Pemindahan MRNA berskala besar Antara Haloxylon Ammodendron (Chenopodiaceae) Dan Holoparasit Akar Herba Cistanche Deserticola (Orobanchaceae)

Sorotan
•Sepuluh ribu mRNA pemindahan antara Haloxylon ammodendron dan parasit akarCistanche deserticola

•Analisis mobiliti dan fungsi RNA dilakukan dalam sistem cumana bunga matahari-Orobanche

•CdNLR1 dan CdNLR2 akan menyebabkan HR khusus akar dan menjejaskan keseimbangan parasit

Penanaman dan Analisis Cistanche

Ringkasan
Pertukaran mRNA ditunjukkan antara parasit perumah dan batang tetapi bukan parasit akar.Cistanche deserticola(Orobanchaceae) ialah aherba holoparasityang berparasit pada akar tumbuhan berkayu Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae). Kami menggunakan penjujukan transkriptom dan analisis bioinformatik untuk mengenal pasti hampir sepuluh ribu mRNA mudah alih. Kelimpahan transkrip nampaknya menjadi daya penggerak untuk peristiwa pemindahan dan pertukaran mRNA berlaku melalui persimpangan haustorial. Mobiliti mRNA terpilih telah disahkan in situ dan dalam sistem parasit heterologous bunga matahari-Orobanche cumana. EmpatC. deserticola→H. mRNA mudah alih ammodendron kelihatan memudahkan pembangunan haustorium. Menariknya, dua mRNA mudah alih gen rintangan putatif CdNLR1 dan CdNLR2 menyebabkan tindak balas hipersensitif khusus akar dan melambatkan pembangunan parasit, yang mungkin menyumbang kepada keseimbangan parasit. Kajian ini menyediakan bukti untuk peristiwa pemindahan mRNA berskala besar antara hos berkayu dan parasit akar, dan menunjukkan perkaitan fungsi enamC. deserticolagen dalam interaksi perumah-parasit.

Bidang mata pelajaran
Biologi tumbuhanInteraksi tumbuhan dengan organismaOmicsTranscriptomics
pengenalan
Semakin banyak bukti menunjukkan kepentingan makromolekul seperti protein dan mRNA dalam komunikasi jarak dekat dan jauh dalam tumbuhan.1 Plasmodesmata dianggap sebagai saluran pengangkutan jarak dekat, manakala sistem vaskular menjalankan pengangkutan molekul jarak jauh antara tisu distal.2 ,3 mRNA dilaporkan berpindah dalam phloem.4 Kajian terkini menunjukkan bahawa struktur gelung batang asal tRNA memberikan mRNA dengan kapasiti pengangkutan jarak jauh.5 AtRRP44A, subunit RNA exosome, dilaporkan berinteraksi dengan plasmodesmata dan untuk mengantara pemerdagangan sel ke sel mRNA KNOTTED1 (KN1).6

Tumbuhan parasit menyumbang kira-kira 1 peratus daripada tumbuhan berbunga. Ciri terpenting tumbuhan parasit ialah struktur khusus yang dipanggil haustorium, yang mewujudkan saluran sambungan fizikal dan fisiologi antara perumah dan tumbuhan parasit dan seterusnya mendominasi kebanyakan interaksi mereka.7 Tumbuhan parasit bergantung pada perumah untuk mengekalkan pertumbuhannya, menyerap air dan nutrien seperti fotosintet, asid amino dan metabolit perantaraan lain daripada perumah melalui haustorium.8 Haustoria juga berfungsi sebagai jambatan penghubung antara perumah untuk menghantar molekul isyarat seperti isyarat herbivor.9 Ia juga menunjukkan bahawa biomolekul termasuk protein dan RNA bertukar dua arah melalui sambungan hos-parasit. Contoh terawal pemindahan RNA antara perumah dan tumbuhan parasit ialah penghantaran virus RNA daripada perumah yang dijangkiti kepada tumbuhan yang tidak dijangkiti melalui dodder.10 RNA kecil (sRNA) seperti RNA gangguan kecil (siRNA) dan mikroRNA (miRNA) telah ditunjukkan untuk bergerak antara parasit perumah untuk mengawal ekspresi gen sasaran dalam organisma penerima.11,12,13 Bagi pemindahan mRNA, mRNA mudah alih daripada tomato, labu dan alfalfa perumah kepada parasit Cuscuta chinensis telah ditunjukkan untuk beberapa gen pada peringkat awal. ujian.14 Melalui analisis microarray, Roney et al. mendapati bahawa 474 mRNA telah dipindahkan dari tomato ke dodder.14 Walau bagaimanapun, pengenalan skala besar bagi pemindahan mRNA dicapai hanya pada penggunaan teknologi penjujukan generasi akan datang. Kim et al. menggunakan teknologi penjujukan transkriptom untuk mengenal pasti pemindahan mRNA berskala besar dan dwiarah antara parasit Cuscuta pentagona dan perumah seperti Arabidopsis thaliana dan tomato.15 Tetapi kaitan fungsian pemindahan mRNA dalam interaksi hos-parasit tidak jelas.

