-Asid Lipoik Meningkatkan Sintesis Kolagen Dan Pemendapan dalam Buah Pinggang Tikus Tanpa Diabetes Dan Diabetes

Nevena Grdović et al

-Lipoic acid (ALA) digunakan secara meluas sebagai suplemen pemakanan dan agen terapeutik dalam pengurusan diabetes. Kesan antioksida dan hipoglikemik yang mantap ALA dianggap sangat penting dalam memerangi komplikasi diabetes termasukbuah pinggangkecederaan. Kajian ini menilai potensi ALA untuk mempengaruhi kejadian profibrotik dalambuah pinggangyang boleh mengubah struktur dan fungsinya. ALA ditadbir secara intraperitoneal (10 mg/kg) kepada tikus Wistar jantan diabetes yang tidak disebabkan oleh diabetes dan streptozotocin selama 4 dan 8 minggu. Kesan ALA dinilai bermula daripada perubahan struktur/morfologi melalui perubahan yang mencirikan proses profibrotik, kepada pengawalan ekspresi gen kolagen dalambuah pinggang. Di sini, kami menunjukkan bahawa ALA meningkatkan tahap glukosa dan urea sistemik, mengurangkan pembentukanbuah pinggangproduk akhir glikasi lanjutan (AGEs), dan mengekalkan integriti struktur buah pinggang dalam tikus diabetes. Walau bagaimanapun, kejadian profibrotik yang dicetuskan dalam diabetes tidak dikurangkan oleh ALA kerana sintesis/pemendapan kolagen dan ekspresi faktor pertumbuhan mengubah- 1 (TGF- 1) dan -aktin otot licin (-SMA) kekal dinaikkan dalam ALA- merawat tikus kencing manis, terutamanya selepas 8 minggu serangan diabetes. Lebih-lebih lagi, 8 minggu rawatan tikus tanpa diabetes dengan ALA membawa kepada perkembangan ciri profibrotik yang dicerminkan dalam peningkatan sintesis/pemendapan kolagen. Selain isyarat hiliran TGF- 1, mekanisme tambahan yang mendasari pengawalseliaan kolagen IV dalam tikus bukan diabetes yang dirawat dengan ALA melibatkan penurunan metilasi DNA penganjurnya yang mungkin timbul daripada peningkatan ekspresi Tet1. Penemuan ini menekankan penjagaan terapeutik dalam penggunaan ALA, terutamanya pada pesakit denganbuah pinggangkencing maniskomplikasi.

Untuk maklumat lanjut: ali.ma@wecistanche.com

Klik untuk serbuk ekstrak Cistanche untuk penyakit buah pinggang

1. Pengenalan

Penghidap kencing manisbuah pinggangpenyakit (DKD) atau nefropati diabetik adalah salah satu komplikasi mikrovaskular dengan insiden sebanyak 20-40 peratus dalam kalangan pesakit diabetes yang disertai dengan perubahan struktur yang progresif dan kehilangan fungsi buah pinggang [1]. Mekanisme patofisiologi yang mendasari DKD adalah kompleks dan bermula dengan hiperglikemia kronik yang seterusnya mencetuskan tekanan oksidatif, pembentukan produk akhir glikasi lanjutan (AGEs), pengaktifan laluan isyarat MAPK/PKC, dan ekspresi seterusnya beberapa mediator proinflamasi dan profibrotik [2,]. 3]. Crosstalk antara peristiwa ini mengakibatkan pengumpulan protein matriks ekstraselular (ECM) dalam mesangium dan tubulointerstitium dengan corak histopatologi klasikbuah pinggangfibrosis. Ia bermula dengan perubahan struktur seperti penebalan membran bawah tanah dan pengembangan mesangial, secara beransur-ansur berkembang menjadi glomerulosklerosis dan fibrosis interstisial akhirnya memuncak dalambuah pinggangkegagalan[4, 5].

Mengubah faktor pertumbuhan- 1 (TGF- 1) isyarat hiliran ialah sebahagian daripada proses penyembuhan luka yang, apabila inflamasi berterusan, hiperglikemia atau tekanan oksidatif yang mencirikan diabetes, bertukar menjadi fibrosis patofisiologi [6] . TGF- 1 ialah mediator pusat patogenesis DKD yang menjadi pengawal selia utama ekspresi protein ECM pada pesakit diabetes, mungkin akibat daripada persekitaran oksidatif hiperglisemik dan terganggu [7–10]. TGF- 1 mendorong pengumpulan ECM melalui rangsangan kolagen jenis I dan IV, -aktin otot licin (-SMA), laminin dan sintesis fibronektin, serta dengan perencatan enzim merendahkan ECM [11].

Kolagen jenis IV adalah konstituen paling banyak dalam membran bawah tanah [12], dinyatakan dalam membran bawah tanah glomerular dan tiub di bawah keadaan fisiologi [13]. Walau bagaimanapun, nefropati diabetik disertai dengan ekspresi menyimpang jenis kolagen IV yang merangkumi pengeluaran berlebihan dan pengedaran tidak teratur melalui interstitium dan mesangium [14-16]. Antara enam isoform kolagen jenis IV ( 1- 6), 1(IV) dan 2(IV) terdapat secara universal dalam semua membran bawah tanah. Rantai kolagen 1(IV) dan 2(IV) dikodkan oleh gen Col4a1 dan Col4a2 yang peraturan transkripnya menyampaikan interaksi cis-trans yang diterangkan dengan baik [17], tetapi penemuan baru-baru ini menyerlahkan peranan penting mekanisme epigenetik, termasuk metilasi DNA, dalam peraturan ekspresi mereka [18–20].

