastoma SH-SY5Y yang terdedah kepada MPPþ. Dalam kes ini, tahap fosforilasi tidak mereput ke arah tahap basal. Data-data ini amat menarik kerana struktur serupa yang sebelum ini berkaitan antara paraquat dan MPPþ, menunjukkan permulaan berbeza bagi jentera selular yang terlibat dalam kesan kedua-dua molekul.

Lebih banyak perhatian telah diberikan kepada peranan JNK1/2pathway dalam pengantaraan isyarat yang menyumbang kepada kematian sel yang disebabkan oleh paraquat. Dalam kajian ini, kami telah menunjukkan bahawa kepekatan rendah (25lM) paraquat mencetuskan peningkatan ketara dalam JNK1/2 terfosforilasi (Rajah 6). Seperti yang berlaku dalam PKBor ERK1/2, pengaktifan ini bergantung pada masa dengan permulaan yang sangat awal (5 min) dan dengan kembali perlahan ke tahap basal. Kerja-kerja terdahulu (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) menunjukkan lewat (12–18 jam) pengaktifan JNK1/2pathway yang dihasilkan dalam apa jua keadaan dengan kepekatan paraquat yang agak tinggi (dari 400lM [Peng et al., 2004] hingga 800lM [Chunet al., 2001]). Dalam keadaan kami, tahap fosforilasi JNK1/2 pada masa yang dinyatakan adalah setanding dengan kawalan. Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan buat kali pertama bahawa pendedahan sel kepada kepekatan paraquat yang sangat rendah menghasilkan pengaktifan awal laluan PKB, ERK1/2 dan JNK1/2.

Setelah menetapkan bahawa paraquat mencetuskan pengaktifan awal PKB, ERK1/2, dan JNK1/2 dalam sel E18, kami kemudiannya menyiasat peranan laluan protein kinase ini dalam kematian sel yang disebabkan oleh paraquat menggunakan beberapa perencat farmakologi. Daya maju sel dipantau dengan mengukur transformasi kepada MTT menjadi pewarna formazan yang menyerap cahaya pada 570 nm. Ujian MTT telah digunakan untuk mengukur kecederaan neuron dengan tepat berikutan pelbagai penghinaan termasuk MPPþ atau paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004 ), dan ia adalah kaedah yang paling banyak digunakan untuk menentukan kematian sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8, prarawatan dengan perencat JNK1/2 terpilih SP 600125 telah mengurangkan kematian sel yang disebabkan oleh paraquat dengan ketara. Kepekatan SP 600125ini menyekat sepenuhnya pengaktifan akibat paraquat JNK1/2(Gamb. 7). Data ini mencadangkan bahawa perencatan pengaktifan awal laluan JNK1/2 melindungi sel daripada kematian sel yang disebabkan oleh paraquat. Data ini adalah selaras dengan kajian terdahulu (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), yang telah menunjukkan bahawa JNK1/2 terlibat dalam kematian sel neuron yang dicetuskan oleh paraquat. Walau bagaimanapun, kajian ini menggunakan antara 15 dan 30 kali lebih kepekatan paraquat daripada yang digunakan dalam kajian ini. Kami juga menunjukkan bahawa kepekatan paraquat yang rendah boleh menghasilkan bukan sahaja pengaktifan tetapi juga pengaktifan awal laluan ini. Perlindungan yang diperhatikan dengan SP600125 juga menunjukkan bahawa laluan JNK1/2 terlibat dalam kematian sel yang disebabkan oleh paraquat. Selain itu, perencatan JNK1/2 telah direka sebagai strategi yang berpotensi dalam merawat PD(penyakit Parkinson)dalam beberapa model dalam vivo dan in vitro (Wang et al., 2004).

kesan neuroprotektif cistanche

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa kedua-dua PKB dan ERKpathways terlibat dalam survival neuron (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). Dalam kajian ini, kami telah menunjukkan bahawa kepekatan rendah paraquat menghasilkan dan merangsang awal kedua-dua laluan PKB dan ERK. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa pengaktifan PKB dan ERK yang disebabkan oleh paraquat mungkin terlibat dalam melindungi sel daripada kematian sel yang disebabkan oleh paraquat. Untuk menyiasat kemungkinan ini, kami menggunakan perencat PI-3K yang tidak berkaitan struktur wortmannin dan LY 294002 dan PD perencat ERK1/2(penyakit Parkinson)98059. Menariknya, kedua-dua perencatan PKB dan ERK tidak mengubah daya maju sel dengan kehadiran paraquat, menunjukkan bahawa, dalam keadaan kami, peningkatan PKB dan ERKactivation tidak penting untuk terus hidup dalam kematian sel yang disebabkan oleh paraquat dalam sel E18.

Telah diketahui umum bahawa mekanisme neurotoksisiti paraquat adalah, antara faktor lain, dimediasi melalui tekanan oksidatif (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). Dalam pengertian ini, baru-baru ini tekanan oksidatif sitosolik yang sangat cepat dalam peristiwa apoptosis awal yang terlibat dalam kematian sel yang disebabkan oleh paraquat telah diterangkan (Gonzalez-Polo et al., 2004). Oleh kerana tekanan oksidatif mengaktifkan ahli keluarga MAPK (seperti ERK1/2dan JNK1/2) dan PKB (Kamata dan Hirata, 1999), pengaktifan awal ERK1/2, JNK1/2 dan PKB ini boleh dikaitkan dengan oksidatif yang cepat. akibat tekanan selepas eksposisi paraquat.

Ringkasnya, keputusan kami menunjukkan buat kali pertama bahawa kepekatan paraquat yang rendah merangsang peningkatan yang sangat awal dan mantap dalam fosforilasi PKB, ERK1/2, dan JNK1/2 dalam sel E18. Di samping itu, kami telah menunjukkan bahawa perencatan pengaktifan awal laluan JNK1/2 melindungi sel E18 daripada kematian sel yang disebabkan oleh paraquat. Keputusan ini menunjukkan kewujudan beberapa peristiwa awal (sebagai pengaktifan JNK1/2 pantas) yang memainkan peranan penting dalam kematian sel yang disebabkan oleh kepekatan paraquat yang rendah. Keputusan ini juga membuka barisan baharu dan menarik dalam kajian ketoksikan paraquat dan kemungkinan implikasinya dalam pembangunan PD(penyakit Parkinson).

CATATAN: Cistancheadalah herba tradisional Cina yang mempunyai kesan pada neuron dan sel otak. cistanche juga dikenali sebagai ginseng padang pasir, ia adalah rawatan yang berpotensi untuk penyakit neuro sepertipenyakit Parkinsonberdasarkan kajian farmakologi moden