Lactobacillus Plantarum GKM3 Menggalakkan Umur Panjang, Pengekalan Memori dan Mengurangkan Tekanan Pengoksidaan Otak dalam SAMP8 Tikus Bahagian 1

Abstrak: (1) Latar Belakang: Kemerosotan kognitif yang berkaitan dengan usia lazimnya menjejaskan kehidupan warga tua dengan gejala yang terlibat dalam kemerosotan ingatan dan pembelajaran secara progresif. Telah dicadangkan bahawa probiotik boleh memodulasi gangguan neurologi berkaitan usia melalui paksi usus-otak. (2) Kaedah: Untuk menyiasat kesan anti-penuaan probiotik Lactobacillus plantarum GKM3, kedua-dua ujian survival dan eksperimen kognitif telah dijalankan dalam model tikus SAMP8. SAMP8 yang berumur enam bulan (n{{10}} dalam setiap jantina) diberi makan dengan probiotik GKM3 pada dos 5.1 × 109 dan 1.0 × 109 cfu/ kg BW/hari sehingga kematian semulajadi mereka. Kemudian, jangka hayat disiasat. SAMP8 yang berumur tiga bulan (n=10 dalam setiap jantina) telah diberikan GKM3 selama 14 minggu. Kemudian, ujian tingkah laku dan parameter pengoksidaan direkodkan. (3) Keputusan: Kumpulan GKM3 menunjukkan peningkatan kependaman yang ketara dalam ujian pengelakan pasif dan masa pengelakkan yang berjaya dalam ujian pengelakan aktif. TBARS dan 8-OHdG daripada otak tikus juga menunjukkan pengurangan ketara dalam kumpulan yang dirawat dengan GKM3. Di samping itu, pengumpulan protein amiloid yang lebih rendah didapati dalam otak tikus SAMP8 dengan tambahan GKM3. (4) Kesimpulan: Keputusan ini menunjukkan bahawa L. plantarum GKM3 melambatkan proses penuaan, mengurangkan kemerosotan kognitif yang berkaitan dengan usia, dan mengurangkan tekanan oksidatif.

Klik pada Suplemen Cistanche Tubulosa

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kata kunci: terdedah kepada tetikus dipercepatkan penuaan 8 (SAMP8); probiotik; 8-hidroksi-20 -deoksiguanosin (8-OHdG); bahan asid-reaktif tiobarbiturik (TBARS); amiloid- (A ); penuaan

1. Pengenalan

Telah menjadi isu bahawa gangguan kognitif yang dialami oleh populasi telah menjadi lebih besar berikutan pertumbuhan jumlah individu yang lebih tua dalam dekad yang lalu [1]. Menurut laporan daripada Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO), bilangan orang yang mengalami kemerosotan kognitif, iaitu lebih daripada 46.8 juta pada tahun 2015, akan mencapai lebih 74.7 juta pada tahun 2030, yang hampir meningkat separuh dalam tempoh lima belas tahun [2] . Penuaan, yang diiktiraf sebagai korelasi yang kuat dengan kemerosotan kognitif, umumnya dianggap dikaitkan dengan tekanan oksidatif, yang terlibat dalam pengumpulan radikal bebas dan menggalakkan banyak disfungsi fisiologi, terutamanya di otak, organ sensitif oksigen, yang membawa kepada degeneratif. gejala seperti kehilangan ingatan dan penurunan keupayaan pembelajaran [3-5].