Memandangkan mekanisme patofisiologi yang terletak di belakang DKD, strategi rawatan adalah mudah dan menyasarkan hiperglikemia dan tekanan oksidatif. Potensi hipoglikemik dan antioksidan ALA, yang merupakan salah satu antioksidan yang digunakan secara meluas, didapati dapat memperbaikibuah pinggangperubahan patologi yang berkaitan dengan nefropati diabetik [21-23]. Bagaimanapun, berkaitan dengan penuaan kulit, kesan-kesan berfaedah ALA melalui peningkatan sintesis kolagen jenis I dalam fibroblas kulit manusia telah dilaporkan [24]. Memandangkan patofisiologi DKD, kesan ALA yang serupa boleh memudaratkan pesakit diabetes denganbuah pinggangkomplikasi. Dengan latar belakang ini, kajian ini tertumpu untuk menilai kesan ALA terhadap ciri-ciri struktur/morfologi buah pinggang dan proses profibrotik dengan penekanan pada ekspresi gen jenis IV kolagen dalam tikus diabetes dan bukan diabetes.

2. Bahan dan Kaedah

2.1.Haiwan, Rawatan dan Persediaan Eksperimen.Semua eksperimen telah dilakukan pada 2.5-tikus albino Wistar jantan berumur antara 220 dan 250 g. Semua prosedur haiwan yang diluluskan oleh Jawatankuasa Etika untuk Penggunaan Haiwan Makmal Institut Penyelidikan Biologi "Siniša Stan-ković," Universiti Belgrade adalah mematuhi Arahan 2010/63/EU mengenai perlindungan haiwan yang digunakan untuk eksperimen dan tujuan saintifik yang lain. Haiwan dalam kajian ini telah dikorbankan dengan kaedah fizikal euthanasia menggunakan guillotine, mengikut semua cadangan garis panduan untuk euthanasia haiwan. Kematian berlaku serta-merta dan haiwan tidak menderita. Euthanasia dilakukan di dalam bilik operasi, dipisahkan dari bilik perumahan, seekor demi seekor haiwan (selebihnya haiwan dalam eksperimen itu diadakan di dalam bilik eksperimen yang diasingkan daripada bilik gerakan di mana eutanasia dilakukan untuk mengelakkan tekanan bagi yang lain. haiwan). Euthanasia dilakukan oleh bahan yang terlatih dan berpengalaman. Peralatan yang digunakan untuk memenggal kepala berfungsi dengan baik (perkhidmatan dilakukan secara berkala untuk memberikan ketajaman bilah).

Kencing manis disebabkan oleh suntikan streptozoticin (STZ) (MP Biomedicals) dos rendah berganda (40}}) berganda selama lima hari berturut-turut; tikus kawalan disuntik dengan kenderaan sahaja (penampan natrium sitrat 0.1 M, pH 4.5). Tahap glukosa darah diukur 24 jam selepas suntikan STZ terakhir dengan glukometer darah Accu-Chek Active, dan haiwan itu dianggap diabetes apabila tahap glukosa darah berpuasa melebihi 20 mmol/l. Tikus telah dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan eksperimen: kawalan (kawalan, n=8), kawalan dirawat dengan ALA (ALA, n=8), kencing manis (STZ, n=10), dan kumpulan diabetes yang dirawat dengan ALA (STZ/ALA, n=10). ALA (Ivančić i sinovial, Belgrade, Serbia) disuntik secara intraperitoneal (10 mg/kg) setiap hari selama 4 dan 8 minggu, bermula dari suntikan STZ yang terakhir. Selepas pengorbanan dan pengumpulan darah, hirisan perut dibuat dan kedua-duanyabuah pinggangtelah dikeluarkan. satubuah pinggangdibekukan dalam nitrogen cecair, disimpan pada -80 darjah, dan digunakan untuk pengasingan protein, DNA dan RNA, manakala yang satu lagi difiksasi dalam 10 peratus formalin penimbal untuk pemeriksaan histologi.

2.2.Analisis Biokimia.Tikus telah berpuasa semalaman sebelum korban. Serum darah dikumpulkan selepas pembekuan darah dan sentrifugasi pada 2,000 g selama 10 minit. Serum digunakan untuk penentuan kepekatan glukosa dengan kit komersial (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), paras trigliserida serum dengan kaedah GPO-PAP menggunakan kit enzimatik (Randox Laboratories, UK), paras urea oleh Urea Assay Kit (Abcam, Amerika Syarikat), dan kepekatan kreatinin menggunakan Cayman's Creatinine Assay mengikut arahan pengilang.

2.3.Analisis Histologi dan Pewarnaan Imun.Formalin- tetapbuah pinggangtisu telah dehidrasi dalam siri xylol dan alkohol yang berkurangan untuk kemasukan posterior dalam blok paraffin. Blok tisu dibelah pada 5 μm pada mikrotom berputar (RM 2125RT; Leica Microsystem). Untuk melihat perubahan dalam morfologi buah pinggang, bahagian tisu telah diwarnakan menggunakan kaedah Asid-Schiff (PAS). Selanjutnya, bahagian yang diwarnai dianalisis menggunakan mikroskop Olympus (BX-51) yang dilengkapi dengan mikroaktuator, pentas bermotor dan kamera, dikawal oleh pakej perisian stereologi CAST Visiopharm Integrator System. Kawasan lumen tiub diperoleh pada pembesaran objektif 40x dan dinyatakan sebagai peratusan ( peratus ) bagi setiap kawasan yang diperiksa. Pecahan matriks mesangial dinilai sebagai kawasan pewarnaan PAS positif, dinyatakan sebagai peratus setiap jumlah kawasan glomerular (pembesaran objektif 100x).

Untuk pengesanan gentian kolagen, bahagian tisu diwarnakan dengan pewarnaan trichrome Masson. Selepas pewarnaan, bahagian diperhatikan di bawah mikroskop cahaya (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Jerman, dilengkapi dengan kamera Leica DFC 320 CCD; pembesaran objektif 40x). Analisis imej dilakukan oleh perisian ImageJ (versi 1.52p, Institut Kesihatan Nasional). Imej telah ditukar kepada timbunan RGB dan ambang manual digunakan untuk menilai bahagian kawasan kolagen setiap kawasan tisu.