Orobanchaceae ialah keluarga angiosperma parasit terbesar di mana kebanyakannya adalah parasit akar fakultatif atau obligat.16 Cistanche ialah genus tumbuhan padang pasir holoparasit di seluruh dunia dalam Orobanchaceae. C. deserticola ialah holoparasit yang berparasit pada akar psammophyte berkayu, Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae).17 Telah ditunjukkan bahawa gen kloroplas rpoC2 telah dipindahkan daripada H. ammodendron kepada C. deserticola melalui pemindahan gen mendatar.18 Di sini, kami mengenal pasti. hampir sepuluh ribu mRNA mudah alih antara C. deserticola dan H. ammodendron melalui penjujukan transkrip dan analisis bioinformatik generasi akan datang. MRNA mudah alih telah dipastikan oleh penjajaran jujukan berbilang, pengesahan PCR, dan terutamanya penggunaan sistem parasit bunga matahari-Orobanche cumana. Fungsi mRNA mudah alih juga ditunjukkan untuk beberapa gen oleh sistem parasit heterolog ini. Sehingga kini, laporan mengenai pertukaran mRNA berfungsi antara hos dan parasit adalah sangat terhad. Oleh itu, kajian kami memberikan pandangan baharu tentang mekanisme parasit dari sudut pandangan mRNA mudah alih.

Keputusan
Pengenalpastian mRNA mudah alih antara C. deserticola dan H. ammodendron
Sambungan fizikal hos H. ammodendron akar dan parasit C. deserticola yang ketat menjadikannya mustahil untuk memisahkan mereka di haustorium. Oleh itu, kami menggabungkan penjujukan RNA throughput tinggi (RNA-seq) dan klasifikasi bioinformatik secara berperingkat untuk mengenal pasti transkrip mudah alih antara hos dan parasit. Empat set sampel berbeza telah dikumpulkan untuk analisis RNA-seq pada platform Illumina HiSeq2500. Ini termasuk tisu akar perumah bebas parasit H. ammodendron (HA), batang berairC. deserticola(CD), tisu akar hos H. ammodendron yang diparasit denganC. deserticola(HC), dan antara muka haustorial (HI). Untuk sampel HC dan CD, akar perumah dan batang parasit masing-masing dikumpulkan 1 cm daripersimpangan parasit(Rajah 1A).

Rajah 1. Analisis RNA-seq dan pengesahan RNA mudah alih

(A) Ilustrasi tisu terpilih untuk analisis RNA-seq. CD, batang berair segar C. deserticola berhampiran persimpangan haustorial; HC, akar H. ammodendron yang diserang CD; HI, antara muka haustorial. Bar skala ditunjukkan.

(B) Garis besar strategi untuk pemasangan jujukan dan pengesahan RNA mudah alih. RNA-seq, penjujukan RNA generasi akan datang. ISO-Seq, penjujukan transkriptom penuh. HA, akar H. ammodendron yang tidak berparasit. HA.FL_NR, jujukan transkriptom penuh H. ammodendron. CD.FL_NR, jujukan transkriptom penuh C. deserticola.

(C) Ramalan ORF dan pengesahan lanjut hasil pemasangan. Pencari ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) telah digunakan untuk ramalan ORF, dan unigen yang dipasang di atas dengan nilai ambang ungkapan (FPKM Lebih besar daripada atau sama dengan 0.3 ) telah disemak silang. Unigenes yang bertindih telah ditapis selanjutnya dengan dwi BLASTN (nilai E=1e−10) terhadap unigenes Cis dan HAC.

(D) Gambar rajah Venn menunjukkan set transkrip biasa dan berbeza antara sampel CD, HA dan HC.