Memandangkan penuaan tidak dapat dielakkan dan gejala negatif relatifnya adalah rumit, orang ramai meneruskan rawatan untuk anti-penuaan, dari terapi diet kepada lebih daripada rawatan dadah [6,7]. Sebagai contoh, ekstrak akar ginseng (Panax quinquefolius) menunjukkan fungsi kognitif yang lebih baik dan ditandakan sebagai kegemaran oleh orang Korea [8]. Ekstrak ginkgo biloba, contoh lain, disukai oleh orang Jepun kerana fungsinya dalam peningkatan kognitif dan pengurangan pengoksidaan [9]. Walaupun banyak laporan telah mencadangkan bahawa diet berasaskan tumbuhan memberikan kesan antioksidan dan melambatkan proses penuaan, terdapat tumpuan yang lebih menarik pada mikrobiota usus atau bahkan pada sekumpulan bakteria tertentu dalam usus yang boleh memetabolismekan nutraseutikal ini dan memberikan modulasi berbilang positif. kesan kepada tuan rumah, termasuk umur panjang [10–14]. Bakteria usus boleh menghasilkan asid lemak rantai pendek (SCFA) seperti asetat, propionat, atau butirat daripada diet seseorang [15]. Kanak-kanak yang mengambil pemakanan enteral berasaskan tumbuhan menunjukkan SCFA yang lebih tinggi daripada kanak-kanak biasa dalam sampel najis mereka [16]. SCFA ini boleh memainkan peranan penting dalam epitelium gastrousus manusia [17]. Asetat boleh melintasi penghalang darah-otak, mendorong pengaktifan hypothalamic-neuronal [18]. Di samping itu, butyrate telah dikaji mengenai kesan menekan keradangan kolon dalam usus manusia [19]. Oleh itu, adalah penting apa jenis mikrobiota atau bakteria tertentu dalam usus manusia, terutamanya dari segi mempengaruhi kesihatan badan dan umur panjang [20,21].

Mikrobiota usus juga boleh memberi kesan kepada paksi usus-otak dan melambatkan proses penuaan, dengan itu menghalang perkembangan penyakit berkaitan usia seperti amnesia, demensia, atau penyakit Alzheimer [22,23]. Asid gamma-aminobutyric neurotransmiter (GABA), sebagai contoh, boleh dihasilkan oleh strain bakteria tertentu yang telah dilaporkan dengan percambahan sel stem epitelium dalam usus dan peningkatan tingkah laku seperti kemurungan pada tikus [24,25]. Dengan data sokongan semasa, penambahan probiotik sebagai kaedah pencegahan telah menjadi trend untuk gangguan neurologi berkaitan usia ini [26,27].

Lactobacillus adalah probiotik yang paling biasa yang menunjukkan kemungkinan tinggi untuk membangunkan makanan berfungsi kerana ia telah wujud dalam makanan manusia untuk masa yang lama [28]. Walau bagaimanapun, spesies bakteria individu mempunyai bioaktiviti unik, dari ketegangan ke ketegangan, yang memerlukan pengesahan eksperimen. Dalam kajian terdahulu kami, kami mengasingkan strain probiotik Lactobacillus plantarum GKM3 daripada daun jeruk (Brassica juncea), yang juga dikenali sebagai sayuran panjang umur dalam masyarakat Hakka Taiwan, dan menjalankan kajian berfungsi untuk meningkatkan saluran gastrousus dan imuniti dalam vivo [29-31] . Oleh itu, kami menjangkakan kemungkinan L. plantarum GKM3 mengurangkan proses penuaan dan kemerosotan kognitif yang berkaitan dengan usia.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Mata pelajaran

L. plantarum GKM3 telah diasingkan daripada mustard Cina (Brassica juncea) dan dipelihara di Pusat Pengumpulan dan Penyelidikan Sumber Bio, Taiwan (BCRC), dengan nombor koleksi 910787. Pertama, GKM3 dibiakkan dengan sup MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) pada suhu 37 ◦C selama 18 jam dalam tabung uji. Dengan {{10}}.01 peratus inokulasi, kultur benih GKM3 ditingkatkan dalam 50 L penapai di bawah kawalan pH 6.0 pada 37 ◦C selama 18 jam dengan medium yang direka (5 peratus glukosa, 2 peratus ekstrak yis, 0.05 peratus MgSO4, 0.1 peratus K2HPO4, dan 0.1 peratus Tween 80). Kemudian, bakteria yang ditapai dituai dengan sentrifugasi pada 3800 rpm selama 10 minit, dibasuh dengan penimbal garam fosfat dua kali, dan pelet dicampur dengan susu 10 peratus untuk liofilisasi. Dos serbuk kering beku L. plantarum GKM3 dalam kajian ini telah diselaraskan kepada 5.1 × 109 cfu/kg BW/hari sebagai dos tinggi dan 1.0 × 109 cfu/kg BW/hari sebagai dos rendah untuk model tetikus secara gavage .