Analisis imunohistokimia dilakukan seperti yang diterangkan dalam [25] menggunakan antibodi poliklonal yang dibangkitkan terhadap N(?)-(carboxymethyl)lysine (CML) (pencairan 1: 50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) dan peroksidase lobak pedas antibodi sekunder (1: 100) (Bioteknologi Santa Cruz). Bahagian tisu telah diwarnakan dengan 3,3'-diaminobenzidine (DAB), diwarnakan balas dengan hematoxylin, dan dipasang dan diperhatikan di bawah mikroskop cahaya (Leica DM RB Photo- microscope; pembesaran objektif 40x). Analisis imej dilakukan oleh perisian ImageJ (versi 1.52p, Institut Kesihatan Nasional). Imej telah diproses dengan penyahkonvolusian warna dengan pilihan vektor H DAB. Isyarat CML dikira sebagai purata keamatan kelabu pewarnaan DAB dinormalkan kepada bilangan nukleus (diperolehi menggunakan pilihan Analyze Particles).

2.4.Analisis Western Blot.25 ug daripadabuah pingganghomogenat dipisahkan oleh SDS–PAGE, dipindahkan ke membran polivinilidena diuorida, dan disiasat dengan antibodi poliklonal terhadap GAPDH (FL-335) dan antibodi monoklonal terhadap tikus TGF- 1 (3C11) dan SMA (CGA7) semuanya daripada Bioteknologi Santa Cruz dan semua dicairkan dalam nisbah 1: 1,000. Pengesanan dilakukan oleh sistem pengesanan chemiluminescence yang dipertingkatkan (Santa Cruz Biotechnology). Kuantifikasi jalur imunoreaktif dilakukan menggunakan perisian elektroforesis TotalLab (Phoretix) (versi 1.10) dan dinormalkan kepada GAPDH yang digunakan sebagai kawalan pemuatan.

2.5. PCR Kuantitatif Masa Nyata (RT-qPCR).Jumlah RNA telah diasingkan daripadabuah pinggangmenggunakan Kit Mini RNeasy (Qiagen). Untuk sintesis cDNA, 1 ug daripada jumlah RNA telah dirawat dengan DNase I dan ditranskripsi terbalik dengan Kit Sintesis cDNA RevertAid First-Strand (Fermentas, Burlington, Kanada) menggunakan campuran primer heksamer dan oligo (dT) rawak. Tahap mRNA dikira menggunakan 2x Maxima SYBR Green/- ROX qPCR Master Mix (Fermentas) pada sistem PCR Masa Nyata QuantStudio 3 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/) digunakan untuk mereka bentuk primer (disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1) untuk penilaian Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, dan Ekspresi gen Tet1. Kitaran haba terdiri daripada denaturasi awal pada 95 darjah /10 min dan 40 kitaran PCR dua langkah pada 95 darjah /15s dan 60 darjah /60s. Tahap ekspresi mRNA bagi gen yang diminati telah dinormalkan kepada tahap ekspresi mRNA Actb sebagai gen rujukan melalui kaedah 2-dCT.

2.6. Pengasingan DNA Genomik dan Penukaran Bisulfit DNA.DNA genomik telah diasingkan menggunakan pendekatan Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) [26], mengikut protokol untuk pengekstrakan DNA daripada tisu mamalia (tersedia dalam talian di https://bomb.bio/protocols/). DNA genomik tertakluk kepada protokol penukaran bisulfit BOMB (boleh didapati dalam talian di https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7.Pengukuran Tahap Global Metilasi DNA.Tahap metilasi DNA global diukur menggunakan 5-kit DNA ELISA mC (Zymo Research, California, USA) mengikut arahan pengilang. DNA genomik yang disucikan (100 ng) diasingkan daripadabuah pinggangdaripada semua kumpulan eksperimen telah digunakan, dan setiap sampel telah diuji dalam pendua. Kepentingan statistik dianggarkan menggunakan ANOVA sehala dengan penyekatan, merawat setiap plat ELISA sebagai satu blok.

2.8. PCR Khusus Metilasi (MSP).Pasangan primer untuk analisis MSP, yang direka pada kawasan promoter Col4a1 merangkumi tapak permulaan transkripsi (TSS), telah direka bentuk menggunakan MethPrimer (//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (Jadual Tambahan S2 ). Kedudukan primer (berbanding dengan TSS untuk Col4a1, ditandakan sebagai tambah 1) yang digunakan untuk analisis MSP adalah seperti berikut: M fw (-35, -14), M rev (tambah 44, tambah 64), U fw (-35, -14), dan U rev ( tambah 45, tambah 69). Memandangkan setiap primer meliputi 2 CpG, 4 CpG secara keseluruhan telah diuji untuk status metilasi setiap pasangan primer. Campuran tindak balas untuk MSP mengandungi Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng DNA tertukar bisulfit dan 0.5 μM setiap primer khusus untuk DNA metilasi (M) dan tidak metilasi (U) pada isipadu akhir 10 μL. MSP telah dijalankan pada sistem PCR Masa Nyata QuantStudio 3 (Applied Biosystems). Keadaan berbasikal PCR adalah seperti berikut: langkah denaturasi awal pada 95 darjah /10 min dan diikuti dengan 40 kitaran denaturasi pada 95 darjah /15s, dan penyepuhlindapan dan pemanjangan pada 58 darjah /60s. Tahap relatif DNA metilasi dinyatakan menggunakan indeks metilasi yang ditakrifkan sebagai 2 (kitaran demethylated Ct) - (kitaran metilasi Ct) [27].

2.9.Analisis Statistik.Data tersebut dinyatakan sebagai min ± SD (sisihan piawai) untuk semua parameter yang dikaji. Ujian-t pelajar digunakan untuk membandingkan cara pembolehubah yang diedarkan secara normal antara dua kumpulan. Perbezaan statistik antara kumpulan dianalisis menggunakan analisis varians sehala (ANOVA), diikuti dengan ujian perbandingan berganda Tukey menggunakan Perisian GraphPad Prism, ver. 5.00 (Perisian GraphPad, San Diego, CA, Amerika Syarikat).