Pengenalpastian yang boleh dipercayai bagi tisu sumber untuk transkrip tertentu daripada organisma yang berinteraksi adalah isu yang mencabar. Oleh itu Ikeue et al. telah membangunkan kaedah bioinformatik yang berguna untuk membezakan transkrip perumah dan parasit.¹⁹Di sini kami menggunakan pendekatan bioinformatik yang diubah suai yang berdasarkan kaedah mereka untuk mengenal pasti mRNA mudah alih antaraC. deserticola danH. ammodendron(Rajah 1B). Sejumlah besar 723,382,940 bacaan bersih telah dihasilkan daripada perpustakaan di atas (Jadual S2), dan bacaan ini telah dikumpulkan melalui strategi yang berbeza (Rajah 1B). Akibatnya, kesemua sepuluh sampel adalah hibrid yang dipasang kepada 222,899 unigen (disebut "Gabungan" selepas ini, Jadual S3).C. deserticoladanH. ammodendronsampel juga telah dipasang ke dalam 107, 752 dan 194, 720 unigen masing-masing (disebut "Cis" dan "HAC" selepas ini, Jadual S3). Untuk memvisualisasikan variasi serta persamaan untuk semua sampel, kami melakukan analisis komponen utama (PCA) pada nilai FPKM yang dinormalkan bagi semua gen yang dikesan dalam "Unigenes gabungan". Plot PCA menunjukkan bahawa data untuk tiga replika biologi dikelompokkan rapat dan dipisahkan dalam sampel yang berbeza, terutamanya antaraH. ammodendrondanC. deserticola(Rajah S1). Sementara itu, ramalan ORF menunjukkan bahawa 149,825 (67.23 peratus ) daripada unigen "Gabungan" diandaikan untuk mengekod protein putatif (Rajah 1C). Unigen yang dipasang secara individu dengan nilai ambang ungkapan FPKM Lebih besar daripada atau sama dengan 0.3 daripada empat sampel berbeza telah disemak silang dengan keputusan ramalan ORF (Jadual S4–S6). Analisis ini mengenal pasti bahawa 69.01-75.90 peratus daripada unigen daripada empat sampel CD, HC, HA dan HI mempunyai ORF yang diduga (Rajah 1C). Penjujukan transkriptom penuh telah dijalankan dan data, CD{17}}FL untukC. deserticoladan HA_FL untukH. ammodendron, digunakan untuk pembetulan ralat pemasangan untuk kedua-dua hosH. ammodendrondan parasitC. deserticolakerana kedua-dua spesies kekurangan data genomik (Jadual S8-S11). Apabila unigen yang diperuntukkan daripada empat sampel di atas ditapis dengan dwi BLASTN (nilai E=1e⁻¹⁰) terhadap Cis, HAC, CD_FL dan HA_FL, 94.78–99.00 peratus daripadanya mempunyai jujukan konsensus yang boleh dipercayai (Rajah 1C dan Jadual S7). Berdasarkan analisis di atas, 17, 379 (HA-eksklusif 14, 810 dan HA-mengandungi 2, 569) unigen biasa akhirnya diperolehi daripada HC dan CD pada analisis rajah Venn bagi unigen daripada CD, HC dan HA (Rajah 1D). Di antara mereka, bekas 14,810 unigen kemungkinan besar berasal dari CD parasit kerana ketiadaannya dalam HA, tetapi sebahagian daripadanya mungkin juga mewakili mRNA mudah alih HC→CD yang hanya terdapat dalam HC tetapi tidak dalam HA kerana pengawalseliaan mereka. pada lampiran parasit. 2, 569 unigen yang terakhir mungkin mewakili mRNA pemindahan HC→ CD satu arah kerana ia juga terdapat dalam HA. Unigenes lain dikecualikan daripada mRNA mudah alih calon kerana ia tidak dikongsi antara HC dan CD. Kita juga harus ambil perhatian bahawa 14,810 unigen biasa dalam [HC, CD] mengatasi 166 unigen biasa dalam [HA, CD] sebanyak 89 kali, sangat menunjukkan kebolehpercayaan analisis kami kerana yang terakhir adalah secara logiknya mustahil dan disebabkan oleh ralat yang tidak dapat dielakkan daripada unigene pemasangan atau analisis bioinformatik (Rajah 1D).