Tikus terdedah P8 (SAMP8) yang dipercepatkan penuaan telah diperkenalkan dalam kajian ini sebagai model haiwan yang semakin tua. Semua tikus SAMP8 digunakan dan disimpan pada 12 jam kitaran gelap/cahaya di bawah 25 ± 2 ◦C, 65 ± 5 peratus RH dengan makanan dan air secara ad libitum. Prosedur percubaan berikut telah diluluskan oleh Jawatankuasa Pengurusan Haiwan Jabatan Makanan dan Pemakanan, Providence University (Taichung City, Taiwan), dengan nombor IACUC 20170629-A02.

2.2. Ujian Kelangsungan Hidup

Dalam ujian survival, tikus SAMP8 berusia enam bulan telah dikumpulkan dengan 20 betina dan 20 jantan seperti berikut: kawalan, kumpulan dos tinggi GKM3, dan kumpulan dos rendah GKM3. Probiotik L. plantarum GKM3 dibekalkan setiap hari kepada tikus rawatan sehingga mereka mencapai kematian semulajadi. Tikus SAMP8 hidup / mati dalam setiap kumpulan telah direkodkan dan jangka hayat purata dikira.

2.3. Reka Bentuk Eksperimen untuk Kemerosotan Kognitif Berkaitan Umur

Tikus SAMP8 berusia tiga bulan telah ditempatkan untuk eksperimen gangguan kognitif. Kedua-dua tikus SAMP8 lelaki dan betina dikumpulkan seperti berikut (n=10 dalam setiap jantina): kumpulan kawalan, kumpulan dos tinggi GKM3 dan kumpulan dos rendah GKM3. Tikus dalam kumpulan rawatan diberi L. plantarum GKM3 secara lisan selama 14 minggu. Aktiviti pergerakan telah dijalankan pada minggu ke-11 eksperimen. Ujian pengelakan pasif dan ujian pengelakan aktif masing-masing dijalankan pada minggu ke-13 dan ke-14, dan kemudian tikus dikorbankan untuk analisis biokimia dan pemeriksaan histologi.

2.4. Aktiviti Pergerakan

Setiap tetikus diletakkan di tengah-tengah sangkar ulang-alik (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA) dan pergerakannya direkodkan oleh penganalisis laluan video monitor aktiviti selama 10 min. Purata masa pergerakan tetikus dianalisis setiap 5 minit (s/5 min). Perarakan ini dijalankan dalam keadaan cahaya malap dan senyap.

2.5. Ujian Pengelakan Pasif

Sebuah sangkar ulang-alik (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) telah dipisahkan menjadi bilik gelap dan terang. Terdapat pintu guillotine (7.5 cm × 6.5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA) di antara dua bilik itu. Dalam ujian latihan untuk ujian pengelakan pasif, seekor tetikus diletakkan di dalam bilik cahaya untuk penyesuaian minit dan kemudian pintu guillotine dibuka. Tetikus akan menerima 0.5 µRenjatan elektrik selama 0.5 s apabila ia memasuki bilik gelap. Kejutan berterusan berlaku tiga kali setiap lima saat. Tetikus telah diganti di bawah operasi yang sama pada 24 jam, 48 jam, dan 72 jam selepas sesi latihan untuk ujian ingatan, kecuali tiada kejutan dihantar. Masa purata tikus yang tinggal di bilik cahaya diukur. Masa pemotongan atas 180s telah ditetapkan.

2.6. Ujian Pengelakan Aktif

Dalam ujian latihan untuk ujian pengelakan aktif, tetikus akan menerima rangsangan terkondisi (CS) 10 berdasarkan cahaya dan bunyi, dan kemudian 5 saat kejutan elektrik 0.3 mA (rangsangan tanpa syarat, UCS) jika tetikus tinggal di dalam bilik yang sama, manakala, tiada penerimaan kejutan jika tetikus berpindah ke bilik lain. Setiap tetikus telah dilatih untuk 5 kitaran CS dan UCS. Tetikus telah diuji di bawah operasi yang sama (sistem CS/UCS) dengan selang percubaan 15-20 minit empat kali sehari dan diuji secara berterusan selama empat hari. Purata masa mengelak diukur sebagai kesan ingatan pembelajaran.