3. Keputusan

3.1.Kesan ALA terhadap Indeks Biokimia dalam Tikus Diabetik.Glukosa, trigliserida, urea, dan kreatinin ditentukan dalam serum kawalan, kencing manis, dan tikus tanpa diabetes dan kencing manis yang dirawat ALA (Rajah 1). Keadaan diabetes diikuti 4 minggu dan 8 minggu, untuk memasukkan kursus masa yang diperlukan untuk proses yang merugikan untuk dimanifestasikan. Kedua-dua kumpulan tikus diabetes dicirikan oleh hiperglisemia, peningkatan trend trigliserida dan tahap kreatinin tetapi tanpa kepentingan statistik, dan dengan peningkatan tahap urea yang ketara. Dalam tikus diabetik, 4 minggu rawatan ALA mengakibatkan penurunan paras glukosa serum kepada nilai kawalan, manakala selepas 8 minggu paras glukosa menurun tetapi masih kekal meningkat dengan ketara berbanding dengan kawalan. Dalam kedua-dua kumpulan diabetes yang dirawat dengan ALA, trigliserida, dan kreatinin tidak berubah dengan ketara. Rawatan dengan ALA secara signifikan menurunkan tahap urea tikus diabetes selepas 4 minggu, manakala selepas 8 minggu tahap serum urea tikus diabetes menurun berbanding kawalan diabetes tetapi tanpa kepentingan statistik. Pentadbiran ALA untuk mengawal tikus tidak memberi kesan yang ketara kepada parameter biokimia yang diperiksa.

3.2.Penilaian Morfologi Struktur Renal dan Pembentukan CML selepas Rawatan ALA.Pewarnaan PAS menyerlahkan ciri histopatologi buah pinggang yang dikaitkan dengan diabetes (Rajah 2(a)). Penebalan membran bawah tanah glomerular muncul selepas 4 minggu permulaan diabetes manakala pengembangan matriks mesangial dan tubul dengan lumen melebar diperhatikan selepas 8 minggu permulaan diabetes. Analisis histologi mendedahkan bahawa kawasan lumen tiub, glomerular, dan matriks mesangial meningkat dengan ketara dalam 8 minggu tikus diabetes berbanding tikus kawalan dan kawalan ALA yang dirawat. Walau bagaimanapun, selepas rawatan ALA, dilatasi tiub dan pengembangan matriks mesangial menurun dengan ketara tetapi masih kekal di atas nilai kawalan, manakala kawasan glomerular dikembalikan sepenuhnya ke tahap kawalan. Dalam tikus kawalan yang dirawat dengan ALA, pecahan matriks mesangial didapati meningkat menunjukkan bahawa penggunaan jangka panjang ALA boleh menjejaskan beberapa ciri struktur dalambuah pinggang(Rajah 2(a)).

AGE adalah faktor patogenik yang menyumbang kepada kerosakan buah pinggang dalam diabetes. Untuk memeriksa sama ada ALA mempengaruhi pengumpulan produk AGE dalambuah pinggangtikus diabetes, kandungan buah pinggang CML dinilai dengan pewarnaan imunohistokimia dalam kawalan, tikus diabetes (4 dan 8 minggu) dan kawalan ALA dirawat dan tikus diabetes (4 dan 8 minggu) (Rajah 2(b)). Pewarnaan untuk CML adalah positif dalam kedua-dua kumpulan tikus diabetes mendedahkan bahawa CML terkumpul terutamanya dalam tubulointerstitium dan pada tahap yang lebih rendah dalam glomeruli. Mengikut pengiraan kandungan CML, perubahan ini adalah signifikan secara statistik berbanding dengan kawalan yang sepadan (Rajah 2(b)). Selepas rawatan ALA tikus diabetes (4 dan 8 minggu), kedua-dua tubulointerstitial dan glomerular CML immunoreactivity menurun dengan ketara manakala tikus kawalan dirawat dengan ALA, positif CML kekal tidak dapat dikesan seperti dalam kawalan.

3.3.Kesan ALA terhadap Pemendapan Kolagen dan Ekspresi Gen Col4a1.Pewarnaan trichrome Masson mendedahkan pemendapan kolagen di kawasan tubulointerstitial dan dalam glomeruli, khususnya dalam membran bawah tanah kedua-dua petak dalam kumpulan tikus diabetes (4 dan 8 minggu) (Rajah 3(a)). Rawatan ALA (4 dan 8 minggu) tikus tanpa diabetes juga dikaitkan dengan peningkatan pemendapan kolagen yang dicirikan oleh kawasan glomerular dan tubulointerstitial yang diduduki oleh matriks bernoda kolagen tetapi tanpa kepentingan statistik. Dalam tikus diabetes yang dirawat ALA (4 dan 8 minggu), pemendapan kolagen kekal berterusan sejak penurunan yang ketara tidak dikesan berbanding tikus diabetes. Untuk mengesahkan peningkatan dalam sintesis kolagen, tahap ekspresi gen Col4a1 dinilai oleh RT-PCR (Rajah 3(b)). Peningkatan ketara dalam ekspresi gen Col4a1 dalam buah pinggang tikus diabetes dalam kedua-dua titik masa, serta dalam buah pinggang tikus diabetes dan bukan diabetes yang dirawat ALA daripada kedua-dua kumpulan eksperimen (4 dan 8 minggu) telah dikesan, berbanding dengan kawalan masing-masing. .

3.4.Perubahan Profibrotik Berkaitan dengan Diabetes dan Rawatan ALA.Analisis Western blot mendedahkan bahawa paras protein TGF- 1 tidak berubah dengan ketara selepas 4 minggu tanpa mengira rawatan (Rajah 4(a)). Walau bagaimanapun, induksi protein TGF- 1 yang signifikan secara statistik telah dikesan selepas 8 minggu diabetes, yang berkurangan sedikit dengan rawatan ALA tetapi kekal meningkat dengan ketara berbanding dengan kawalan. Selain itu, induksi TGF- 1 yang serupa telah diperhatikan dalam haiwan bukan diabetes yang dirawat dengan ALA (Rajah 4(a)). Untuk memeriksa sama ada induksi TGF- 1 disertai dengan kejadian penanda fibrotik, kehadiran SMA dianalisis menggunakan Western blot (Rajah 4(b)). Keadaan diabetes mencetuskan ekspresi SMA yang dikesan dari minggu keempat selepas permulaan diabetes dan seterusnya. Rawatan ALA tikus diabetes mengurangkan SMA ke tahap kawalan selepas 4 minggu tetapi tidak berkesan selepas 8 minggu. Rawatan ALA tidak memberi kesan kepada SMA dalam tikus bukan diabetes selepas 4 minggu, manakala selepas 8 minggu, ia membawa kepada peningkatan ekspresi SMA berkenaan dengan kawalan, tetapi peningkatan ini tidak signifikan secara statistik (Rajah 4(b)).