Asal-usul mRNA mudah alih yang diduga telah disahkan lagi melalui analisis dwi BLAST untuk menetapkan asal urutan mereka (Rajah 1B dan Jadual S12). Oleh kerana kekurangan data genom untuk hos dan parasit, kami menggunakan data jujukan yang tersedia untuk organisma keluarga Chenopodiaceae dan Orobanchaceae yangH. ammodendrondanC. deserticolamilik masing-masing. Hipotesis kami ialah mRNA mudah alih daripadaH. ammodendronkemungkinan besar mempunyai homologi yang lebih tinggi dengan ortolognya daripada spesies Chenopodiaceae yang lain daripada spesies Orobanchaceae, manakala sebaliknya bagi mRNA mudah alih bagiC. deserticolaasal, dan ortolog yang dipelihara mungkin mempunyai persamaan yang tinggi dengan kedua-dua Orobanchaceae dan Chenopodiaceae. Analisis ini boleh membantu kami untuk memastikan asal usul mRNA mudah alih kerana ia boleh ditugaskan ke peringkat keluarga melalui carian homologi. Untuk membuktikan hipotesis kami, pokok filogenetik daripada tiga puluh tujuh spesies, termasuk enam Orobanchaceae dan empat spesies Chenopodiaceae, telah dibina menggunakan OrthoFinder. Jarak evolusi yang jauh antara spesies Orobanchaceae dan Chenopodiaceae memastikan kebolehpercayaan hipotesis kami (Rajah 2A dan Jadual S13). Analisis kehilangan gen menunjukkan bahawa transkrip untuk banyak ortokumpulan dan gen berkaitan fotosintesis tidak terdapat dalamC. deserticola(Rajah 2B dan 2C, Jadual S14, Data S2 dan S3). Selain itu, analisis rajah Venn antaraC. deserticoladan tiga tumbuhan parasit berjujukan lain juga menunjukkan bahawa 53.84 peratus (926/1,720) daripada kumpulan orto yang hilang dalamC. deserticolajuga tidak terdapat dalam tiga tumbuhan parasit lain, iaitu 50.81 peratus (755/1486), 48.09 peratus (377/784) dan 50.00 peratus (260/520) dalamC. australis, Striga asiaticadanPhtheirospermum japonicummasing-masing (Rajah S2). Keputusan ini bukan sahaja menunjukkan sifat parasit spesies ini tetapi juga kebolehpercayaan pemasangan unigene daripada analisis kami, dan juga menyokong hipotesis kami untuk menggunakan spesies tumbuhan relatif untuk pengesahan asal jujukan. Oleh itu, unigen pemindahan calon daripada analisis di atas dipisahkan dengan dwi BLASTN (nilai E=1e⁻¹⁰) terhadap koleksi set data jujukan tersedia awam daripada Orobanchaceae (transkriptom daripadaTriphysaria versicolor, Striga hermonthica dan Pelipanche aegyptiaca; Urutan EST dan mRNA dari NCBI) dan Chenopodiaceae (transkriptom generasi seterusnya dan panjang penuhH. ammodendron; Urutan EST dan mRNA daripada NCBI) (Rajah 1B dan Jadual S12). Akibatnya, 7,496 unigen telah disahkan berasal dari parasitC. deserticola, menyumbang 9.66 peratus (7,496/77,615) dan 13.70 peratus (7,496/54,721) daripada unigen dalam sampel HC destinasi dan CD sumber; dan 2,370 unigen telah ditugaskan untuk menjadi tuan rumahH. ammodendron, menyumbang 3.38 peratus (2,370/70,119) dan 4.15 peratus (2,370/57,091) daripada unigen dalam sampel HC sumber dan CD destinasi (Rajah 2D dan 2E, Jadual S7, S12, dan S15). 2,931 unigen biasa adalah terlalu homolog untuk diberikan kepada organisma sumber yang tepat. Keputusan ini menunjukkan bahawa hampir sepuluh ribu (7,496 tambah 2,370 = 9,866) unigen boleh dipindahkan antara tumbuhan parasit akarC. deserticoladan perumah tumbuhan berkayuH. ammodendron. Lebih banyak lagi (7,496/2,370 = 3.16-lipatan) RNA mudah alih adalah parasitC. deserticolaasal daripada tuan rumahH. ammodendronasal, menunjukkan bias pemindahan mRNA dalam parasit → arah hos.

Rajah 2. Analisis kehilangan gen dan pengesahan lanjut RNA mudah alih melalui penjajaran berbilang

(A) Filogeni genom tumbuhan berbunga. OrthoFinder digunakan untuk menganalisis evolusi semua jujukan protein 37 spesies, dan untuk mencari kumpulan ortogon termasuk gen homolog langsung dan gen homolog cagaran di kalangan spesies.

(B) Peratusan kehilangan ortokumpulan. Bilangan penghapusan ortokumpulan dalam tumbuhan separa parasit dan jumlah tumbuhan parasit.

(C) Peratusan unigen yang hilang. Perkadaran gen yang berkaitan dengan fotosintesis dan metabolisme ditunjukkan.

(D) Gambar rajah Venn menunjukkan set transkrip biasa dan berbeza antara sampel CD dan HC pada pelbagai penjajaran. CD{0}}trans, CD→HC RNA mudah alih. HC_trans, HC→CD RNA mudah alih.

(E) Carta pai menunjukkan perkadaran bacaan mudah alih yang dipetakan kepada transkriptom CD (bulatan luar) dan HC (bulatan dalam).