2.7. Analisis Tekanan Oksidatif

Untuk pengesanan 8-hidroksi-20 -deoxyguanosine (8-OHdG) daripada DNA mitokondria otak, 30 mg tisu otak telah diekstrak oleh Sistem Miniprep Pengekstrakan DNA Genom Darah & Tisu (Viogene Biotek Corp., Taipei, Taiwan) dan 8-OHdG Check ELISA Kit (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Jepun) yang sangat sensitif telah digunakan dengan penyerapan pada 450 nm. Untuk analisis bahan tindak balas asid thiobarbituric (TBARS), 25 mg tisu otak dikisar dengan penimbal 250 µL RIPA dan disentrifugasi pada 16,000 × g selama 10 minit di bawah 4 ◦C. Secara keseluruhan, 100 µL supernatan dikumpul dan ditambah dengan 100 µL larutan SDS dan 4 mL reagen warna, kemudian direbus selama sejam sebelum rawatan penyejukan. Sampel yang dirawat telah disentrifugasi pada 16,000x g selama 10 minit dan diletakkan selama 30 minit pada suhu bilik. Kandungan TBARS (protein mM/g) daripada setiap sampel 150 µL diukur pada penyerapan 535 nm dengan lengkung piawai.

2.8. Pengukuran Amyloid- Protein Otak

Protein amiloid- (A) dari bahagian tisu otak telah diwarnai dengan kaedah imunohistokimia. Peratusan pengumpulan A dianalisis oleh sistem imej (Leica, Q500, Wetzlar, Jerman) dengan mikroskop di bawah medan 40×. Pengiraan adalah berdasarkan peratusan kawasan pengumpulan A dalam semua otak: ( -kawasan pemendapan amiloid/seluruh kawasan otak) × 100 peratus .

2.9. Histologi

Otak telah dipotong dan diperbaiki dengan 10 peratus formalin. Tisu hippocampal telah diproses melalui proses dehidrasi, pembersihan, penyusupan, dan pembenaman untuk keratan. Kemudian, tisu kawasan hippocampus diperiksa dengan pewarnaan Hematoxylin dan Eosin (H&E).

2.10. Statistik

Bangku statistik SPSS 19.0 telah digunakan dalam kajian ini. Semua data dinyatakan sebagai min ± SEM dan dinilai dengan ANOVA sehala untuk perbandingan min antara kumpulan yang berbeza. Perbezaan ketara telah dipertimbangkan apabila nilai p kurang daripada 0.05 oleh ujian julat berbilang Duncan. Dalam ujian survival, ujian Kaplan-Meier digunakan untuk analisis dan ujian peringkat log dijalankan untuk mengesahkan perbezaan antara kumpulan.

3. Keputusan

3.1. Kesan L. plantarum GKM3 terhadap Ujian Kemandirian SAMP8

Dalam eksperimen kelangsungan hidup, jangka hayat tikus SAMP8 diperhatikan sehingga kematian semula jadi mereka dan mengambil masa 21 bulan untuk melengkapkan semua rekod individu. Purata jangka hayat tikus SAMP8 jantan yang tidak dirawat ialah 11.90 ± {{10}}.18 bulan dan untuk betina ialah 11.20 ± 0.21 bulan. Dalam kumpulan pemakanan GKM3 probiotik, jangka hayat purata lelaki dilanjutkan kepada 12.05 ± 0.15 bulan dan 13.50 ± 0.14 bulan dalam dos rendah dan tinggi rawatan GKM3, masing-masing. Kesan bergantung kepada dos probiotik GKM3 pada lanjutan jangka hayat pada wanita juga boleh diperhatikan dengan 12.15 ± 0.21 bulan dalam kumpulan dos rendah dan dengan 14.30 ± 0.17 bulan dalam rawatan dos tinggi (data tidak ditunjukkan).

Untuk meringkaskan jangka hayat, kadar kelangsungan hidup dianggarkan. Dengan kadar survival 50 peratus, dos rendah GKM3 dalam kumpulan lelaki ialah 12.67 bulan dan dos tinggi kumpulan lelaki GKM3 ialah 13.33 bulan, manakala kumpulan kawalan lelaki hanya menunjukkan 12.50 bulan (Rajah 1A). Sama seperti pemerhatian pada tikus SAMP8 betina, 12.00 bulan dan 15.50 bulan dengan kadar survival 50 peratus ditunjukkan dalam kumpulan yang diberi probiotik GKM3 pada dos 1.0 × 109 CFU/kg BW/hari dan 5.1 × 109 CFU/kg BW/hari, masing-masing; walau bagaimanapun, 10.50 bulan dengan kadar survival 50 peratus diperhatikan dalam kumpulan kawalan wanita (Rajah 1B). Tikus SAMP8 betina mempersembahkan jangka hayat yang lebih pendek daripada jantan sebagai asas dalam eksperimen ini; menariknya, kesan L. plantarum GKM3 dari segi jangka hayat memberi kesan yang lebih besar kepada wanita. Adalah dicadangkan bahawa L. plantarum GKM3 boleh meningkatkan umur panjang dalam tikus SAMP8 kedua-dua jantina, terutamanya dalam spesies betina.