Rawatan tikus bukan diabetes dengan ALA menghasilkan kesan yang sama mengenai ciri profibrotik berbanding tikus diabetes, menunjukkan keperluan untuk mendedahkan mekanisme yang mendasari perubahan seperti fibrotik yang diperhatikan dalam buah pinggang tikus bukan diabetes yang dirawat dengan ALA. Untuk menyiasat kemungkinan pengubahsuaian epigenetik mewakili mekanisme tambahan yang terlibat dalam landskap profibrotik yang disebabkan oleh ALA yang diperhatikan dalam tikus bukan diabetes, dalam peningkatan tertentu ekspresi Col4a1, buah pinggang daripada kawalan dan tikus bukan diabetes yang dirawat ALA selanjutnya tertakluk kepada analisis status metilasi DNA. .

3.5. Kesan ALA terhadap Status Metilasi DNA.Tahap global metilasi DNA dan ekspresi gen pemain utama yang terlibat dalam metilasi DNA (Dnmt1, Dnmt3a, dan Dnmt3b) dan demetilasi (Tet1) dinilai dalam buah pinggang kawalan tanpa diabetes dan tikus yang dirawat ALA selama 4 dan 8 minggu (Rajah 5). ). Hanya tahap mRNA Tet1 menunjukkan peningkatan yang ketara secara statistik selepas 8 minggu rawatan ALA, manakala ekspresi Dnmts dan tahap global metilasi DNA tidak menunjukkan perbezaan yang ketara sama ada selepas 4 atau 8 minggu rawatan ALA berbanding dengan kawalan.

Eksperimen seterusnya diarahkan kepada pemeriksaan tahap tempatan metilasi DNA gen Col4a1. Bentuk utama kolagen IV mengandungi dua rantai 1(IV) dan satu rantai 2(IV), yang dikodkan oleh gen Col4a1 dan Col4a2 yang disusun dalam orientasi kepala ke kepala membentuk unit transkrip yang unik dan ditranskripsikan dalam arah yang berbeza dari penganjur [17]. Col4a1 ditranskripsikan daripada kawasan intergenik sepanjang 130 bp yang mengandungi dua tapak Sp1, kotak CAAT dan CTC [17](Rajah 6(a)). Status metilasi DNA promoter Col4a1/Col4a2 dinilai menggunakan analisis MSP dan kedudukan primer ditunjukkan dalam Rajah 6(a). Kedua-dua pasangan primer, khusus untuk metilasi dan untuk DNA tidak metilasi, meliputi 2 CpG setiap primer. Keputusan MSP mendedahkan bahawa ALA tidak menjejaskan status metilasi promoter Col4a1/Col4a2 selepas 4-rawatan selama seminggu (Rajah 6(b)). Walau bagaimanapun, penurunan ketara secara statistik dalam indeks metilasi DNA diperhatikan selepas 8 minggu rawatan ALA (Rajah 6(b)), mencadangkan potensi ALA untuk memodulasi ekspresi Col4a1 sepanjang perubahan pola metilasi DNA promoternya.

4. Perbincangan

Disebabkan oleh perkadaran wabak diabetes, DKD menjadi penyebab paling kerap penyakit buah pinggang peringkat akhir di seluruh dunia dan faktor yang paling menunjukkan kematian pramatang pada pesakit diabetes [28, 29]. Insiden DKD dalam pesakit diabetes tidak berkurangan dalam beberapa dekad yang lalu walaupun rawatan sengit ditujukan kepada kawalan gula darah [28, 30]. Antara strategi rawatan yang berpotensi yang telah menunjukkan faedah terhadap DKD ialah penyasaran tekanan oksidatif dan dalam istilah itu telah ditetapkan bahawa ALA boleh meningkatkan fungsi buah pinggang dalam diabetes [29, 31, 32]. Keputusan yang diperolehi dalam kajian ini mengesahkan kesan hipoglisemik ALA tetapi menunjukkan ketidakberkesanan ALA terhadap tahap urea yang terganggu dalam diabetes jangka panjang.

Peningkatan glikemia sahaja atau digabungkan dengan tekanan oksidatif adalah salah satu mekanisme yang terlibat dalam pembentukan AGE yang pengumpulannya dalam petak glomerular dan tubulointerstitial dikaitkan dengan tahap kerosakan buah pinggang dalam sistem model eksperimen nefropati diabetik [33, 34] . CML adalah salah satu AGE utama dalam vivo [35] yang tahapnya meningkat dalam peredaran dan organ termasuk buah pinggang pesakit diabetes [36], memainkan peranan penting dalam patogenesis nefropati diabetik [37]. Keputusan kami menunjukkan bahawa pemendapan CML terkumpul terutamanya dalam tubulointerstitial dan pada tahap yang lebih rendah dalam petak glomerular buah pinggang tikus diabetes yang berkurangan dengan ketara selepas rawatan ALA. Menurut data yang diterbitkan, tubul yang diperkaya dengan CML boleh menjadi petak buah pinggang yang paling cedera parah [38-40]. Dalam percanggahan dengan keputusan kami, kesan terhad ALA pada kandungan CML dalam tikus diabetes, dikesan kedua-duanya oleh immunostaining dan analisis kimia, telah diterangkan [40] dan ketidakkonsistenan ini mungkin timbul daripada reka bentuk eksperimen kajian.

Analisis histologi struktur buah pinggang oleh pewarnaan PAS mengesahkan kesan perlindungan ALA dalam diabetes. Kesan antioksida yang berfaedah ALA terhadap kecederaan oksidatif yang disebabkan oleh diabetes dalam buah pinggang telah mantap [22, 31, 32]. Rawatan dengan ALA didapati untuk mencegah kekurangan buah pinggang dan untuk mengurangkan perubahan patologi struktur buah pinggang termasuk pengembangan matriks mesangial glomerular dan glomerulosklerosis kerana gabungan potensi antioksidan dan hipoglikemiknya [21, 22]. Memandangkan glukosa tinggi, tekanan oksidatif, dan pembentukan AGEs diakui sebagai faktor penting untuk induksi perubahan profibrotik dalam buah pinggang [41], kesan antioksidan dan hipoglikemik yang mantap, dan keupayaan ALA untuk mengurangkan kandungan CML sangat menyokong untuk potensi ALA untuk mengurangkan proses fibrotik dalam buah pinggang diabetes. Walau bagaimanapun, keputusan kami mendedahkan bahawa dalam bahagian tisu buah pinggang yang diwarnai oleh Masson, tahap pemendapan gentian kolagen tidak berubah dengan ketara selepas rawatan ALA terhadap tikus diabetes. Selain itu, rawatan ALA menunjukkan kecenderungan untuk meningkatkan sintesis/- kandungan kolagen dalam tikus bukan diabetes. Selaras dengan penemuan kami, kesan buruk ALA terhadap kawalan/buah pinggang yang sihat telah dilaporkan [42]. Mengkaji mekanisme renoprotektif ALA dalam nefropati diabetik, penulis tanpa diduga mendapati bahawa rawatan dengan ALA dikaitkan dengan perkembangan glomerulosklerosis, fibrosis tubulointerstitial, dan penurunan fungsi buah pinggang dalam buah pinggang bukan diabetes. Kajian bebas mendedahkan bahawa dos ALA yang lebih tinggi mencetuskan kerosakan protein oksidatif pada tikus tua [43] dan juga penurunan fungsi buah pinggang dalam diabetes [40]. Selaras dengan ini, kesan prooksidan ALA telah dibuktikan bukan sahaja dalam kajian haiwan tetapi juga pada pesakit yang mengalami masalah buah pinggang peringkat akhir yang menerima besi intravena [44].

Dalam konteks kesan ALA yang diperhatikan pada pemendapan kolagen, keputusan kami juga menunjukkan bahawa ALA tidak mengurangkan tahap dua penanda fibrotik, TGF- 1, dan -SMA, pada tikus diabetes selepas 8 minggu dan juga menyebabkan TGF. Ekspresi - 1 dalam tikus bukan diabetes selepas 8 minggu rawatan. Selaras dengan itu, ekspresi gen kolagen jenis IV adalah lebih tinggi secara signifikan dalam pesakit diabetes dan juga dalam tikus diabetes dan bukan diabetes yang dirawat ALA berbanding dengan kawalan. Sebelum ini, telah ditunjukkan bahawa tekanan oksidatif mendorong TGF- 1 dan gen sasaran hilirannya seperti jenis kolagen I, III, dan IV, serta fibronektin [9, 45] dan anti-oksidan menindas TGF{{ 10}} ungkapan [46]. Berbeza dengan idea umum peranan pelindung dan antifibrotik antioksidan, keputusan kami menunjukkan bahawa ALA boleh mempunyai pelbagai kesan ke atas faktor yang terlibat dalam proses fibrotik dalam buah pinggang diabetes. Nampaknya ALA secara khusus mendorong ekspresi beberapa gen berkaitan fibrosis seperti TGFB1 dan terutamanya Col4a1 yang peningkatan ekspresinya telah dikesan selepas 4 minggu rawatan ALA dalam buah pinggang diabetes dan bukan diabetes. Ekspresi dipertingkatkan dan pemendapan jenis kolagen I telah diperhatikan selepas rawatan ALA dalam fibroblas kulit manusia [24]. Kajian itu mendedahkan bahawa regulasi kolagen jenis I terhasil daripada isyarat hiliran TGF-reseptor I, sekali gus mencadangkan kesan farmakologi baru ALA yang terlibat dalam penuaan kulit. Memandangkan keputusan yang dibentangkan di sini, regulasi kolagen mungkin merupakan tindak balas sel biasa kepada ALA dan bukannya ciri mekanisme khusus untuk fibroblas dermal.

Sintesis jenis kolagen IV dikawal pada tahap transkrip, pascatranskripsi dan pascatranslasi yang mantap, tetapi lebih banyak data mengenai peranan metilasi DNA dalam ekspresi Col4a1 sedang muncul. Satu kajian yang dilakukan 40 tahun yang lalu mendedahkan bahawa rawatan sel teratokarsinoma F9 dengan agen penyahmetilasi DNA 5-Azacytidine menghasilkan peningkatan ekspresi Col4a1, mencadangkan buat kali pertama bahawa metilasi DNA mungkin memainkan peranan penting dalam ekspresinya [47]. Kajian metilom manusia dan transkriptom mendedahkan korelasi metilasi promoter Col4a1 dengan ekspresinya dalam sel yang sihat dan hati diaktifkan untuk menghasilkan protein ECM [20, 48]. Perkara yang sama ditemui dalam sel mesangial di mana selepas 5-rawatan Azacytidine, paras mRNA Col4a1 meningkat dengan ketara [49]. Selain itu, pada pesakit dengan penyakit buah pinggang kronik, tahap metilasi DNA gen Col4a1 dan Col4a2 didapati jauh lebih rendah berbanding subjek yang sihat dan dalam korelasi dengan peningkatan mRNA dan ekspresi protein [50]. Keputusan kami mengesahkan bukti kukuh peraturan ekspresi Col4a1 melalui metilasi DNA kerana kami mendapati bahawa ekspresi Col4a1 berkorelasi dengan status metilasi promoternya dalam buah pinggang. Perlu diingatkan bahawa perubahan yang diperhatikan dalam status metilasi promoter Col4a1 kemungkinan besar juga mempengaruhi ekspresi Col4a2, kerana dua gen dikawal melalui rantau promoter dua arah bersama. Primer MSP yang digunakan dalam eksperimen kami direka bentuk untuk bertindih sebahagiannya dengan dua tapak pengikatan Sp1 dan penurunan dalam metilasi DNA yang kami perhatikan selepas rawatan ALA boleh mencerminkan pengikatan Sp1 yang lebih baik dan penyelarasan ekspresi Col4a1.