3.2. Berat Badan, Pengambilan Makanan dan Pengambilan Air dalam Tikus SAMP8

Dalam eksperimen mengenai kemerosotan kognitif yang berkaitan dengan usia, tidak terdapat perbezaan ketara dalam penggunaan tenaga dan perubahan berat di kalangan semua tikus SAMP8 kumpulan rawatan yang berbeza sebelum pengorbanan (Jadual 1). Ini bermakna probiotik GKM3 tidak menjejaskan parameter metabolik ini dalam model tetikus tua.

3.3. Kesan L. plantarum GKM3 terhadap Pengekalan Memori dan Peningkatan Pembelajaran

Ujian aktiviti pergerakan menunjukkan bahawa tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara semua tikus SAMP8 dalam selang 5-min pertama, tanpa mengira jantina (Jadual 2). Walaupun terdapat penurunan dalam selang 5-min kedua, jika dibandingkan dengan selang 5-min pertama, tiada perubahan ketara antara kumpulan yang dirawat dan tidak dirawat.

Ujian pengelakan pasif dilakukan pada kumpulan lelaki dan perempuan tikus SAMP8 (Rajah 2). Tiada perbezaan yang ketara antara semua kumpulan semasa ujian percubaan (p > 0.05). Kependaman tikus jantan SAMP8 yang diberi probiotik GKM3 meningkat dengan ketara berbanding kumpulan kawalan pada hari pertama (p < 0.05) (Rajah 2A). Masa tikus SAMP8 betina tinggal di dalam bilik cahaya juga meningkat pada hari pertama dalam rawatan GKM3, dengan nilai p kurang daripada 0.05 dalam kumpulan dos rendah dan nilai p kurang daripada 0.01 dalam tinggi. -kumpulan dos jika dibandingkan dengan kawalan. Walau bagaimanapun, tiada perbezaan yang ketara selepas hari kedua ujian pengelakan pasif. Latensi yang lebih lama dilakukan dalam kumpulan pemakanan GKM3, kedua-dua tikus SAMP8 lelaki dan perempuan, menunjukkan bahawa probiotik GKM3 boleh menyumbang kepada pengekalan ingatan dan peningkatan pembelajaran yang berkaitan dengan usia.

Dalam prosedur pengelakan aktif, tikus dikehendaki mengambil sebarang tindakan untuk mengelakkan rangsangan berbahaya. Pada hari percubaan ujian pengelakan aktif, kedua-dua tikus SAMP8 jantan dan betina yang diberi makan dengan GKM3 menunjukkan kecenderungan kejayaan yang lebih tinggi dalam pengelakan (Rajah 3) tetapi tidak mencapai perbezaan statistik (p > 0.{{ 9}}5) jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan. Walau bagaimanapun, keputusan pada hari pertama dan dua ujian pengelakan aktif menunjukkan bahawa masa yang berjaya meningkat dengan ketara dalam kumpulan lelaki dengan GKM3 yang diberi makan jika dibandingkan dengan tikus SAMP8 jantan yang tidak dirawat (Rajah 3A) (p <0.05). Keputusan yang sama juga diperhatikan dalam kumpulan wanita (Rajah 3B). Menariknya, tiada perbezaan statistik (p=0.157) pada keputusan hari keempat antara kumpulan kawalan dan probiotik. Ini bermakna tikus kawalan memerlukan latihan selama empat hari untuk mengejar kehadiran tikus yang diberi makan probiotik. Adalah dicadangkan bahawa penambahan probiotik GKM3 ke dalam diet boleh membantu kognisi hos yang memberi kesan kepada tingkah laku yang sesuai dalam kedua-dua jantina.

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】