Penemuan kami bahawa ekspresi Col4a1 dan status metilasinya terdedah kepada tindakan ALA dalam haiwan tanpa diabetes selepas 8 minggu rawatan ALA juga mencadangkan potensi ALA untuk bertindak sebagai pengawal selia epigenetik juga. Menurut keputusan kami, ALA mempengaruhi enzim Tet1 selepas 8 minggu rawatan, ke arah peningkatan ekspresi yang menunjukkan kemungkinan bahawa demetilasi spesifik gen boleh berlaku tanpa kesan bersih yang dapat dikesan pada metilasi DNA seluruh genom. Walaupun terdapat korelasi antara peningkatan ekspresi Col4a1 dan penurunan metilasi promoternya selepas 8 minggu rawatan ALA, namun, adalah sukar untuk mempertimbangkan dengan jelas bahawa demetilasi DNA adalah satu-satunya hubungan sebab antara rawatan ALA dan peningkatan ekspresi gen kolagen telah memberikan bahawa pada 4 minggu, peningkatan ekspresi Col4a1 tidak dikaitkan dengan perubahan dalam status metilasinya. Keupayaan ALA untuk mengawal selia gen tertentu secara epigenetik telah dicadangkan untuk gen IL-1 dan IL-6 yang tahap mRNA dan protein terkawal turunnya dikaitkan dengan hipermetilasi kawasan promoternya [51, 52]. Walaupun hipermetilasi dicadangkan sebagai salah satu mekanisme tindakan ALA, laluan terperinci peraturan epigenetik yang didorong oleh ALA belum dijelaskan lagi dan menunggu untuk disahkan untuk gen lain juga. Oleh itu, hubungan antara peningkatan sintesis / pemendapan kolagen yang boleh mengakibatkan fenotip patologi dan demetilasi DNA pengantara Tet bagi promoter Col4a1 yang diprovokasi oleh rawatan ALA memerlukan pembuktian tambahan dan harus menyediakan platform untuk kajian masa depan.

5. Kesimpulan

Peranan perlindungan ALA terhadap kerosakan berkaitan diabetes pada pelbagai organ termasuk buah pinggang kebanyakannya dikaitkan dengan kesan antioksidan dan hipoglisemiknya. Walau bagaimanapun, keputusan yang dibentangkan dalam kajian ini menunjukkan bahawa perlindungan buah pinggang dalam diabetes oleh ALA mungkin terhad disebabkan oleh peningkatan sintesis / pemendapan kolagen dalam buah pinggang. Dengan menganalisis kesan ALA pada proses profibrotik dalam buah pinggang tikus diabetes, kami mendapati bahawa ALA tidak mengurangkan sama ada sintesis kolagen atau penanda profibrotik. Selain itu, rawatan dengan ALA menyumbang kepada kejadian profibrotik dan sintesis kolagen walaupun dalam buah pinggang tikus bukan diabetes yang sebahagiannya berkaitan dengan perubahan dalam status metilasi DNA gen Col4a1. Akibatnya, pada pesakit dengan fibrosis buah pinggang, berhati-hati mengenai penggunaan ALA diperlukan untuk mengelakkan keterukan komplikasi buah pinggang yang sedia ada. Selain itu, berhati-hati diperlukan apabila ALA digunakan untuk meningkatkan potensi antioksidan dalam orang yang sihat atau dalam pengurusan komplikasi diabetes yang lain kerana kesan yang menguntungkan untuk satu komplikasi boleh memudaratkan yang lain.

1Jabatan Biologi Molekul, Institut Penyelidikan Biologi "Siniša Stanković, " Institut Kebangsaan Republik Serbia, Universiti Belgrade, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrade, Serbia

2Jabatan Sitologi, Institut Penyelidikan Biologi "Siniša Stanković, " Institut Kebangsaan Republik Serbia,

Universiti Belgrade, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrade, Serbia

Surat-menyurat hendaklah dialamatkan kepada Aleksandra Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Diterima 4 November 2020; Disemak pada 19 Februari 2021; Diterima pada 27 Februari 2021; Diterbitkan pada 12 Mac 2021

Editor Akademik: Alin Ciobica

Hak Cipta © 2021 Nevena Grdović et al. Ini ialah artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah Lesen Atribusi Creative Commons, yang membenarkan penggunaan, pengedaran dan pengeluaran semula tanpa had dalam mana-mana medium dengan syarat karya asal dipetik dengan betul.

Ketersediaan Data

Semua data berkaitan yang digunakan untuk menyokong dapatan kajian ini disertakan dalam artikel.

Konflik Kepentingan

Penulis mengisytiharkan bahawa tiada percanggahan kepentingan mengenai penerbitan kertas ini.

Sumbangan Pengarang

Konsep dan reka bentuk eksperimen: MM, NG, AU; Pengendalian dan rawatan haiwan: MĐ, JAJ, AU, SD; Melakukan analisis histologi, Immunostaining, dan kuantifikasi keputusan: JAJ, MĐ, ST. Melakukan analisis Western blot: AU, SD, NG; Melakukan eksperimen RTqPCR: JR, MĐ; Melakukan eksperimen metilasi DNA: JR, AT, MV; Analisis statistik: NG; Tafsiran data dan penyediaan angka: NG, MM; Menulis kertas: NG, AU; Semakan kritikal manuskrip: MV, SD. Semua pengarang meluluskan versi terakhir untuk diterbitkan.

Ucapan terima kasih

Kerja ini disokong oleh Kementerian Pendidikan, Sains dan Pembangunan Teknologi Republik Serbia (No. Geran 451-03-9/2021-14/200007).

Bahan Tambahan

Jadual Tambahan S1: Urutan primer yang digunakan untuk analisis PCR kuantitatif masa nyata Col4a1 (rantai kolagen jenis IV alpha 1), Dnmt1 (DNA methyltransferase 1), Dnmt3a (DNA methyltransferase 3 alpha), Dnmt3b (DNA methyltransferase 3 beta), Tet1 (Tet methylcytosine dioxygenase 1) dan ekspresi gen Actb (Actin, beta). Jadual Tambahan S2: Urutan primer untuk analisis MSP metilasi DNA kawasan promoter gen Col4a1. Rajah Tambahan S1: Imej perwakilan immunoblotting. Tahap protein TGF- 1 (A) dan SMA (B), dua protein berkaitan fibrosis, dalam buah pinggang ALA yang dirawat atau tidak dirawat, tikus kawalan dan kencing manis, 4 dan 8 minggu selepas induksi diabetes, ditentukan oleh Barat analisis blot. (Bahan Tambahan)

Rujukan

[1]RC Atkins, "Epidemiologi penyakit buah pinggang kronik," Kidney International. Tambahan, jld. 67, hlm. S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho, dan B. Masala, "Strategi antioksidan dalam pengurusan neuropati diabetik," BioMed Research International, vol. 2015, ID Artikel 515042, 15 muka surat, 2015.

[3]M. Lv, Z. Chen, GY Hu, dan QB Li, "Strategi terapeutik nefropati diabetik: kemajuan terkini dan perspektif masa depan," Drug Discovery Today, vol. 20, tidak. 3, hlm. 332–346, 2015.

[4]A. Karihaloo, "Terapi anti-fibrosis dan nefropati diabetik," Laporan Diabetes Semasa, vol. 12, tidak. 4, ms 414–422, 2012.

[5]S. Yamagishi dan T. Matsui, "Produk akhir glikasi lanjutan, tekanan oksidatif, dan nefropati diabetik," Perubatan Oksidatif dan Umur Panjang Selular, vol. 3, tidak. 2, hlm. 414–108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal, dan P. Boor, "Matriks ekstraselular dalam buah pinggang: sumber biomarker bukan invasif novel fibrosis buah pinggang?," Fibrogenesis & Pembaikan Tisu, vol. 7, tidak. 1, hlm. 4, 2014.

[7]S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono,A. Casaretto, dan FN Ziyadeh, "Peranan utama sistem faktor-beta pertumbuhan yang mengubah dalam patogenesis nefropati diabetik," Renal Failure, vol. 23, hlm. 471–481, 2001.

[8]BB Hoffman, K. Sharma, Y. Zhu, dan FN Ziyadeh, "Pengaktifan transkrip bagi mengubah faktor pertumbuhan- 1 dalam kultur sel mesangial dengan kepekatan glukosa tinggi," Kidney International, vol. 54, tidak. 4, hlm. 1107–1116, 1998.

[9]M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, et al., "Kinase berkait integral mengantara faktor pertumbuhan berubah yang bergantung kepada hidrogen peroksida- 1 regulasi," Biologi & Perubatan Radikal Bebas, vol. 61, ms 416–427, 2013.

[10]K. Sharma dan TA McGowan, "TGF- dalam penyakit buah pinggang diabetik: peranan laluan isyarat novel," Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11, tidak. 1-2, hlm. 115–123, 2000.

[11]FJ Lopez-Hernandez dan JM Lopez-Novoa, "Peranan TGF- dalam penyakit buah pinggang kronik: penyepaduan kesan tiub, glomerular dan vaskular," Penyelidikan Sel dan Tisu, vol. 347, no. 1, ms 141–154, 2012.

[12]PD Yurchenco dan JJ O'Rear, "Basal lamina assembly," Pendapat Semasa dalam Biologi Sel, vol. 6, tidak. 5, hlm. 674–681, 1994.

[13]A. Nerlich dan E. Schleicher, "Penyetempatan imunohistokimia komponen matriks ekstraselular dalam lesi glomerular diabetik manusia," The American Journal of Pathology, vol. 139, no. 4, hlm. 889–899, 1991.

[14]RM Mason dan NA Wahab, "Metabolisme matriks ekstraselular dalam nefropati diabetik," Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, tidak. 5, hlm. 1358–1373, 2003.

[15]RE Gilbert, A. Cox, LL Wu et al., "Ekspresi mengubah faktor pertumbuhan-beta 1 dan kolagen jenis IV dalam tubulointerstitium buah pinggang dalam diabetes eksperimen - kesan perencatan ACE," Diabetes, vol. 47, tidak. 3, hlm. 414–422, 1998.

[16]MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita, et al., "Sintesis kolagen jenis III dan kolagen jenis IV oleh sel epitelium tiub dalam nefropati diabetik," Patologi, Penyelidikan dan Amalan, vol. 191, no. 11, hlm. 1099–1104, 1995.

[17]JP Grande, DC Melder, DL Kluge, dan ED Wieben, "Struktur penggalak kolagen IV tikus," Biochimica et Bio- Physica Acta, vol. 1309, no. 1-2, hlm. 85–88, 1996.

[18]E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti, et al., "Gangguan tapak pengikat miR-29 yang membawa kepada regulasi COL4A1 menyebabkan mikroangiopati dominan autosomal pontine dengan leukoencephalopathy," Annals of Neurology, vol. 80, tidak. 5, hlm. 741– 753, 2016.

[19]M. Griffiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk, dan E. Dimitriadis, "miR-29c overexpression dan COL4A1 downregulation dalam endometrium manusia yang tidak subur mengurangkan kapasiti pelekat sel epitelium endometrium _in vitro_ menyiratkan peranan dalam penerimaan," Laporan Saintifik, vol. 9, tidak. 1, hlm. 8644, 2019.

[20]A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner, et al., "Analisis genom metilasi DNA dan corak ekspresi gen dalam sel hati manusia yang disucikan, tidak dikultur dan sel stellate hepatik yang diaktifkan," Oncotarget, vol. 6, tidak. 29, hlm. 26729– 26745, 2015.